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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, Ensembles molekularer Motoren auf DNA-Origami-Nanostrukturen zu bilden und die Ensemblemotilität mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zu beobachten.

Zusammenfassung

Zytoskelettmotoren sind verantwortlich für eine Vielzahl von Funktionen in eukaryotischen Zellen, einschließlich Mitose, Frachttransport, Zellbewegung und andere. Viele dieser Funktionen erfordern Motoren, um in Ensembles zu arbeiten. Trotz einer Fülle von Kenntnissen über die Mechanismen einzelner Zytoskelettmotoren ist vergleichsweise weniger über die Mechanismen und das aufkommende Verhalten von Motorensembles bekannt, deren Beispiele Veränderungen der Ensemble-Prozessivität und -geschwindigkeit mit Motornummer, Standort und Konfiguration ändern. Die strukturelle DNA-Nanotechnologie und die spezifische Technik des DNA-Origami ermöglichen die molekulare Konstruktion klar definierter Architekturen von Motorensembles. Die Form der Ladungsstrukturen sowie die Art, Anzahl und Platzierung der Motoren auf der Struktur können alle gesteuert werden. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Herstellung dieser Ensembles und deren Beobachtung mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Verfügung. Obwohl diese Techniken speziell für Zytoskelettmotoren angewendet wurden, sind die Methoden auf andere Proteine verallgemeinert, die sich in Komplexen zusammensetzen, um ihre Aufgaben zu erfüllen. Insgesamt bietet die DNA-Origami-Methode zur Schaffung klar definierter Ensembles von motorischen Proteinen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Mechanismen zu sezieren, die zu auftauchendem motilen Verhalten führen.

Einleitung

Dynein und Kinesin sind zytoskelettale motorische Proteine, die für unzählige Funktionen in eukaryotischen Zellen verantwortlich sind1. Durch die Umwandlung der chemischen Energie der ATP-Hydrolyse in produktive Arbeit, diese Motoren translozieren auf Mikrotubuli, um zu schleppen und zu verteilen verschiedene intrazelluläre Ladungen. Sie koordinieren auch in den massiven intrazellulären Umlagerungen im Zusammenhang mit Mitose, wo sie orchestrierte Kräfte aufweisen, die zur Positionierung und Trennung von Chromosomen beitragen. Strukturelle, biochemische und biophysikalische Assays, einschließlich Einzelmolekülbeobachtungen, haben die Mechanismen dieser Motoren auf individueller Ebene aufgedeckt (gut in früherenArbeiten2,3,4). Viele der Aufgaben der Motoren erfordern jedoch, dass sie in kleinen Ensembles ähnlicher und gemischter Motortypen arbeiten. Vergleichsweise weniger wird über die Mechanismen verstanden, die die Aktivität und die endgültige Beweglichkeit dieser Ensembles koordinieren5,6. Diese Wissenslücke ist zum Teil auf die Schwierigkeit zurückzuführen, Ensembles mit steuerbaren Merkmalen wie Motortyp und Kopiernummer zu erstellen. In den letzten zehn Jahren wurden die molekularen Konstruktionstechniken von DNA-Origami eingesetzt, um dieses Problem zu lösen. Für die Mikrotubuli-basierten Motoren sind einige Beispiele dieser Untersuchungen einzelmolekulare Beobachtungen von Ensembles von zytoplasmatischem Dynein-17,8,9, intraflagellar dynein11, verschiedene Kinesinmotoren12,13, und Mischungen von Dyneins und Kinesinen7,14,15. Hier stellen wir Details der Reinigung und Oligonukleotid-Etikettierung von Motoren aus Hefe7,16,17,18,19,20, die Faltung und Reinigung von segmentierten DNA-Origami mit abstimmbarer Konformität8und die Abbildung der Hefemotoren, die die Fahrwerksstrukturenantreiben 7,18.

Die Konstruktion von Motorensembles für die In-vitro-Einzelmolekülbeobachtung erfordert drei Hauptanstrengungen. Die erste ist die Expression, Reinigung und Kennzeichnung von Motorkonstrukten, die für die Befestigung an DNA-Origami geeignet sind. Die zweite ist die Produktion und Reinigung definierter DNA-Origami-Strukturen (oft als "Chassis" bezeichnet). Und die dritte ist die Konjugation der Motoren an die Chassis-Struktur gefolgt von Beobachtung mit totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF). Hier stellen wir etablierte Protokolle für diesen Prozess für rekombinante Mikrotubuli-basierte Motoren bereit, die aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18 gereinigt werden. 19. DNA-Origami-basierte Motorensembles wurden sowohl mit rekombinanten Kinesin15 als auch mit Dynein7,8,18 In diesem Hefeexpressionssystem hergestellten Konstrukten untersucht16 ,17,18,19. Dieses Protokoll gilt für diese Konstrukte, da sie vom galaktoseinduzierten Promotor kontrolliert und mit denselben Protein-Tags zur Reinigung (ZZ und TEV Protease Linker) und für DNA-Oligokonjugation (SNAPtag) verschmolzen werden.

