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Résumé

L'objectif de ce protocole est de former des ensembles de moteurs moléculaires sur les nanostructures d'origami d'ADN et d'observer la motilité d'ensemble en utilisant la microscopie interne totale de fluorescence de réflexion.

Résumé

Les moteurs cytosquelettiques sont responsables d'une grande variété de fonctions dans les cellules eucaryotes, y compris la mitose, le transport de marchandises, la motilité cellulaire, et d'autres. Bon nombre de ces fonctions exigent que les moteurs fonctionnent en ensembles. Malgré une riche connaissance des mécanismes des moteurs cytosquelettiques individuels, on en sait relativement moins sur les mécanismes et les comportements émergents des ensembles moteurs, dont des exemples incluent des changements dans la processivité et la vitesse d'ensemble avec changement de numéro, d'emplacement et de configuration du moteur. La nanotechnologie de l'ADN structurel, et la technique spécifique de l'origami d'ADN, permet la construction moléculaire d'architectures bien définies d'ensembles moteurs. La forme des structures de chargement ainsi que le type, le nombre et le placement des moteurs sur la structure peuvent tous être contrôlés. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour produire ces ensembles et les observer à l'aide de la microscopie interne totale de fluorescence de réflexion. Bien que ces techniques aient été spécifiquement appliquées pour les moteurs cytosquelettiques, les méthodes sont généralisables à d'autres protéines qui s'assemblent dans des complexes pour accomplir leurs tâches. Dans l'ensemble, la méthode de l'origami d'ADN pour créer des ensembles bien définis de protéines motrices fournit un outil puissant pour disséquer les mécanismes qui mènent à un comportement motile émergent.

Introduction

La dyneine et la kinésie sont des protéines motrices cytosquelettiques responsables d'une myriade de fonctions dans les cellules eucaryotes1. En convertissant l'énergie chimique de l'hydrolyse ATP en travail productif, ces moteurs se translocalisent sur des microtubules pour transporter et distribuer diverses cargaisons intracellulaires. Ils coordonnent également dans les réarrangements intracellulaires massifs liés à la mitose, où ils montrent des forces orchestrées qui contribuent au positionnement et à la séparation des chromosomes. Les essais structurels, biochimiques et biophysiques, y compris les observations d'une seule molécule, ont révélé les mécanismes de ces moteurs au niveau individuel (bien examinés dans les travaux précédents2,3,4). Cependant, beaucoup de tâches des moteurs exigent qu'ils travaillent dans de petits ensembles de types de moteurs similaires et mixtes. Comparativement moins est compris sur les mécanismes qui coordonnent l'activité et la motilité émergente ultime de ces ensembles5,6. Cette lacune de connaissances est due, en partie, à la difficulté de créer des ensembles avec des caractéristiques contrôlables, telles que le type de moteur et le numéro de copie. Au cours de la dernière décennie, les techniques de construction moléculaire de l'origami d'ADN ont été employées pour résoudre ce problème. Pour les moteurs à base de microtubules, quelques exemples de ces études incluent des observations de molécules uniques d'ensembles de dyneine cytoplasmique-17,8,9, dynein intraflagellar11, divers moteurs kinesin12,13, et des mélanges de dyneins et kinesins7,14,15. Ici, nous fournissons des détails de la purification et l'étiquetage oligonucléotide des moteurs de levure7,16,17,18,19,20, le le pliage et la purification de l'origami d'ADN segmenté avec la conformité réglable8,et l'imagerie des moteurs de levure propulsant les structures de châssis7,18.

La construction d'ensembles moteurs pour l'observation in vitro d'une seule molécule nécessite trois efforts primaires. La première est l'expression, la purification et l'étiquetage des constructions motrices adaptées à l'attachement à l'origami d'ADN. La seconde est la production et la purification de structures d'origami d'ADN définies (souvent appelées « châssis »). Et le troisième est la conjugaison des moteurs à la structure du châssis suivie d'une observation à l'aide d'une microscopie interne totale par fluorescence de réflexion (TIRF). Ici, nous fournissons des protocoles établis pour ce processus pour les moteurs recombinants à base de microtubule purifiés à partir de la levure Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. Des ensembles moteurs à base d'origami d'ADN ont été étudiés à l'aide de la kinésie recombinante15 et de la dyneine7,8,18 constructions produites dans ce système d'expression de levure16 ,17,18,19. Ce protocole est valable pour ces constructions, étant donné qu'elles sont contrôlées par le promoteur induit par le galactose, et fusionnées aux mêmes étiquettes protéiques pour la purification (lien de protéase ZZ et TEV) et pour la conjugaison d'oligo d'ADN (SNAPtag).

