오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양에서 푸르킨제 세포 생존

요약

Organotypic 슬라이스 문화는 신경 발달 또는 퇴행성 / 재생 과정을 연구할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서, 우리는 마우스 소뇌 슬라이스 배양에서 Purkinje 세포의 신경 발달 죽음을 모델로 하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 신경 보호 약물 발견에 대 한 연구 혜택을 받을 수 있습니다.

초록

Organotypic 슬라이스 배양은 분리된 1차 세포 배양보다 생체 내 상태를 더 가깝게 모방하는 강력한 시험관 내 모델입니다. 초기 출생 후 발달에서, 소뇌 Purkinje 세포는 그(것)들이 프로그램한 세포 죽음을 겪는 동안 취약한 기간을 통과하는 것을 알려지고 있습니다. 여기서, 우리는 이 중요한 시간 동안 마우스 organotnotypic 소뇌 슬라이스 배양을 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 슬라이스는 Purkinje 세포 생존및 신경 보호 처리의 효험을 평가하기 위하여 추가 표지됩니다. 이 방법은 새로운 신경 활성 분자를 선별하는 데 매우 유용 할 수 있습니다.

서문

생체 외 모델링은 생물 의학 연구에 필수적인 도구입니다. 그것은 조사자가 공부하고 제한한 세포 모형에 있는 특정 기계장치를 단단히 통제할 수 있습니다, 또는 고립된 시스템/기관에서. 오르가노티픽 슬라이스 배양은 특히 신경과학 분야에서 시험관내 기술로 널리 사용되고^{있다 1.} 이 방법은 먼저 롤러 튜브 기술^2를사용하여 뇌 조각을 배양한 Gähwiler에 의해 처음 확립되었으며, 나중에 야마모토 등에서 수정되었으며, 이들은 피질 슬라이스 배양을 수행하기 위해 미세 다공성 멤브레인의 사용을^{도입했습니다 3.} 1 차적인 세포 배양에 비해, organotypic 슬라이스 배양은 조직의 세포 아키텍처를 보존하는 이점을 제시, 조직 섹션의 평면에서 뿐만 아니라 네이티브 세포 세포 연결.

Organotypic 조각은 해마^4,피질^5,줄무늬^6,소뇌^4,7,척수^8,9,다른 사람의 사이에서 와 같은 중추 신경계의 많은 부분에서 배양되었습니다. 그들은 약물 발견 연구에서 강력한 도구로 입증되었습니다¹⁰. 신경 활성 분자의 효과 여러 가지 방법으로 평가 될 수 있다: 면역 염색 및 생화학 분석, 신경 회로 형성, 또는 전기 생리학 및 라이브 이미징을 사용 하 여 중단을 사용 하 여 생존 및 신경 변성.

이 작업의 목적은 시험관에서 소뇌 발달을 모방하는 관련 모델로 알려져 있는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화를 수행하는 간단한 방법을 설명하는 것입니다. 특히, 우리는 Purkinje 세포 발달 죽음의 연구 결과에 집중했습니다. 생체 내에서, Purkinje 세포는 출생 후 첫 번째 주 동안 세포 자멸을 겪고, 출생 후 일 3 (P3)^11에피크. 소뇌 슬라이스 배양에서 동일한 패턴이 관찰되며, 세레베야가 P1과 P8 사이의 동물로부터 채취될 때, P3^4,12에서피크를 가진 후발성 세포사멸에 의해 죽어가는 Purkinje 뉴런과 함께 관찰된다. organotypic 소뇌 슬라이스 배양의 사용은 여러 신경 보호^분자를식별 할 수 있다^7,13,뿐만 아니라 이 프로그램 된 세포 사멸에 관련된 메커니즘의 일부를 이해^14,15,16. 여기서, 우리는 해마에서 Stoppini et al.^17의 연구에 기초한 프로토콜을 설명하고, Dusart et al.^4에 의해 소뇌에 적응하여 산후 뇌의 급속한 해부 및 절단을 포함한다; 미세다공막을 함유하는 세포 배양 삽입체상에 배양물을 슬라이스하는 경우, 신경보호 치료 유무에 관계없이; 및 면역 형광 염색신경 생존을 평가하기 위해.

프로토콜

동물과 관련된 모든 실험은 노스웨스턴 대학 동물 연구 위원회에 따라 수행되었다.