Spezifische Hefestämme erzeugen spezifische Motorkonstrukte. Zum Beispiel wurde das Dynein, das verwendet wurde, um die Rolle der Ladungskonformität zu untersuchen, von der Sorte RPY10847,8gereinigt. Im Allgemeinen können Stämme, die Motorkonstrukte mit den entsprechenden genetischen Modifikationen für die Expression und Reinigung enthalten, von den Laboratorien angefordert werden, die die Verwendung dieser Motoren veröffentlicht haben. Konstrukte mit neuartigen Attributen wie Mutationen oder Tags können mit rekombinanten genetischen Techniken wie Lithiumacetat-Transformation21 und kommerziellen Kits erstellt werden. Detaillierte Protokolle zur Herstellung modifizierter motorischer Proteine in Hefe für Einzelmolekülstudien wurden veröffentlicht19. Zusätzlich zu den Motoren, die mit dem SNAPtag verschmolzen werden, müssen die Oligos, die zur Kennzeichnung der Motoren verwendet werden, mit dem SNAP-Substrat Benzylguanin (BG) konjugiert werden; zuvor veröffentlichte Protokolle beschreiben die Bildung und Reinigung von BG-Oligo-Konjugaten18. Die hier beschriebene Gesamtstrategie wurde auch für actin-basierte Motoren (siehe frühere Arbeiten für Beispiele22,23,24) und Motoren verwendet, die von anderen Organismen und Expressionssystemen gereinigt wurden (siehe vorherige arbeitet für Beispiele7,9,10,11,12,13,14).

Polymerisierte Mikrotubuli (MTs) werden in diesen Experimenten in zwei verschiedenen Verfahren eingesetzt. Mt AffinitätSreinigung von Funktionsmotoren erfordert MTs, die nicht mit anderen funktionellen Gruppen gekennzeichnet sind, während die Motor-Ensemble-Motilität TIRF Assay MTs erfordert, die mit Biotin und Fluorophoren gekennzeichnet sind. In allen Fällen werden MTs mit Taxol stabilisiert, um eine Denaturierung zu verhindern. Der MT-Affinitätsreinigungsschritt wird verwendet, um alle nicht-motilen Motoren mit einer hohen MT-Affinität zu entfernen, da diese Motoren die Beweglichkeit des Ensembles verändern können, wenn sie mit einem Chassis konjugiert werden. Dabei binden aktive Motoren die MTs und bleiben in lösungsweise, während sich im MT-Pellet eng bindende Motoren drehen. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Motoren auf dem Chassis aus einer aktiven Population stammen.

Eine Vielzahl von DNA-Origami-Strukturen wurden verwendet, um zytoskelettale motorische Ensembles zu studieren. Mit zunehmendem mechanistischen Verständnis des Ensembletransports sind die in Experimenten verwendeten DNA-Origami-Strukturen immer komplexer geworden. Grundsätzlich könnte jede Struktur für diesen Zweck angepasst werden, sofern sie so geändert wird, dass sie einsträngige DNA-Anhaftungsstellen für Motoren und Fluorophore umfasst. Spezifische Chassis-Designs und Attribute können nützlich sein, um bestimmte Fragen über das auftauchende Verhalten von Motoren-Ensembles zu untersuchen. Zum Beispiel wurden starre Stäbe verwendet, um grundlegende Kenntnisse darüber zu entwickeln, wie die Kopiernummer den Transport von Teams von Dyneins und Kinesinen beeinflusst7,15,18und 2D-Plattformen wurden verwendet, um Myosin-Ensemble zu studieren Navigation von actin-Netzwerken22. Strukturen mit variabler oder abstimmbarer Flexibilität wurden verwendet, um die Rollen der elastischen Kopplung zwischen Motoren zu verstehen und zu untersuchen, wie sich die Schrittsynchronisierung auf die Beweglichkeit8,24auswirkt. In jüngerer Zeit werden sphärische Strukturen verwendet, um Einen Einblick in die Auswirkungen geometrischer Abhängigkeiten auf die Motor-Track-Bindung auf die Dynamik der Beweglichkeit25zu gewinnen.

In diesem Protokoll bieten wir spezifische Schritte für Ensembleexperimente an segmentierten Chassis mit variabler Steifigkeit an. Bindungsstellen auf dem Chassis werden manchmal als "Griffe" bezeichnet, während ergänzende DNA-Sequenzen, die diese Griffe binden, als "Antihandles" bezeichnet werden. Die Anzahl der Motoren auf diesen Chassis wird bestimmt, welche Segmente verlängerte Griffklammern mit Komplementarität zum Antihandle-Oligo auf den Oligo-markierten Motoren enthalten. Die Verwendung unterschiedlicher Griffsequenzen auf verschiedenen Segmenten ermöglicht die Bindung verschiedener Motorentypen an bestimmte Stellen auf dem Chassis. Das hier beschriebene Chassis besteht aus 7 aufeinanderfolgenden starren Segmenten, die jeweils aus 12 doppelsträngigen DNA-Helices bestehen, die in 2 konzentrischen Ringen8angeordnet sind. Die starren Segmente enthalten die Motorgriffe und sind durch Regionen verbunden, die entweder flexible einsträngige DNA oder starre doppelsträngige DNA sein können, je nach Abwesenheit bzw. Vorhandensein von "Linker"-Heftklammern. Die Übereinstimmung der Fahrwerksstruktur wird somit durch das Vorhandensein oder Fehlen dieser "Linker"-Heftklammern bestimmt. Weitere Informationen und spezifische DNA-Sequenzen finden Sie in früheren Berichten8. Darüber hinaus können mehrere Methoden verwendet werden, um Chassis26zu reinigen. Hier wird die rate-zonale Glyzeringradientenzentrifugationsmethode27 beschrieben.