Des souches de levure spécifiques produisent des constructions motrices spécifiques. Par exemple, la dyneine utilisée pour étudier le rôle de la conformité au fret a été purifiée à partir de la souche RPY10847,8. En général, les souches contenant des constructions motrices avec les modifications génétiques appropriées pour l'expression et la purification peuvent être demandées aux laboratoires ayant publié l'utilisation de ces moteurs. Les constructions avec de nouveaux attributs tels que des mutations ou des étiquettes peuvent être faites en utilisant des techniques génétiques recombinantes, telles que la transformation de l'acétate de lithium21 et des kits commerciaux. Des protocoles détaillés pour la création de protéines motrices modifiées dans la levure pour des études sur une seule molécule ont été publiés19. En plus des moteurs fusionnés au SNAPtag, les oligos utilisés pour étiqueter les moteurs doivent être conjugués au substrat SNAP, benzylguanine (BG); protocoles précédemment publiés décrivent la formation et la purification des conjugués BG-oligo18. La stratégie globale décrite ici a également été utilisée pour les moteurs à base d'actine (voir les travaux précédents pour des exemples22,23,24), et les moteurs purifiés à partir d'autres organismes et systèmes d'expression (voir les précédents travaux pour des exemples7,9,10,11,12,13,14).

Les microtubules polymérisés (MT) sont utilisés dans ces expériences dans deux procédures différentes. La purification d'affinité de MT des moteurs fonctionnels exige des MT qui ne sont pas étiquetés avec d'autres groupes fonctionnels, alors que l'analyse de motilité de motilité de moteur DEF exige des MTs étiquetés avec la biotine et les fluorophores. Dans tous les cas, les TM sont stabilisés avec le taxol pour prévenir la dénaturation. L'étape de purification d'affinité MT est utilisée pour enlever tous les moteurs non-motiles avec une forte affinité MT, car ces moteurs peuvent modifier la motilité d'ensemble si conjugué à un châssis. Pendant ce processus, les moteurs actifs délient les MT et restent en solution, tandis que les moteurs serrés se déversent dans le granule MT. Cela permet de s'assurer que tous les moteurs sur le châssis sont d'une population active.

Une variété de structures d'origami d'ADN ont été employées pour étudier des ensembles cytosquelettiques de moteur. Au fur et à mesure que la compréhension mécaniste du transport d'ensemble s'est accrue, les structures d'origami d'ADN utilisées dans les expériences se sont développées en complexité. En principe, toute structure pourrait être adaptée à cette fin à condition qu'elle soit modifiée pour inclure des sites d'attachement à l'ADN à brin unique pour les moteurs et les fluorophores. Des conceptions et des attributs spécifiques de châssis peuvent être utiles pour sonder des questions particulières sur le comportement émergent des ensembles de moteurs. Par exemple, des tiges rigides ont été utilisées pour développer des connaissances de base sur la façon dont le numéro de copie affecte le transport par des équipes de dyneins et de kinésies7,15,18, et des plates-formes 2D ont été utilisées pour étudier l'ensemble de myosine navigation des réseaux d'actine22. Des structures à la flexibilité variable ou réglable ont été utilisées pour comprendre les rôles du couplage élastique entre les moteurs et pour sonder comment la synchronisation des pas affecte la motilité8,24. Plus récemment, des structures sphériques sont utilisées pour mieux comprendre comment les contraintes géométriques de la liaison de la voie motrice affectent la dynamique de la motilité25.

Dans ce protocole, nous proposons des étapes spécifiques pour des expériences d'ensemble sur châssis segmenté avec rigidité variable. Les sites de liaison sur le châssis sont parfois appelés « poignées », tandis que les séquences d'ADN complémentaires qui lient ces poignées sont appelées « antihandles ». Le nombre de moteurs sur ces châssis est déterminé par les segments qui contiennent des agrafes de poignée étendues avec complémentarité à l'oligo antihandle sur les moteurs liquéfonnés oligo. L'utilisation de différentes séquences de poignée sur différents segments permet de lier différents types de moteurs à des endroits spécifiques sur le châssis. Le châssis détaillé ici est composé de 7 segments rigides séquentiels, chacun composé de 12 hélices d'ADN à double brin disposées en 2 anneaux concentriques8. Les segments rigides contiennent les poignées motrices et sont reliés à travers des régions qui peuvent être soit flexibles à l'ADN à brin unique, soit de l'ADN rigide à double brin, selon l'absence ou la présence, respectivement, d'agrafes de « liaison ». La conformité de la structure du châssis est donc déterminée par la présence ou l'absence de ces agrafes "linker". Voir les rapports précédents pour plus de détails et des séquences d'ADN spécifiques8. En outre, plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour purifier châssis26. La méthode de centrifugation de gradient de gradient de glycérol de taux-zonal27 est décrite ici.