1. 오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양 전 준비

1. 사전에 70% 에탄올로 분무된 세포 배양 후드에서 멸균 병 수신기에 부착된 250 mL 병 상판 진공 필터에 배양 배지 200 mL를 준비합니다. 기저 중간 이글 100 mL(BME), 행크스 균형 소금 용액 50 mL(HBSS), 50 mL의 열 불활성화 말 세럼, 200 mM L-글루타민 1mL(최종 농도 1mM), 5 mL 의 200 g/L 글루코스(최종 농도 5 mg/mL)를 추가합니다. 배양 배지를 진공 걸이하고 최대 한 달 동안 +4 °C로 유지하십시오.
2. 멸균 된 생물 안전 성 캐비닛에서 패키지에서 6 웰 배양 플레이트를 꺼내십시오. 배양 배지 1 mL로 각 우물을 채웁니다. 치료가 시험되는 경우, 약리학 적 제제를 잘 처리하고, 대조군을 위한 동일한 부피의 비컨티컬 용액을 잘 첨가한다. 본 연구에서, 우리는 잘 처리 된 잘 (30 mM 최종) 및 제어 웰에 멸균 수의 1 μL 3 M KCl 용액을 추가했다.
3. 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인(공극 크기 = 0.4 μm)을 가진 개별적으로 래핑된 세포 배양 삽입물의 필요한 수의 세포 배양 후드 내부를 가져온다. 조심스럽게 포장을 풀고 멸균 집게로 세포 배양 삽입을 꺼내십시오. 삽입 막과 세포 배양 배지 사이의 계면에서 기포를 피하면서 6 웰 플레이트의 우물에 하나씩 떨어 뜨립니다. 인서트가 배양 전 적어도 2시간 동안 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 배지에서 평형을 지게 한다.
   참고: 조직 헬기는 세포 배양 후드에 영구적으로 존재합니다.
4. 200 mL 비커 2개, 하나는 150 mL 멸균수로 채워지고 다른 하나는 150 mL 70% 에탄올로 채워져 있습니다. 수술 도구를 70% 에탄올 목욕에 담근 다음 사용하기 전에 물에 담급강하십시오.
   참고: 에탄올과 접촉 한 직후 수술 도구를 사용하지 마십시오.
5. 70% 에탄올 비커에 양날 블레이드를 소독합니다. 멸균 집게를 사용하여 블레이드 홀더에 놓고 블레이드 클램프 렌치를 사용하여 제자리에 고정시면 됩니다. 사용할 때까지 말려 주세요.
6. 70% 에탄올 비커에 티슈 헬기와 함께 제공된 플라스틱 디스크를 소독합니다. 디스크를 놓기 전에 70% 에탄올로 절단 테이블에 스프레이하십시오. 사용할 때까지 말리십시오.