Protokoll

1. Wachstum, Expression und Ernte von motorischen Proteinen, die von einem Galactose-induzierten Promotor gesteuert werden

  1. Mit einer Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) Kulturplatte und einem sterilen Impfstab, Streifen gewünschte gefrorene Hefe-Stamm und inkubieren für 3-4 Tage bei 30 °C.
  2. Tag 1 des Kulturwachstums: Am Nachmittag 10 ml YP-Kulturmedien mit 2% Dextrose zu einem Glaskulturrohr mit 1" Durchmesser hinzufügen und mit einer einzigen Kolonie von der Platte impfen. Wachsen Sie in einer schnell rotierenden Walzentrommel bei 30 °C über Nacht.
  3. Tag 2: Am Nachmittag die 10 ml Kultur auf einen 250 ml Kolben mit 50 ml YP-Kulturmedien mit 2% Raffinose übertragen. Über Nacht bei 30 °C inkubieren, während sie bei 250 Umdrehungen pm auf einem Orbital-Shaker schütteln.
  4. Tag 3: Am Nachmittag die 60 ml Kultur auf einen 3 L Kolben mit 1 L YP-Kulturmedien mit 2% Galaktose übertragen. Über Nacht bei 30 °C inkubieren, während sie bei 250 Umdrehungen pm auf einem Orbital-Shaker schütteln.
  5. Tag 4: Überwachen Sie ab dem Vormittag die optische Dichte (OD) der Kultur bei 600 nm alle 2 h. Wenn die Kultur zwischen einem OD 1.5 und 2 liegt, fahren Sie mit den folgenden Schritten fort, um die Zellen zu ernten. Die Ernte außerhalb dieses OD-Bereichs kann den Ertrag aufgrund niedriger Zellzahlen vor OD 1.5 oder zellulärer Ruhe und Proteinabbau über OD 2 verringern.
  6. Die Zellkultur in Zentrifugenflaschen dekantieren und bei 4 °C 8 min bei 6200 x g drehen. Den Überstand abgießen und entsorgen.
  7. Das Zellpellet in der Flasche mit doppeldestilliertem H2O (ddH2O) wieder aufsetzen.
  8. Drehen Sie die Zellen bei 4 °C bei 4 °C für 8 min. Gießen Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn.
  9. Je nach Viskosität des Zellpellets bis zu 2 ml ddH2O hinzufügen, um eine Lösungsflüssigkeit zu erzeugen, die für die Pipettierung ausreicht.
  10. Mit einem motorisierten Pipettenregler, der mit einer 10 ml Pipette ausgestattet ist, geben Sie die Zellschlämme langsam in flüssigen Stickstoff nacheinander ab. Dadurch entstehen gefrorene Pellets von Hefezellen.
  11. Bewahren Sie die gefrorenen Zellen bei -80 °C auf, bis sie gereinigt werden können.