Protocole

1. Croissance, expression et récolte des protéines motrices contrôlées par un promoteur induit par le galactose

  1. À l'aide d'une plaque de culture à levures-peptone-dextrose (YPD) et d'un bâton inoculation stérile, la strie désirée de la souche de levure congelée et incuber pendant 3-4 jours à 30 oC.
  2. Jour 1 de la croissance de la culture: Dans l'après-midi, ajouter 10 ml de médias de culture YP avec 2% dextrose à un tube de culture de verre de 1" de diamètre et l'inoculer avec une seule colonie de la plaque. Cultivez dans un tambour à rouleaux en rotation rapide à 30 oC pendant la nuit.
  3. Jour 2: Dans l'après-midi, transférer les 10 ml de culture à un flacon de 250 ml contenant 50 ml de médias de culture YP avec 2% de raffinose. Incuber pendant la nuit à 30 oC tout en secouant à 250 tr/min sur un shaker orbital.
  4. Jour 3: Dans l'après-midi, transférer les 60 ml de culture à un flacon de 3 L contenant 1 L de médias de la culture YP avec 2% galactose. Incuber pendant la nuit à 30 oC tout en secouant à 250 tr/min sur un shaker orbital.
  5. Jour 4: À partir du milieu de la matinée, surveiller la densité optique (OD) de la culture à 600 nm tous les 2 h. Lorsque la culture se situe entre un OD 1.5 et 2, continuez avec les étapes suivantes pour récolter les cellules. La récolte en dehors de cette plage d'OD peut réduire le rendement dû à une faible numération cellulaire avant oD 1.5, ou la quiescence cellulaire et la dégradation des protéines au-dessus de l'OD 2.
  6. Décantez la culture cellulaire en bouteilles de centrifugeuse et faites tourner à 6200 x g à 4 oC pendant 8 min. Verser le supernatant et jeter.
  7. Resuspendre la pastille cellulaire dans la bouteille avec H2O à double distillation (ddH2O).
  8. Faire tourner les cellules à 6200 x g à 4 oC pendant 8 min. Verser le supernatant et jeter.
  9. Selon la viscosité de la pastille cellulaire, ajouter jusqu'à 2 ml de ddH2O pour créer une solution suffisamment fluide pour le tuyauterie.
  10. À l'aide d'un contrôleur de pipette motorisé équipé d'une pipette de 10 ml, distribuez lentement la boue cellulaire en azote liquide une goutte à la fois. Cela produira des granulés congelés de cellules de levure.
  11. Conserver les cellules congelées à -80 oC jusqu'au moment de le purifier.