2. 해부 및 소뇌 오르가노티픽 슬라이스 배양

1. 마우스 새끼를 세포 배양 후드 내부에 가져와 해부를 수행한다.
2. 직선 작동 가위를 사용하여 신속하게 강아지를 참수(그림 1A).
3. 직선 드레싱 집게와 코에 의해 강아지의 머리를 잡고있는 동안, 직선 눈 가위를 사용하여 두피를 잘라, 후방 끝에서 시작, 중간 선에 측면으로 이동.
4. 두개골에 대해 동일하게 진행합니다.
   참고: 해부 중에 소뇌가 손상되지 않도록 가위 끝을 바깥쪽으로 가리십시오.
5. 뇌를 꺼내서 차가운 HBSS + 5 mg /mL 포도당으로 채워진 60mm 접시로 옮김하십시오.
6. 멸균 스트레이트 미세 집게를 사용하여 소뇌를 조심스럽게 해부하십시오(그림 1B). 멸균 곡선 미세 집게를 사용하여 조직 헬기의 절단 테이블에 배치 된 플라스틱 디스크에 전송합니다.
7. 절단 테이블을 회전시켜 조직을 방향을 지정하여 기생충 절편을 수행한다.
8. 블레이드가 조직의 가장자리에 배치되도록 테이블 릴리스 노브를 오른쪽으로 당겨 절단 테이블을 이동합니다.
9. 슬라이스 두께를 350 μm로 조정하고 블레이드 속도를 중간크기로 조정합니다.
10. 헬기를 시작합니다. 소뇌 전체가 슬라이스되면(그림 1C),헬기를 끕니다.
11. 멸균 집게로 플라스틱 디스크를 분리합니다.
12. 플라스틱 디스크를 HBSS + 5 mg/mL 의 포도당이 들어 있는 60mm 접시에 조심스럽게 가져가십시오. 피펫 차가운 HBSS + 5 mg /mL 포도당은 완충제 접시에서 소뇌 슬라이스의 수확을 허용하기 위해 멸균 전달 파이펫을 사용하여 조직에.
13. 마이크로 프로브를 사용하여 소뇌 조각을 서로 분리합니다. 전사 파이펫으로 양질의 섹션을 꺼내 (vermis에 가까운 조직 섹션을 사용하는 것이 좋습니다) 미리 균형 조정 된 세포 배양 삽입(그림 1D)에떨어 뜨립니다.
14. 마이크로프로브를 사용하여 세포 배양 삽입에 소뇌 슬라이스를 배치한 다음, 전달 파이펫으로 초과 HBSS + 5 mg/mL 포도당 용액을 조심스럽게 제거합니다.
    참고: 이 단계에서 조직은 매우 부드럽고 물리적 인 손상이 발생하기 쉽습니다. 세포 배양 삽입 당 소뇌 슬라이스의 최대 수는 기증자 동물의 나이에 따라 달라집니다. P0-P4-늙은 동물에 대해 6-8슬라이스를 배양할 수 있으며, P5보다 오래된 동물을 위해 4-6슬라이스를 배양할 수 있습니다.
15. 배양 접시를 인큐베이터에 놓고 매 2-3 일마다 매체를 완전히 변경하십시오.
16. Purkinje 세포 생존을 평가하기 위해, 슬라이스는 시험관 내에서 5 일 이내에 수집 될 수있다. 다른 목적을 위해, 그들은 몇 주 동안 문화에서 유지 될 수있다(그림 1F).
    참고: Purkinje 세포 생존 실험의 경우, 세포 배양 배지를 변경할 때 약리학적 치료를 갱신 할 필요가 없습니다(도 1F).

3. 면역 형광

1. 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 꺼낸다. 세포 배양 배지를 제거하고, 1x PBS로 세포 배양 삽입을 세척하고, 1시간 동안 차가운 4% 파라포름알데히드 용액으로 슬라이스를 고정하고, 세포 배양 삽입하에 1 mL 및 500 μL을 세포 배양 삽입위에 부착하였다.
2. 인서트를 1x PBS로 4x 10분 간 세척하고, 1mL 언더와 500 μL을 인서츠 상단에 오비탈 셰이커에 두립니다.
3. 브러쉬로 소뇌 슬라이스를 1 세포 배양 삽입에서 1x PBS, 0.25 % 트리톤 X-100 및 3 % BSA (PBS-TB), 500 μL / well으로 미리 채워진 24 웰의 1 웰로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 돕습니다.
4. 실온에서 1시간 동안 PBS-TB에서 배양하여 슬라이스를 투과하고 차단합니다.
5. PBS-TB 용액에서 희석된 1차 항체로 배양하고, + 4°C에서, 궤도 셰이커, 200 μL/well에 투게소합니다.
6. 다음 날, 궤도 셰이커, 500 μL/well에서 1x PBS로 10분 동안 4번의 세차서를 수행합니다.
7. PBS-TB 용액에서 희석된 이차 항체로 배양하고, 실온에서 2시간, 궤도 셰이커에서, 그리고 빛으로부터 보호, 200 μL/well.
8. 궤도 셰이커, 500 μL/well에서 1x PBS로 10분 동안 4번의 세실을 수행합니다.
9. 1x PBS (2 μg / mL)로 희석 된 Hoechst 33342를 사용하여 슬라이스를 실온에서 10 분 동안 사용하여 빛으로부터 보호, 500 μL / well을 사용하여 슬라이스를 얼룩지게하십시오.
10. 이송 피펫으로 현미경 슬라이드에 소뇌 슬라이스를 장착합니다. 빛으로부터 완전히 공기 건조시키십시오. 1x PBS로 다시 가습하고 장착 매체 (~ 80 μL)의 몇 방울로 덮여 커버 슬립을 적용합니다. 거품을 만들지 마십시오.
11. 마운팅 매체가 경화되면 소뇌 절편을 이미지화 할 준비가됩니다.