2. Reinigung von motorischen Proteinen aus Hefezellen

  1. Zelllyse und lösliche Proteinextraktion
    1. 1 ml einer frischen Lösung von 0,1 M PMSF in reinem Ethanol vorbereiten. Warten Sie, bis der PMSF wässrigen Puffern hinzugefügt wird, da er in Wasser instabil ist. vermeiden Sie auch die Exposition gegenüber Wasser bis innerhalb von 20 min (die ungefähre Halbwertszeit von PMSF in Wasser) der Nutzung.
    2. Bereiten Sie 50 ml 4x Lysepuffer auf Eis mit Ergänzungen aus dem 5x-Bestand an Lysepuffer vor, fügen Sie aber PMSF erst kurz vor dem Auftragen des Puffers auf das Hefepellet hinzu.
    3. Schleifen Sie die flüssigen stickstoffgefrorenen Hefepellets zu einem feinen Pulver mit einer klingenförmigen Kaffeemühle, die mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt wurde.
      HINWEIS: Diese Proteinextraktion beginnt in der Regel mit dem Zellpellet, das aus 2 L Hefekultur geerntet wird. Die Ausgangsmenge der Hefekultur kann mit angemessenen Anpassungen an die Volumina von IgG-Perlen und DNA-Oligos in den Schritten 2.2.2 und 2.3.1 unten nach oben oder unten angepasst werden.
    4. Aliquot 15 ml des 4x Lysepuffers mit DTT und Mg-ATP auf Eis und fügen SIE PMSF in den Puffer, um eine endgültige Konzentration von 2 mM zu erreichen, wodurch die Vorbereitung des 4x Lysepuffers mit Ergänzungen abgeschlossen wird.
    5. Das Hefepulver in einen vorgekühlten Glasbecher mit einer Größe von 100 ml auf Eis sammeln. Fügen Sie ein kleines Volumen des 4x Lysepuffers mit Ergänzungen in das Pulver, so dass die endgültige Konzentration des Puffers nicht mehr als 1x. Fügen Sie in der Regel 1,5 ml des Puffers für jede 10 ml Hefepulver hinzu.
    6. Das Pulver schnell auf die flüssige Phase auftauen, indem Sie das Becherglas unter ständigem Rühren mit einem Spachtel in ein 37 °C-Wasserbad legen.
    7. Legen Sie den Becher Lysat sofort nach dem Auftauen wieder auf Eis, schätzen Sie das Lysatvolumen mit einem 50 ml konischen Rohr ab und fügen Sie weitere 4x Lysepuffer mit Ergänzungen hinzu, so dass die Endkonzentration des Puffers 1x beträgt. Typischerweise ergibt 2 L Hefekultur insgesamt 25-35 ml Lysat, das 1x Lysepuffer enthält.
    8. Gleichmäßig verteilen Sie das Lysat auf Zentrifugenflaschen auf Eis. Balancieren Sie die Flaschen vorsichtig auf einen Massenunterschied von nicht mehr als 0,01 g zwischen jedem Paar und stellen Sie sicher, dass jede Flasche über dem Mindestvolumen liegt, das erforderlich ist, um einen Flaschenkollaps zu verhindern. Zentrifuge bei 290.000 x g für 25 min bei 4 °C.
    9. Sammeln Sie den Überstand, der lösliche Proteine enthält, in einem 50 ml kegelförmigen Röhrchen auf Eis und entsorgen Sie das Pellet, das Zellablagerungen und große Organellen enthält. Vermeiden Sie das Sammeln von trüben Teilen des Überstandes, da sie die Indenkühlsäule verstopfen können, die in den nachfolgenden Schritten verwendet wird. Speichern Sie 10 L des Überstandes für die SDS-PAGE-Analyse.
  2. IgG Affinitätsreinigung
    1. Richten Sie während der obigen Drehung eine Gravitations-Flow-Chromatographie-Säule auf Eis oder in einem kalten Raum ein.
    2. Übertragen Sie 200 L von 50% IgG-Affinitätsperlenschlämme mit einer P-1000 Pipettenspitze, die mit einer Rasierklinge geschnitten wird, um den Durchmesser des Eingangsanschlusses zu vergrößern. Wenn Sie mehr oder weniger als 2 L Zellkulturpellet reinigen, stellen Sie das Volumen der Perlenschlämme proportional mit einem Mindestvolumen von 100 l ein.
    3. Aliquot weitere 15 ml des 4x Lysepuffers mit DTT und Mg-ATP und fügen Sie PMSF in den Puffer, um eine endgültige Konzentration von 2mM zu erreichen. Den 4x Puffer auf Eis auf 1x verdünnen, indem ddH2O hinzugefügt wird.
    4. Waschen Sie die Perlen 2x mit 5 ml 1x Lysepuffer mit Ergänzungen.
    5. Resuspend die Perlen in 200 L von 1x Lyse Puffer mit Ergänzungen.
    6. Fügen Sie die Perlensuspension dem aus der Zentrifugation gewonnenen Proteinextrakt hinzu und inkubieren Sie die Mischung bei 4 °C für 1 h mit sanfter Rotation.
    7. Während der Inkubation 25 ml des Waschpuffers (Rezept in Tabelle 1)auf Eis und 50 ml 1x TEV-Puffer (Rezept in Tabelle 1)auf Eis vorbereiten.
    8. Filtern Sie nach der 1 h Inkubation das Lysat-Perlen-Gemisch auf Eis oder im Kalten Raum durch die gleiche Chromatographiesäule, die in Schritt 2.2.2 oben verwendet wurde. Sparen Sie 10 L des Durchflusses für die SDS-PAGE-Analyse.
    9. Waschen Sie die restlichen motorgebundenen Perlen 2x mit 5 ml Waschpuffer auf Eis. Sparen Sie 10 l der ersten Wäsche für die SDS-PAGE-Analyse.
    10. Waschen Sie die Perlen einmal auf Eis mit 5 ml 1x TEV Puffer. Lassen Sie den Puffer vollständig aus der Spalte abfließen.
  3. Kennzeichnung mit DNA-Oligonukleotiden und TEV-Spaltung
    1. Entfernen Sie die Chromatographiespalte aus dem Setup, und verkapseln Sie den unteren Rand der Spalte. In derselben Spalte die Motorperlen mit 100 l 1x TEV-Puffer mit 10-20 m des gereinigten BG-Oligos bei Raumtemperatur (RT) für 10-15 min inkubieren. Wenn Sie mehr oder weniger als 2 L Zellkulturpellet reinigen, stellen Sie das Volumen des 1x TEV Puffers und der gereinigten BG-Oligos proportional ein. Erhöhen Sie die Inkubationszeit gemäß den Anweisungen des Herstellers, wenn nötig, um die Ausbeute und Rate der Motorkennzeichnung zu erhöhen, aber beachten Sie, dass längere Inkubationszeiten auch den Anteil von dysfunktionalen Motoren aufgrund der Proteindenaturierung bei RT erhöhen können.
    2. Setzen Sie die Perlen vorsichtig in jeder Minute der Inkubation aus.
    3. Waschen Sie die beschrifteten Motorperlen 4x mit 4 ml 1x TEV-Puffer mit der gleichen Chromatographie-Säule und -Einrichtung wie zuvor. Lassen Sie die endige Wäsche vollständig von der Säule abtropfen lassen.
    4. Verkapseln Sie den unteren Rand der Säule, setzen Sie die Motorperlen in nicht mehr als 200 l 1x TEV-Puffer wieder auf und übertragen Sie sie in ein 2 ml rundes Mikrozentrifugenrohr.
    5. Inkubieren Sie die Suspension mit 0,3 Einheiten TEV-Protease pro L Motor-Perlen-Gemisch bei 16 °C für 1 h bei sanften Drehungen. Das Rohr sollte so montiert werden, dass die Gesamtfläche des Rohres, mit dem die Perlen in Berührung kommen, minimiert wird.
    6. Zentrifugieren Sie das Rohr in einer Mikrozentrifuge bei 21.130 x g für 30 s in einem kalten Raum, um die Mischung an der Unterseite des Rohres zu konzentrieren.
    7. Noch im Kühlraum verwenden Sie eine geschnittene P-1000 Pipettenspitze, um das Gemisch auf eine Spinsäule und Zentrifuge bei 21.130 x g für 30 s zu übertragen. Die TEV-Protease wird im Filtrat sowie in den Motoren sein.
    8. Speichern Sie 10 L des Filtrats für die SDS-PAGE-Analyse. Aliquot das verbleibende Filtrat in Volumina von 2 l für TIRF-Experimente oder 50 l für die Reinigung der Mikrotubuli-Affinität. Blitz einfrieren Sie die Aliquots in flüssigem Stickstoff und lagern Sie bei -80 °C.
    9. Setzen Sie die im Filter verbleibenden Perlen im 1x TEV-Puffer für die SDS-PAGE-Analyse wieder aus. Verwenden Sie das gleiche Volumen von 1x TEV-Puffer wie in Schritt 2.3.4 oben.