2. Purification des protéines motrices des cellules de levure

  1. Lyse cellulaire et extraction de protéines solubles
    1. Préparer 1 ml d'une nouvelle solution de 0,1 M PMSF en éthanol pur. Attendez d'ajouter le PMSF aux tampons aqueux car il est instable dans l'eau; aussi, évitez l'exposition à l'eau jusqu'à ce que dans les 20 min (la demi-vie approximative de PMSF dans l'eau) de l'utilisation.
    2. Préparer 50 ml de tampon de lyse 4x sur la glace avec des suppléments du stock 5x de tampon de lyse, mais ne pas ajouter PMSF jusqu'à ce que juste avant que le tampon est appliqué à la granule de levure.
    3. Broyer les granulés de levure liquides congelés à l'azote dans une poudre fine avec un moulin à café de type lame qui a été pré-réfrigéré avec de l'azote liquide.
      REMARQUE : Cette extraction de protéine commence typiquement avec le granule de cellules récolté de 2 L de culture de levure. La quantité de départ de la culture de levure peut être ajustée vers le haut ou vers le bas avec des ajustements proportionnés aux volumes des perles d'IgG et des oligos d'ADN dans les étapes 2.2.2 et 2.3.1 ci-dessous.
    4. Aliquot 15 ml de tampon de lyse 4x avec TNT et Mg-ATP sur la glace et ajouter PMSF à la mémoire tampon pour atteindre une concentration finale de 2 mM, complétant la préparation du tampon 4x lyse avec des suppléments.
    5. Recueillir la poudre de levure dans un bécher en verre préréfrigéré de 100 ml sur la glace. Ajouter un petit volume de la mémoire tampon 4x lyse avec des suppléments dans la poudre de sorte que la concentration finale de la mémoire tampon ne dépasse pas 1x. En règle générale, ajouter 1,5 ml de tampon pour chaque 10 ml de levure en poudre.
    6. Décongeler rapidement la poudre à la phase liquide en plaçant le bécher dans un bain d'eau de 37 oC en remuant constamment à l'aide d'une spatule.
    7. Placer le bécher de lysate sur la glace immédiatement après la décongélation, estimer le volume de lysate à l'aide d'un tube conique de 50 ml, et ajouter plus de tampon de lyse 4x avec des suppléments de sorte que la concentration finale du tampon est de 1x. Typiquement, 2 L de la culture de levure donne un total de 25-35 ml de lysate contenant 1x tampon de lyse.
    8. Répartir uniformément les bouteilles de lysate sur la glace. Équilibrez soigneusement les bouteilles à une différence de masse ne dépassant pas 0,01 g entre chaque paire, en veillant à ce que chaque bouteille soit supérieure au volume minimum requis pour éviter l'effondrement de la bouteille. Centrifugeuse à 290 000 x g pendant 25 min à 4 oC.
    9. Recueillir le supernatant contenant des protéines solubles dans un tube conique de 50 ml sur la glace, et jeter les granulés contenant des débris cellulaires et de grands organites. Évitez de recueillir les parties nuageuses du supernatant, car ils peuvent obstruer la colonne de gravité-flux utilisée dans les étapes suivantes. Enregistrer 10 L du supernatant pour l'analyse SDS-PAGE.
  2. Purification d'affinité IgG
    1. Pendant le tour ci-dessus, installez une colonne de chromatographie à flux gravitationnel sur la glace ou dans une chambre froide.
    2. Transférer 200 l de lisier de perles d'affinité IgG à 50 % sur la colonne à l'aide d'une pointe de pipette P-1000 coupée à l'aide d'une lame de rasoir pour agrandir le diamètre de son port d'entrée. Si vous purifiez plus ou moins de 2 L de granule de culture cellulaire, ajustez le volume de lisier de perles proportionnellement, avec un volume minimum de 100 L.
    3. Aliquot un autre 15 ml de la mémoire tampon de lyse 4x avec TNT et Mg-ATP et ajouter PMSF à la mémoire tampon pour atteindre une concentration finale de 2mM. Diluer le tampon 4x sur la glace à 1x en ajoutant ddH2O.
    4. Laver les perles 2x avec 5 ml de 1x tampon de lyse avec des suppléments.
    5. Resuspendre les perles en 200 l de 1x tampon de lyse avec des suppléments.
    6. Ajouter la suspension de perles à l'extrait de protéines obtenu à partir de centrifugation et incuber le mélange à 4 oC pendant 1 h avec une rotation douce.
    7. Pendant l'incubation, préparer 25 ml de tampon de lavage (recette détaillée dans le tableau 1) sur glace et 50 ml de tampon 1x TEV (recette détaillée dans le tableau 1) sur la glace.
    8. Après l'incubation de 1 h, filtrer le mélange de perles de lysate sur la glace ou dans la chambre froide à travers la même colonne de chromatographie utilisée à l'étape 2.2.2 ci-dessus. Enregistrer 10 L de l'aflux pour l'analyse SDS-PAGE.
    9. Laver les perles restantes à moteur sur de la glace 2x avec 5 ml de tampon de lavage. Enregistrer 10 ll du premier lavage pour l'analyse SDS-PAGE.
    10. Laver les perles sur la glace une fois avec 5 ml de tampon 1x TEV. Laissez le tampon s'écouler complètement de la colonne.
  3. Étiquetage avec oligonucléotides d'ADN et clivage TEV
    1. Retirez la colonne de chromatographie de la configuration et plafonnez le bas de la colonne. Dans la même colonne, incuber les perles motrices avec 100 oL de tampon TEV 1x contenant 10-20 M de BG-oligo purifié à température ambiante (RT) pendant 10-15 min. Si vous purifiez plus ou moins de 2 L de granule de culture cellulaire, ajustez le volume de 1x tampon TEV et purifié BG-oligos proportionnellement. Augmenter le temps d'incubation selon les instructions du fabricant si nécessaire pour augmenter le rendement et le taux d'étiquetage des moteurs, mais sachez que des temps d'incubation plus longs peuvent également augmenter la proportion de moteurs dysfonctionnels en raison de la dénaturation des protéines à RT.
    2. Resuspendre délicatement les perles chaque minute de l'incubation.
    3. Laver les perles motrices étiquetées 4x avec 4 ml de tampon 1x TEV en utilisant la même colonne de chromatographie et la configuration comme avant. Laisser le lavage final s'écouler complètement de la colonne.
    4. Enfoncez le bas de la colonne, suspendez les perles motrices dans un plus de 200 L de 1x TEV Buffer, et transférez-les dans un tube microcentrifuge à fond rond de 2 ml.
    5. Incuber la suspension avec 0,3 unité de protéase TEV par l de mélange de perles motrices à 16 oC pendant 1 h avec des rotations douces. Le tube doit être monté de afin de minimiser la surface totale du tube avec lequel les perles entrent en contact.
    6. Centrifuger le tube dans un microcentrifugeà 21 130 x g pour 30 s dans une chambre froide pour concentrer le mélange au fond du tube.
    7. Toujours dans la chambre froide, utilisez une pointe de pipette P-1000 coupée pour transférer le mélange à une colonne de spin et à une centrifugeuse à 21 130 x g pour 30 s. Recueillir le filtrate contenant les moteurs purifiés clivés par TEV. La protéase TEV sera dans le filtrate ainsi que les moteurs.
    8. Enregistrer 10 L du filtrate pour l'analyse SDS-PAGE. Aliquot le filtrate restant en volumes de 2 L pour les expériences TIRF ou de 50 l pour la purification de l'affinité microtubule. Congeler les aliquots dans de l'azote liquide et les stocker à -80 oC.
    9. Resuspendre les perles restantes dans le filtre dans le tampon 1x TEV pour l'analyse SDS-PAGE. Utilisez le même volume de tampon TEV 1x que dans l'étape 2.3.4 ci-dessus.