4. 세포 생존의 화상 진찰 그리고 정량화

1. 제조업체 및/또는 이미징 코어 시설의 지침에 따라 현미경 및 레이저를 켭니다.
2. 수집 소프트웨어를 시작합니다.
3. 10X 목표를 사용하여 9-10 개의 소엽 (일반적으로 소뇌 섹션이 vermis에 가까운)을 제시하는 변경되지 않은 소뇌 조각을 찾습니다.
4. z 스택 획득을 활성화합니다. 소뇌 슬라이스에 존재하는 모든 Purkinje 세포를 포함하는 z-stack의 범위를 정의한다. 2 μm 단계 크기를 설정하고 수집을 시작합니다. 수집된 그림을 수집 소프트웨어 제조업체의 형식으로 저장하여 관련 메타데이터를 보존합니다.
5. 바이오 포맷 플러그인^18을사용하여 ImageJ에서 획득 한 파일을 엽니 다.
6. 이미지 > 스택 > Z 프로젝트로 이동 ...(그림 2A).
7. 투영 유형 드롭다운 메뉴에서 최대 강도를 선택하고 확인(그림 2B)을클릭합니다.
8. 병합된 2-D 이미지가 생성됩니다. 다중 점 도구를 두 번 클릭하여 점 도구 창이 표시되도록 합니다. 레이블 점 옵션의 선택을 취소하여 계산된 셀 시각화를 용이하게 합니다. 그런 다음 Purkinje 세포의 소마를 직접 클릭하여 계수를 시작합니다(그림 1E). 계산된 셀의 총 수는 점 도구 창 의 하단에 표시됩니다(그림3).
   참고: 일반적으로 세포 배양 삽입 당 9-10 개의 소엽을 포함하는 적어도 3 개의 손상되지 않은 섹션이 정량화 될 수 있습니다. 약리학적 인 에이전트의 신경 보호 효과를 평가하려면 적어도 3 개의 독립적 인 실험을 수행해야합니다.

결과

도 4에도시된 바와 같이, 이 프로토콜은 Purkinje 세포 생존이 면역 형광 및 이미지 획득 단계에 따라 평가될 수 있는 orgnotnotypic 소뇌 슬라이스 배양을 생성한다. 퍼킨제 세포는 항칼빈딘 D-28K(희석 1/200) 및 Alexa594 항마우스(희석 1/300) 항체의 조합으로 표지되었다. 이미지 스티칭은 전체 소뇌 슬라이스의 그림을 얻기 위해 현미경 수집 소프트웨어 (NIS-Elements)에 의해 자동으로 수?...

토론

소뇌 슬라이스 배양은 산후 발달 중에 프로그램된 Purkinje 세포 사멸을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 기술은 그들의 신경 보호 잠재력을 위한 후보 분자를 급속하게 스크리는 것을 이용될 수 있습니다. 주요 장점은 설정이 간단하고 매우 비용 효율적이며, 단지 장비에 적당한 투자가 필요하다는 것입니다 (진동은 조직 헬기보다 최대 3 배 더 많은 비용이 들 수 있습니다). 또한, 10 ~15개의 건강한 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody	ThermoFisher scientific	A21203
Basal Medium Eagle (BME)	ThermoFisher scientific	21010046
Biosafety cabinet Class II, Type A2	NuAire	NU-540-400
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A2153
Brush
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)	Abcam	ab82812
CO2 Incubator	NuAire	NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates	Fisher Scientific	07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mm	Fisher Scientific	12-545-E
Dressing forceps, straight	Harvard Apparatus	72-8949
Double edge blades	Fisher Scientific	50949411
Ethanol 200 proof	Decon Labs, Inc	2701
Eye Scissors, straight	Harvard Apparatus	72-8428
Fine forceps	Fisher Scientific	16-100-127
L-Glutamine 100X	ThermoFisher scientific	25030149
Glucose solution	ThermoFisher scientific	A2494001
Hanks’ Balanced Salt Solution	ThermoFisher scientific	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Fisher Scientific	H21492
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	ThermoFisher scientific	26050088
ImageJ
McIlwain Tissue Chopper	Fisher Scientific	NC9914528
Microprobes	Fisher Scientific	08-850
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore Sigma	PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL	ThermoFisher scientific	168-0045
Nikon A1R confocal laser microscope system	Nikon
NIS-Elements Imaging Software	Nikon
Paraformaldehyde	Acros Organics	41678-0010
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher scientific	P10144
Operating Scissors, straight	Harvard Apparatus	72-8403
Orbital shaker Belly Dancer	IBI Scientific	BDRLS0003
Prism 8	GraphPad
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring	Fisher Scientific	FB012921
Tissue culture plate, 24 well	Falcon/Corning	353047
Transfer pipettes, sterile	ThermoFisher scientific	13-711-21
Triton X-100	ThermoFisher scientific	BP151-500