3. Mikrotubuli (MT) Polymerisation

  1. Vorbereitung von Tubulinmischungen für TIRF-Assays
    1. In einem kalten Raum das lyophilisierte Tubulin jeder Art (unbeschriftetes Rindertubin, biotinyliertes Tubulin und fluoreszierendes Tubulin) im Rekonstitutionspuffer (Rezept in Tabelle 2)separat auflösen, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erreichen. Lassen Sie 10 min auf dem Eis sitzen.
      1. Mischen Sie die folgenden Komponenten und lassen Sie die folgenden Komponenten auf Eis für 10 min im kalten Raum sitzen (Endkonzentrationen sind parenthetisch angegeben): 18 l Rindertubulin (ca. 8,2 mg/ml), 2 l biotinyltubulin (0,9 mg/ml) und 2 l fluoreszierendes Tubulin (ca. 0,9 mg/ml).
    2. Bereiten Sie 3 L Aliquots des Tubulin-Gemischs vor und blitzen Sie in flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie die Mischungen bei -80 °C auf.
  2. Vorbereitung von Tubulin zur MT-Affinitätsreinigung von Motoren
    1. Lösen Sie in einem kalten Raum lyophilisiertes Rindertubin im Rekonstitutionspuffer auf, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erreichen. Lassen Sie 10 min auf dem Eis sitzen.
    2. Bereiten Sie 3 L Aliquots des Tubulin-Gemischs vor und blitzen Sie in flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie die Mischungen bei -80 °C auf.
  3. Polymerisation von Tubulin in MTs
    1. Entfernen Sie einen 3 L Aliquot Tubulin aus dem -80 °C Gefrierschrank und sehr schnell und kurz auftauen, um die flüssige Phase durch Halten der Unterseite des Rohres. Sofort auf Eis legen und mindestens 3 min bebrüten.
    2. Schicht3 l 2x Polymerisationsmischung (Rezept in Tabelle 2)auf der Oberseite der Tubulinlösung. Mischen Sie durch sanftes Streichen des Rohres, aber nicht durch Pipettieren mischen, da Scherkräfte MT-Kernbildung und Dehnung stören können.
    3. Inkubieren Sie die Mischung in einem Wasserbad bei 37 °C für 30 min.
    4. Legen Sie vorsichtig Schicht 6 l VON RT 1x BRB80 mit Ergänzungen (Rezept in Tabelle 2) auf der Oberseite und mischen durch Flicken. Nicht durch Pipetten mischen.
    5. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für mindestens 10 min.
    6. Fahren Sie mit der MT-Affinitätsreinigung fort, oder tauchen Sie bei RT über Nacht Bei RT Im Dunkeln mTs auf, um längere MTs zu bilden.
    7. Lagern Sie polymerisierte MTs wochenlang im Dunkeln bei RT.