3. Polymérisation microtubule (MT)

  1. Préparation des mélanges de tubuline pour les essais TIRF
    1. Dans une chambre froide, dissoudre séparément la tubuline lyophilisée de chaque type (tubuline bovine non étiquetée, tubuline biotinylated et tubuline fluorescente) dans le tampon de reconstitution (recette détaillée dans le tableau 2) pour faire une concentration finale de 10 mg/mL. Laisser s'asseoir sur la glace pendant 10 min.
      1. Mélanger les composants suivants et laisser s'asseoir sur la glace pendant 10 min dans la chambre froide (les concentrations finales sont indiquées parenthèses) : 18 l de tubuline bovine (8,2 mg/mL), 2 l de tubulin biotinylated (0,9 mg/mL) et 2 l de tubulin fluorescent (0,9 mg/mL).
    2. Préparer 3 aliquots L du mélange de tubuline et geler le flash dans l'azote liquide. Conserver les mélanges à -80 oC.
  2. Préparation de la tubuline pour la purification d'affinité MT des moteurs
    1. Dans une chambre froide, dissoudre la tubuline bovine lyophilisée dans le tampon de reconstitution pour faire une concentration finale de 10 mg/mL. Laisser s'asseoir sur la glace pendant 10 min.
    2. Préparer 3 aliquots L du mélange de tubuline et geler le flash dans l'azote liquide. Conserver les mélanges à -80 oC.
  3. Polymérisation de la tubuline en MTs
    1. Retirer un aliquot de 3 l de tubuline du congélateur de -80 oC et décongeler très rapidement et brièvement à la phase liquide en maintenant le fond du tube. Placer immédiatement sur la glace et incuber pendant au moins 3 min.
    2. Couche délicate de 3 l de mélange de polymérisation 2x (recette détaillée dans le tableau 2) au-dessus de la solution de tubulin. Mélanger en faisant glisser doucement le tube, mais ne pas mélanger par pipetting, car les forces de cisaillement peuvent perturber la nucléation et l'allongement MT.
    3. Incuber le mélange dans un bain d'eau à 37 oC pendant 30 min.
    4. Couche délicate 6 l de RT 1x BRB80 avec des suppléments (recette détaillée dans le tableau 2) sur le dessus et mélanger en clignotant. Ne pas mélanger par pipetting.
    5. Incuber le mélange à 37 oC pendant au moins 10 min.
    6. Procédez à la purification d'affinité MT, ou si vous faites des essais TIRF, incuber Les MT dans l'obscurité à RT pendant la nuit pour former des MT plus longs.
    7. Stockez les MT polymérisés pendant des semaines dans l'obscurité chez RT.