4. Mikrotubuli (MT) Affinitätsreinigung

  1. Entfernung von nichtpolymerisierten Tubulinen durch Zentrifugation
    1. Mischen Sie die folgenden Komponenten, um ein 60% Glycerinkissen zu machen: 1x BRB80 (ohne Ergänzungen; Rezept in Tabelle 2),20 m Taxol (in DMSO gelöst), 1 mM DTT und 60% Glycerin.
    2. Übertragen Sie 60 l des Glycerinkissens in ein Ultrazentrifugenrohr. Schicht12 l der unbeschrifteten MTs, die zuvor auf dem Kissen polymerisiert wurden. Um das Scheren von MTs zu verhindern, übertragen Sie sie mit einer geschnittenen Pipettenspitze.
    3. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 15 min bei 97.300 x g bei 22 °C. Nach der Drehung bleiben die überschüssigen Tubuline in der oberen Flüssigkeitsschicht, während die MTs ein Pellet am Boden bilden. Markieren Sie den äußeren Rand des Rohres vor der Drehung, um das Pellet zu lokalisieren, da das Pellet möglicherweise nicht mit bloßem Auge sichtbar ist.
    4. Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeitsschicht (ca. 12 l) über dem Glycerinkissen und sparen Sie 10 l für die SDS-PAGE-Analyse.
    5. Spülen Sie die Schnittstelle zwischen Flüssigkeitsschicht und Kissen vorsichtig mit 20 l 1x BRB80 mit Ergänzungen. Entfernen und entsorgen Sie die 20 L Spülung.
    6. Entfernen Sie vorsichtig das Glycerinkissen (ca. 60 l) und sparen Sie 10 l für die SDS-PAGE-Analyse. Achten Sie darauf, das MT-Pellet nicht zu stören.
    7. Spülen Sie das Pellet vorsichtig mit 60 l 1x BRB80 mit Ergänzungen (Rezept in Tabelle 2) Achten Sie darauf, das MT-Pellet nicht zu stören. Entsorgen Sie die Spüllösung.
    8. Das MT-Pellet in 24 L Taxol-ergänzten Lysepuffer (Rezept in Tabelle 3)mit einer geschnittenen Pipettenspitze wieder aufsetzen.
  2. Reinigung von Funktionsmotoren durch MT-basierte Affinitätschromatographie
    1. Entfernen Sie zwei 50 L Aliquots von Motoren, die aus Hefe gereinigt werden, aus dem -80C Gefrierschrank und tauen Sie schnell in die flüssige Phase auf. Sofort auf Eis legen.
    2. Fügen Sie in der angegebenen Reihenfolge die folgenden Komponenten in ein neues Ultrazentrifugenrohr ein und brüten Sie das Gemisch bei RT für 10 min: (1) 100 l der aus Hefe gereinigten Motoren, (2) 29 l 5x ATP/Taxol-Mischung (Rezept in Tabelle 3), dann (3) 12 l gereinigte MTs tran mit einer geschnittenen Pipettenspitze.
    3. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 97.300 x g und 22 °C für 15 min. Nach der Drehung bleiben Funktionsmotoren im Überstand, und MTs bilden ein Pellet, zusammen mit den nicht-funktionalen Motoren, die an sie gebunden sind.
    4. Sammeln Sie den Überstand, blitzen Sie in 2 L Aliquots einfrieren, und lagern Sie bei -80 °C.
    5. Speichern Sie 10 L des Überstandes für die SDS-PAGE-Analyse. Setzen Sie das Pellet auch für die SDS-PAGE-Analyse in 141 l von 1x BRB80 aus. Verwenden Sie Proteinstandards wie Actin, um eine Standardkurve zur Quantifizierung der Konzentration der gereinigten Motoren zu erstellen, wie zuvor detailliert17.
    6. Verwenden Sie diese Konzentrationsinformationen beim Konjugieren von Motoren zum Gehäuse in Schritt 6.1.3.

5. Herstellung von segmentierten DNA-Origami-Chassis

  1. Aufbau des Fahrgestells
    1. Bestellen Sie die in den zuvor veröffentlichten Tabellen8 aufgeführten Grundoligonukleotide in 96 Wellplatten bei 250 m im Tris-Puffer nass oder trocken und setzen Sie sie dann mit Tris-Puffer auf 250 m aus.
    2. Erstellen Sie einen Pool der Kernklammern, indem Sie 5 l jedes Kernheftklammers mischen (siehe Tabelle S1 in Driller-Colangelo 20168).
    3. Erstellen Sie einen Pool der Linkerheftklammern, indem Sie 5 l jedes Linkerheftklammerns mischen (siehe Linker-Heftklammertabelle in Driller-Colangelo 20168).
    4. Erstellen Sie einen Pool der Fluorophor-Bindungsklammern, indem Sie 5 l jedes Fluorophor-Griffheftes mischen (siehe Fluorophor-Grifftabelle in Driller-Colangelo 20168).
    5. Mischen Sie 50 L Faltreaktionen mit folgenden Komponenten: 1x Faltpuffer; 100 nM 8064 Gerüst; 600 nM Kern Hefter Pool; 600 nM Fluorophor-Heft-Wasserklammer-Pool; 9 M Fluorophorstrang (siehe Fluorophor-Antihandle-Tabelle in Driller-Colangelo 20168); für jede Motorbindungsstelle entweder 4,2 m verlängerte Griffstränge oder 600 nM Stränge ohne Griffe nach Belieben (siehe Motorgriff/Antigriff-Heftklammertabelle in Driller-Colangelo 20168); 600 nM Linker wie gewünscht8; zusätzliche 6 mM MgCl2; und Wasser.
    6. Falten Sie in einem thermischen Cycler mit dem folgenden Programm: Schnelle Erwärmung auf 80 °C, Kühlung in Ein-Grad-Schritten auf 65 °C über 75 min, dann zusätzliche Kühlung in Ein-Grad-Schritten auf 30 °C über 17,5 h.
    7. Assay Faltqualität auf einem 2% Agarose-Gel in 0,5x TBE-Puffer (siehe Tabelle 4 für Rezept) ergänzt mit 11 mM MgCl2 und DNA-Gel-Färbung (siehe Materialtabelle). Laufgel in 0,5x TBE Puffer ergänzt mit 11 mM MgCl2 bei 70 V für 60-90 min. Gele in einem Eiswasserbad oder in einem Kühlraum laufen, um übermäßige Erwärmung und anschließende Denaturierung von Fahrwerksstrukturen zu verhindern.
    8. Bild des Gels unter Verwendung von Bedingungen, die für den in Schritt 5.1.7 verwendeten DNA-Gelfleck geeignet sind.
  2. Reinigung des Fahrgestells
    1. Am späten Nachmittag des Tages vor der Reinigung, glycerin Gradienten durch sanfte Schichtung 80 l von 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% und 15% Glycerin in 1x Origami Faltpuffer in einem Zentrifugenrohr (siehe Tabelle 4 für Rezept). Grenzen zwischen Ebenen sollten leicht sichtbar sein.
    2. Inkubieren Sie Steigungen bei 4 °C über Nacht.
    3. Am nächsten Morgen 45% Glycerin in 1x Origami Faltpuffer in die gefaltete Chassis-Lösung zu einer endgültigen Konzentration von 10% Glycerin hinzufügen. Mischen Sie sanft und Schicht auf der Oberseite des Farbverlaufs in der Zentrifuge Rohr.
    4. Drehen Sie den Farbverlauf mit dem Chassis bei 243.000 x g für 130 min bei 4 °C.
    5. Sammeln Sie 50 L-Fraktionen aus dem Rohr in einer oberen bis unteren Richtung.
    6. Gießen Sie ein 2% Agarose Gel in 0,5x TBE Puffer ergänzt mit 11 mM MgCl2 und DNA-Gel-Färbung.
    7. Laden Sie 5 l von jeder Fraktion auf das Gel und laufen Gel in 0,5x TBE Puffer ergänzt mit 11 mM MgCl2 für 90-120 min bei 70 V. Führen Sie Gele in einem Eiswasserbad oder in einem Kalten Raum, um übermäßige Erwärmung und anschließende Denaturierung von Fahrwerksstrukturen zu verhindern.
    8. Bild des Gels unter Verwendung von Bedingungen, die für den in Schritt 5.2.6 verwendeten DNA-Gelfleck geeignet sind.
    9. Wählen Sie Fraktionen für zukünftige Experimente aus, die gut gefaltete monomere Strukturen ohne ausgemeindefreie Klammern aufweisen.
    10. Quantifizierte Konzentrationen ausgewählter Fraktionen mit geeigneten spektroskopischen Methoden, wie uv-Absorption bei 260 nm. Verwenden Sie diese Konzentrationsinformationen beim Konjugieren von Motoren zum Gehäuse in Schritt 6.1.3.

6. Herstellung von Dia-Assay-Kammern

  1. Machen Sie eine Dia-Assay-Kammer, indem Sie zwei Streifen doppelseitiges Klebeband an eine Glasrutsche kleben und einen Deckelschlupf darüber platzieren. Die Kammer ist der schmale Raum zwischen Deckelrutsch und Glasrutsche, flankiert von den beiden Bandstreifen. Abbildung 1 zeigt die Assaykammer.
  2. Wenn Sie den Schlitten mit Lösungen vorbereiten, verwenden Sie eine Pipette, um Flüssigkeit von einer Seite in die Kammer zu fließen, und verwenden Sie einen Streifen Filterpapier, um den Fluss der Flüssigkeit auf der anderen Seite zu sammeln.

7. Motorensemble-Motilität TIRF-Assay

  1. Konjugation von Motoren zu DNA-Chassis
    1. Auf Eis, bereiten sie frische 1 ml jeder Von DTT-ergänzten BRB80, Taxol-ergänzte Lyse Puffer, und Casein-Taxol-ergänzte Lyse Puffer (Rezepte in Tabelle 5detailliert ). Übertragen Sie 200 l jedes Puffers in ein RT-Rohr.
    2. Noch auf Eis, verwenden Sie den kalten Casein-Taxol-ergänzten Lysepuffer, um die 4x Energie- und 4x-Schnitzelmischungen zuzubereiten (Rezepte in Tabelle 5).
    3. Inkubieren Sie 10 l mit 300 nM gereinigten Motoren mit 5 l von 10 nM DNA-Chassis auf Eis für 15-30 min. Diese Konzentrationen von Motoren haben gezeigt, dass sie die Motorbindungsstellen des Chassis für diese Inkubationszeit sättigen.
      HINWEIS: Motorbelegung ist nicht 100%, wahrscheinlich aufgrund stochastisch fehlenden Griff Klammern in einzelnen Chassis Strukturen8,28.
    4. Während der Inkubation die biotin- und fluorophor-markierten MTs 100x mit dem RT Taxol-ergänzten Lysepuffer verdünnen und ein Für größenausschlusssäulenchromatographie geeignetes Gelfiltrationsharz vorbereiten, indem Sie das nachstehende Verfahren befolgen.
  2. Entfernung von überschüssigen Motoren aus Motor-Chassis-Konjugaten durch Größenausschlusssäulenchromatographie
    1. In einem 50 ml konischen Rohr 5 ml des Gelfiltrationsharzes 2x mit 45 ml ddH2O waschen. Mischen Sie das Harz für jede Wäsche mit Wasser im konischen Rohr und drehen Sie die Mischung bei 460 x g für 1 min. Entsorgen Sie den Überstand und speichern Sie das Harz.
    2. Waschen Sie das Harz 2x mit 45 ml 1x Lysepuffer (Rezept in Tabelle 5) mit der oben beschriebenen Methode.
    3. Das gewaschene Harz im 1x Lysepuffer im Verhältnis 1:1 wieder aufsetzen, so dass das Harz zu einer Gülle von 50 % im Puffer wird. Das gewaschene Harz kann mindestens 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
    4. Übertragen Sie 800 l der Harzsuspension auf eine Spinsäule. Entleeren Sie den überschüssigen Puffer durch Schwerkraftfluss für 5 min. Entfernen Sie alle verbleibenden Puffer mit einem 2 s Spin bei 1.000 x g. Das endige Harzvolumen sollte etwa 350-400 l betragen.
    5. Verdünnen Sie den Motor-Chassis-Mix mit dem Casein-Taxol-ergänzten Lysepuffer auf ein Endvolumen von 50 l. Übertragen Sie die verdünnte Mischung auf die mit Harz verpackte Spinsäule.
    6. Zentrifugieren Sie die Spinsäule bei 1.000 x g für 6 s (diese Zeit beinhaltet die Beschleunigungs- und Verzögerungszeit). Sammeln Sie die reinen Motor-Chassis-Konjugate, indem Sie das Filtrat speichern und die Säule entsorgen, die die überschüssigen Motoren behält.
  3. Vorbereitung von Dias für die Bildgebung
    1. Durchfluss von 1 mg/ml biotinylatiertem Rinderserumalbumin (Biotin-BSA) in eine Dia-Assay-Kammer. 2 min inkubieren, um die Bindung von BSA an Glas zu ermöglichen.
    2. Waschen Sie die Kammer 2x mit 20 l des RT DTT-ergänzten BRB80, indem Sie den Puffer auf einer Seite der Kammer einfließen lassen und die überschüssige Flüssigkeit mit einem Filterpapierstreifen von der anderen Seite entfernen.
    3. Durchfluss in 20 l von 0,5 mg/ml Streptavidin. 2 min inkubieren, um die Bindung von Streptavidin an das Biotin auf der BSA zu ermöglichen.
    4. Waschen Sie die Kammer 2x mit 20 l des RT Taxol-ergänzten Lysepuffers.
    5. Mit einer geschnittenen Pipettenspitze in 20 l der verdünnten MTs sanft fließen. 2 min inkubieren, um eine Bindung zwischen dem Biotin auf MTs und Streptavidin zu ermöglichen.
    6. 2x mit 20 l des RT Casein-Taxol-ergänzten Lysepuffers waschen. 2 min inkubieren, damit Casein die gesamte Kammer durchdringen kann.
    7. Verdünnen Sie das gereinigte Motor-Chassis-Konjugate 5x bis 10x zu Einmolekülbedingungen (ca. 10-100 pM) mit dem kalten Casein-Taxol-ergänzten Lysepuffer. Mischen Sie die folgenden Komponenten zu einem endgültigen Motor-Chassis-Gemisch: 10 l der Motor-Chassis-Verdünnung, 5 l 4x Energiemix und 5 x L 4x Abräumer-Mix.
    8. In 20 l des endgültigen Motor-Chassis-Gemischs in die Assay-Schiebekammer fließen und zur TIRF-Mikroskopie übergehen.
  4. Imaging und Datenerfassung
    1. Stellen Sie das Dia sofort mit einem TIRF-Mikroskop ab. In der Regel bleibt jede Folie zwischen 30 und 60 min verwendbar.
    2. Erfassen Sie ein Standbild im MT-Kanal und einen Film im Gehäusekanal. Für die Motoren in diesem Protokoll sind 10 min Filme mit einer Bildrate von 0,5 fps und Belichtungszeit von 200 ms geeignet.
    3. Erstellen Sie aus dem Chassis-Film einen Kymographen für jede MT in ImageJ oder eine ähnliche Bildverarbeitungssoftware29. Analysieren Sie die Geschwindigkeiten und Lauflängen von Motor-Chassis-Ensembles, indem Sie die Steigungen und horizontalen Abstände der Läufe auf dem Kymograph30messen.