4. Purification d'affinité de Microtubule (MT)

  1. Enlèvement des tubulines non polymérisées par centrifugation
    1. Mélanger les composants suivants pour faire un coussin de glycérol de 60 % : 1x BRB80 (sans suppléments; recette détaillée dans le tableau 2), 20 M Taxol (dissous dans DMSO), 1 mM DTT et 60 % de glycérol.
    2. Transférer 60 l du coussin de glycérol dans un tube à ultracentrifuge. Couchez-la délicatement 12 L des MT non étiquetés polymérisés précédemment sur le dessus du coussin. Pour éviter le cisaillement des MT, transférez-les à l'aide d'une pointe de pipette coupée.
    3. Centrifuger le mélange à 97 300 x g à 22 oC pendant 15 min. Après la rotation, l'excès de tubuline reste dans la couche liquide supérieure, tandis que les MT forment une boulette au fond. Marquez le bord extérieur du tube avant la rotation pour aider à localiser la pastille, car la pastille peut ne pas être visible à l'œil nu.
    4. Retirez soigneusement la couche liquide (12 l) au-dessus du coussin de glycérol et économisez 10 L pour l'analyse SDS-PAGE.
    5. Rincer délicatement l'interface entre la couche liquide et le coussin avec 20 ll de 1x BRB80 avec des suppléments. Retirer et jeter le rinçant de 20 l.
    6. Retirez soigneusement le coussin de glycérol (60 l) et économisez 10 L pour l'analyse SDS-PAGE. Veillez à ne pas déranger la pastille MT.
    7. Rincer délicatement la pastille avec 60 l l de 1x BRB80 avec des suppléments (recette détaillée dans le tableau 2). Veillez à ne pas déranger la pastille MT. Jeter la solution de rinçant.
    8. Resuspendre le granule MT dans 24 'L de tampon de lyse Taxol-supplémenté (recette détaillée dans le tableau 3) à l'aide d'une pointe de pipette coupée.
  2. Purification des moteurs fonctionnels par chromatographie d'affinité mT
    1. Retirer de la levure deux aliquots de 50 l de levure purifiés du congélateur de -80C et décongeler rapidement jusqu'à la phase liquide. Placez immédiatement sur la glace.
    2. Ajouter les composants suivants à un nouveau tube d'ultracentrifuge dans l'ordre indiqué et incuber le mélange à RT pendant 10 min : (1) 100 l des moteurs purifiés à partir de levure, (2) 29 'L de mélange ATP/Taxol 5x (recette détaillée dans le tableau 3),puis (3) 12 l de MTs tran purifiés sferred avec une pointe de pipette coupée.
    3. Centrifuger le mélange à 97 300 x g et 22 oC pendant 15 min. Après la rotation, les moteurs fonctionnels restent dans le supernatant, et les MT forment une pastille, avec les moteurs non fonctionnels liés à eux.
    4. Recueillir le supernatant, le gel flash dans 2 aliquots ll, et le stocker à -80 oC.
    5. Enregistrer 10 L du supernatant pour l'analyse SDS-PAGE. Resuspendre la pastille en 141 l de 1x BRB80 pour l'analyse SDS-PAGE, aussi. Utilisez des normes protéiques, telles que l'actine, pour créer une courbe standard pour quantifier la concentration des moteurs purifiés comme précédemment détaillé17.
    6. Utilisez ces informations de concentration lors de la conjugaison des moteurs au châssis dans l'étape 6.1.3.

5. Production de châssis d'origami d'ADN segmenté

  1. Formation du châssis
    1. Commandez les oligonucléotides de base énumérés dans les tableauxpubliés précédemment 8 dans 96 plaques de puits mouillées à 250 M dans le tampon Tris, ou les sécher, puis les suspendre à 250 M avec tampon Tris.
    2. Créer un pool d'agrafes de base en mélangeant 5 ll de chaque agrafe de noyau (voir la table S1 dans Driller-Colangelo 20168).
    3. Créer un pool d'agrafes de liaison en mélangeant 5 ll de chaque agrafe de linker (voir table de base de liener dans Driller-Colangelo 20168).
    4. Créer un pool d'agrafes de liaison fluorophore en mélangeant 5 L de chaque agrafe de poignée de fluorophore (voir la table de poignée de fluorophore dans Driller-Colangelo 20168).
    5. Mélanger les réactions de pliage de 50 L avec les composants suivants : 1x Tampon de pliage ; 100 nM 8064 échafaudage; piscine de base de 600 nM; piscine de base de fluorophore de 600 nM; 9 M fluorophore brin (voir table anti-poignée fluorophore dans Driller-Colangelo 20168); pour chaque site de fixation moteur, soit 4,2 m brins de poignée étendus ou 600 brins nM sans poignées comme souhaité (voir la poignée moteur / table d'agrafes antipoignée dans Driller-Colangelo 20168); 600 nM linkers comme souhaité8; 6 mM mg mgCl2supplémentaires; et de l'eau.
    6. Pliez dans un cycleur thermique à l'aide du programme suivant : chauffage rapide à 80 oC, refroidissement par incréments d'un seul degré à 65 oC sur 75 min, puis refroidissement supplémentaire par incréments de degré unique à 30 oC sur 17,5 h.
    7. Testez la qualité de pliage sur un gel d'agarose de 2% en tampon TBE de 0,5x (voir tableau 4 pour la recette) complété par 11 mM mgCl2 et tache de gel d'ADN (voir Tableau des matériaux). Exécuter le gel en tampon 0.5x TBE complété avec 11 mM MgCl2 à 70 V pendant 60-90 min. Exécuter les gels dans un bain d'eau glacée ou dans une chambre froide pour éviter un chauffage excessif et la dénaturation ultérieure des structures de châssis.
    8. Imagez le gel à l'aide de conditions appropriées pour la tache de gel d'ADN utilisée à l'étape 5.1.7.
  2. Purification du châssis
    1. En fin d'après-midi, la veille de la purification, créez des gradients de glycérol en superposant doucement 80 L chacun de 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 % et 15 % de glycérol dans un tampon pliant 1x origami dans un tube de centrifugeuse (voir le tableau 4 pour la recette). Les limites entre les couches doivent être légèrement visibles.
    2. Incuber les gradients à 4 oC pendant la nuit.
    3. Le lendemain matin, ajoutez 45% de glycérol dans un tampon pliant 1x origami à la solution de châssis plié à une concentration finale de 10% de glycérol. Mélanger délicatement et superposer le dessus du gradient dans le tube de centrifugeuse.
    4. Faites tourner le gradient avec le châssis à 243 000 x g pendant 130 min à 4 oC.
    5. Recueillir 50 fractions de L du tube dans une direction de haut en bas.
    6. Jetez un gel d'agarose de 2% dans 0.5x tampon tBE complété avec 11 mM MgCl2 et tache de gel d'ADN.
    7. Chargez 5 ll de chaque fraction sur le gel et exécutez le gel dans le tampon de 0.5x TBE complété avec 11 mM MgCl2 pour 90-120 min à 70 V. Exécuter des gels dans un bain d'eau glacée ou dans une chambre froide pour empêcher le chauffage excessif et la dénaturation ultérieure des structures de châssis.
    8. Imagez le gel à l'aide de conditions appropriées pour la tache de gel d'ADN utilisée à l'étape 5.2.6.
    9. Sélectionnez des fractions pour de futures expériences qui présentent des structures monomériques bien repliées exemptes d'agrafes non incorporées.
    10. Concentrations quantifiées de fractions sélectionnées à l'aide de méthodes spectroscopiques appropriées, telles que l'absorption uv à 260 nm. Utilisez ces informations de concentration lors de la conjugaison des moteurs au châssis dans l'étape 6.1.3.