Ergebnisse

Erfolgreiche Reinigungen von Motoren und Fahrwerksstrukturen wurden durch Gelelektrophorese geprüft. Die SDS-PAGE-Analyse bestätigte die erfolgreiche Extraktion von Farbstoff aus Hefe (Abbildung 2), da das in Schritt 2.3.7 gesammelte Endfiltrat ein klares, scharfes Band an der Position von 350 kDa zeigte. Wie erwartet, fehlte dieses Dynein-Band in der Durchfluss- und Waschung, die unerwünschte Proteine entfernte, und den Perlen, von denen Dynein spaltete. ...

Diskussion

Die molekularen Konstruktionstechniken von DNA-Origami bieten eine einzigartige Möglichkeit, Motorensembles mit definierten Architekturen, Motorzahlen und Typen zu konstruieren, was Studien darüber ermöglicht, wie das entstehende Verhalten aus bestimmten Motorkonfigurationen entsteht31. Da strukturelle und zelluläre Studien weiterhin Beispiele von Zytoskelettmotoren aufklären, die in Teams arbeiten, werden Techniken zur Isolierung und Untersuchung der biophysikalischen und biochemischen Mecha...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken K. Chau, J. Morgan und A. Driller-Colangelo für ihren Beitrag zu den Techniken des segmentierten DNA-Origami-Chassis. Wir danken auch ehemaligen Mitgliedern der Laboratorien Reck-Peterson und Shih für hilfreiche Diskussionen und Beiträge zur ursprünglichen Entwicklung dieser Techniken. Wir danken J. Wopereis und dem Smith College Center for Microscopy and Imaging und L. Bierwert und dem Smith College Center for Molecular Biology. Wir danken dem NSF MRT-Programm für die Anschaffung eines TIRF-Mikroskops.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL Round Bottom TubeUSA Scientific1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pureCytoskeleton.comT333P-A
Biotin-BSASigmaA8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mmBeckman Coulter356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mmBeckman Coulter355603
Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mLGE Healthcare17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, emptyBio-Rad7326204EDU
P8064 ScaffoldTilibit2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography ColumnsBio-Rad731-1550
ProTev ProteasePromegaV6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenseramazon.comN/A
Sephacryl S-500 HRGE Healthcare17061310
StreptavidinThermo Fisher434302
SYBR Safe DNA stainInvitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brainCytoskeleton.comT240-B
Tubulin, HiLyte 647Cytoskeleton.comTL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge TubesBeckman Coulter344090

Referenzen

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