6. Faire des chambres d'assidus

  1. Faire une chambre d'assidule en collant deux bandes de ruban adhésif recto-verso sur une lame de verre et en plaçant un bordereau sur le dessus. La chambre est l'espace étroit pris en sandwich entre la couverture et la glissière de verre, flanqué e des deux bandes de ruban adhésif. La figure 1 illustre la chambre d'assidu.
  2. Lors de la préparation de la diapositive avec des solutions, utilisez une pipette pour couler tout liquide dans la chambre d'un côté, et utilisez une bande de papier filtre pour recueillir le flux du fluide de l'autre côté.

7. Motor-ensemble motility TIRF assay

  1. Conjuguation des moteurs au châssis d'ADN
    1. Sur la glace, préparer un brin frais de BRB80 à la TNT, un tampon de lyse complété par Taxol et un tampon de lyse à supplément de caséine-taxol (recettes détaillées dans le tableau 5). Transférer 200 l de chaque tampon sur un tube RT.
    2. Toujours sur la glace, utilisez le tampon de lyse à base de caséine froide-Taxol pour préparer les mélanges d'énergie 4x et 4x (recettes détaillées dans le tableau 5).
    3. Incuber 10 moteurs purifiés de 300 nM avec 5 x L de châssis d'ADN de 10 nM sur glace pendant 15-30 min. Ces concentrations de moteurs ont été montrées pour saturer les sites de liaison moteur du châssis pour ce temps d'incubation.
      REMARQUE: l'occupation du moteur n'est pas de 100%, probablement en raison de stochastically manquant agrafes de poignée dans les structures de châssis individuels8,28.
    4. Pendant l'incubation, diluer la nanotine et le fluorophore étiqueté SM 100x avec le tampon de lyse complété par RT Taxol, et préparer une résine de filtration de gel appropriée pour la chromatographie de colonne d'exclusion de taille en suivant la procédure décrite ci-dessous.
  2. Retrait des moteurs excédentaires des conjuguations moteur-chassis par chromatographie de colonne d'exclusion de taille
    1. Dans un tube conique de 50 ml, laver 5 ml de résine de filtration de gel 2x avec 45 ml de ddH2O. Pour chaque lavage, mélanger la résine avec de l'eau dans le tube conique, et faire tourner le mélange à 460 x g pendant 1 min. Jeter le supernatant et conserver la résine.
    2. Laver la résine 2x avec 45 ml de tampon de lyse 1x (recette détaillée dans le tableau 5) en utilisant la même méthode décrite ci-dessus.
    3. Resuspendre la résine lavée dans un tampon de lyse 1x dans un rapport 1:1, de sorte que la résine devienne une boue de 50% dans le tampon. La résine lavée peut être stockée à 4 oC pendant au moins 1 mois.
    4. Transférer 800 l de la suspension de résine sur une colonne de spin. Égoutter l'excès de tampon par débit de gravité pendant 5 min. Enlevez tout tampon restant avec un spin de 2 s à 1 000 x g. Le volume final de résine devrait être d'environ 350-400 l.
    5. Diluer le mélange moteur-chassis avec le tampon de lyse corsé-Taxol-supplémenté à un volume final de 50 L. Transférer le mélange dilué à la colonne de spin emballée avec de la résine.
    6. Centrifuger la colonne de spin à 1000 x g pour 6 s (cette fois est inclus dans le temps d'accélération et de décélération). Recueillir les conjugués purmoteur-chassis en sauvant le filtrate et jeter la colonne qui conserve les moteurs excédentaires.
  3. Préparation de diapositives pour l'imagerie
    1. Flux de 13 'L de 1 mg/mL d'albumine bovine biotinylated de sérum (biotine-BSA) dans une chambre d'analyse de diapositive. Incuber pendant 2 min pour permettre la liaison de BSA au verre.
    2. Laver la chambre 2x avec 20 l de la RT DTT-supplémenté BRB80 en coulant dans le tampon d'un côté de la chambre et en évacuant l'excès de liquide loin de l'autre côté à l'aide d'une bande de papier filtre.
    3. Flux dans 20 'L de 0.5 mg/mL streptavidin. Incuber pendant 2 min pour permettre la liaison de la streptavidine à la biotine sur le BSA.
    4. Laver la chambre 2x avec 20 l de la mémoire tampon de lyse complétée par RT Taxol.
    5. Couler doucement dans 20 L des MT dilués avec une pointe de pipette coupée. Incuber pendant 2 min pour permettre la liaison entre la biotine sur les MT et la streptavidine.
    6. Laver 2x avec 20 l de la thésis tampon de lyse complétée par la caséine-taxol-supplémentée de RT. Incuber pendant 2 min pour permettre à la caséine d'imprégner toute la chambre.
    7. Diluer le moteur-chassis purifié conjugue 5x à 10x à des conditions monomolécules (10-100 pM) avec le tampon de lyse à la caséine-taxol froide. Mélanger les composants suivants pour produire un mélange moteur-chassis final : 10 L de la dilution moteur-chassis, 5 l de mélange d'énergie 4x, et 5 L de mélange de charognard 4x.
    8. Flux dans 20 OL du mélange moteur-chassis final à la chambre de diapositive d'analyse et procéder à la microscopie TIRF.
  4. Imagerie et acquisition de données
    1. Imagez la diapositive immédiatement à l'effile avec un microscope TIRF. En règle générale, chaque diapositive reste utilisable pendant entre 30 et 60 min.
    2. Acquérir une image fixe dans le canal MT, et un film dans le canal châssis. Pour les moteurs de ce protocole, 10 min de films avec un taux d'image de 0,5 fps et un temps d'exposition de 200 ms sont appropriés.
    3. À partir du film de châssis, générer un kymographe pour chaque MT dans ImageJ ou un logiciel de traitement d'image similaire29. Analyser les vitesses et les longueurs de course des ensembles de moteurs-chassis en mesurant les pentes et les distances horizontales des pistes sur le kymographe30.

Résultats

Les purifications réussies des moteurs et des structures de châssis ont été astoyfées par l'électrophorèse de gel. L'analyse SDS-PAGE a confirmé le succès de l'extraction de la dyneine à partir de levure (Figure 2), car le filtrate final recueilli à l'étape 2.3.7 montrait une bande claire et nette à la position de 350 kDa. Comme prévu, cette bande de dynein eétait absente du débit et du lavage qui enlevaient les protéines indésirables, et le...

Discussion

Les techniques de construction moléculaire de l'origami d'ADN fournissent une manière unique de construire des ensembles de moteur avec des architectures définies, des nombres de moteur, et des types, permettant des études de la façon dont le comportement émergent provient des configurations spécifiques de moteur31. Alors que les études structurelles et cellulaires continuent d'élucider des exemples de moteurs cytosquelettiques travaillant en équipe, les techniques d'isoler et d'étudier...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions K. Chau, J. Morgan et A. Driller-Colangelo d'avoir contribué aux techniques du châssis d'origami d'ADN segmenté. Nous remercions également les anciens membres des laboratoires Reck-Peterson et Shih pour les discussions utiles et les contributions au développement original de ces techniques. Nous remercions J. Wopereis et le Smith College Center for Microscopy and Imaging et L. Bierwert et le Smith College Center for Molecular Biology. Nous remercions le programme d'IRM NSF pour l'acquisition d'un microscope TIRF.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL Round Bottom TubeUSA Scientific1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pureCytoskeleton.comT333P-A
Biotin-BSASigmaA8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mmBeckman Coulter356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mmBeckman Coulter355603
Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mLGE Healthcare17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, emptyBio-Rad7326204EDU
P8064 ScaffoldTilibit2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography ColumnsBio-Rad731-1550
ProTev ProteasePromegaV6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenseramazon.comN/A
Sephacryl S-500 HRGE Healthcare17061310
StreptavidinThermo Fisher434302
SYBR Safe DNA stainInvitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brainCytoskeleton.comT240-B
Tubulin, HiLyte 647Cytoskeleton.comTL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge TubesBeckman Coulter344090

Références

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