Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Resumo

O objetivo deste protocolo é formar conjuntos de motores moleculares em nanoestruturas de DNA origami e observar a motilidade do conjunto usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total.

Resumo

Os motores do citoesqueleto são responsáveis para uma grande variedade de funções em pilhas eucarióticas, incluindo o mitosis, o transporte da carga, a motilidade celular, e outro. Muitas dessas funções exigem motores para operar em conjuntos. Apesar de uma riqueza de conhecimento sobre os mecanismos dos motores citoesqueléticos individuais, comparativamente menos se sabe sobre os mecanismos e comportamentos emergentes de conjuntos de motores, exemplos dos quais incluem mudanças na processividade do conjunto e velocidade com alterando o número do motor, a localização e a configuração. A nanotecnologia de DNA estrutural, e a técnica específica de DNA origami, permite a construção molecular de arquiteturas bem definidas de conjuntos de motores. A forma das estruturas da carga assim como o tipo, o número e a colocação dos motores na estrutura podem tudo ser controlados. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para produzir estes conjuntos e observá-los usando a microscopia de fluorescência interna total da reflexão. Embora essas técnicas tenham sido especificamente aplicadas para os motores citoesqueléticos, os métodos são generalizáveis para outras proteínas que se reúnem em complexos para realizar suas tarefas. Globalmente, o método de DNA origami para a criação de conjuntos bem definidos de proteínas do motor fornece uma poderosa ferramenta para dissecação dos mecanismos que levam ao comportamento motile emergente.

Introdução

A dynein e a cinesina são proteínas do motor citoesquelético responsáveis por inúmeras funções em células eucarióticas¹. Convertendo a energia química da hidrólise de ATP em trabalho produtivo, estes motores translocam em microtúbulos para transportar e distribuir várias cargas intracelulares. Eles também coordenam os rearranjos intracelulares maciços associados à mitose, onde exibem forças orquestradas que contribuem para o posicionamento e separação dos cromossomas. Ensaios estruturais, bioquímicos e biofísicos, incluindo observações de moléculas únicas, revelaram os mecanismos desses motores no nível individual (bem revisado em trabalhos anteriores^2,3,4). No entanto, muitas das tarefas dos motores exigem que trabalhem em pequenos conjuntos de tipos de motor semelhantes e mistos. Comparativamente menos é compreendido sobre os mecanismos que coordenam a atividade e a motilidade emergente final destes conjuntos^5,6. Essa lacuna de conhecimento é devida, em parte, à dificuldade em criar conjuntos com características controláveis, como tipo de motor e número de cópia. Durante a última década, as técnicas de construção molecular de DNA origami têm sido empregadas para resolver este problema. Para os motores baseados em microtúlulas, alguns exemplos dessas investigações incluem a única molécula de observações de conjuntos de dynein citoplasmático-1^7,8,9, dynein intraflagellar¹¹, vários motores de cinesina^12,13, e misturas de ambos os dyneins e kinesins^7,14,15. Aqui, nós fornecemos detalhes da purificação e oligonucleotide rotulagem de motores de levedura^{7,16,17,18,19,20}, o dobradura e purificação de origami de DNA segmentada com conformidade sintonável⁸, e a imagem dos motores de levedura impulsionando as estruturas do chassi^7,18.

Construir conjuntos de motor para a observação in vitro da molécula única exige três esforços preliminares. O primeiro é a expressão, purificação e rotulagem de construções motoras adequadas para anexar ao DNA origami. O segundo é a produção e purificação de estruturas de origami DNA definido (muitas vezes denominado "chassis"). E a terceira é a conjugação dos motores à estrutura do chassi seguida da observação usando a microscopia interna total da fluorescência da reflexão (TIRF). Aqui, nós fornecemos protocolos estabelecidos para este processo para os motores microtubule-baseados de recombinação purificados do fermento Saccharomyces cerevisiae^{7,16,17,18, 19}. os conjuntos de motor baseados em Origami de DNA foram investigados usando ambos os cinesina recombinante¹⁵ e dynein^7,8,18 construções produzidas neste sistema de expressão de levedura^{16 ,17,18,19}. Este protocolo é válido para estas construções, dado que são controlados pelo promotor induzido galactose, e fundidos aos mesmos Tag da proteína para a purificação (linker do protease de ZZ e de TEV) e para a conjugação do oligo do ADN (SNAPtag).

Cepas específicas de levedura produzem construções motoras específicas. Por exemplo, o dynein usado para estudar o papel da conformidade da carga foi purified da tensão RPY1084^7,8. Em geral, as cepas contendo construções motoras com as modificações genéticas apropriadas para expressão e purificação podem ser solicitadas a partir dos laboratórios que publicaram o uso desses motores. Construções com novos atributos como mutações ou Tags podem ser feitas usando técnicas genéticas recombinantes, como a transformação de acetato de lítio²¹ e kits comerciais. Os protocolos detalhados para criar proteínas de motor modificadas no fermento para estudos da única molécula foram publicados¹⁹. Além dos motores que estão sendo fundidos ao SNAPtag, os oligos usados para rotular os motores devem ser conjugados ao substrato SNAP, a benzilguanina (BG); os protocolos previamente publicados descrevem a formação e a purificação de conjugados de BG-oligo¹⁸. A estratégia global descrita aqui também foi empregada para motores baseados em Actin (ver trabalhos anteriores para exemplos^22,23,24), e motores purificados de outros organismos e sistemas de expressão (ver anterior trabalhos para exemplos^{7,9,10,11,12,13,14}).

Microtúbulos polimerizados (MTs) são utilizados nestes experimentos em dois procedimentos diferentes. A purificação da afinidade do MT de motores funcionais exige o MTs que não são etiquetados com outros grupos funcionais, quando o ensaio do TIRF da motilidade do motor-Ensemble exigir o MTs etiquetado com a biotina e os Fluorophores. Em todos os casos, os MTs são estabilizados com Taxol para evitar a desnaturação. A etapa da purificação da afinidade do MT é usada para remover todos os motores não-motile com uma afinidade elevada do MT, porque estes motores podem alterar a motilidade do conjunto se conjugados a um chassi. Durante este processo, os motores activos desligam os MTs e permanecem em solução, enquanto os motores de ligação apertada giram para baixo no pellet MT. Isso ajuda a garantir que todos os motores do chassi sejam de uma população ativa.

Uma variedade de estruturas do origami do ADN foi usada para estudar conjuntos do motor do cytoesquelético. Como a compreensão mecanicista do transporte de Ensemble aumentou, as estruturas de DNA origami empregadas em experimentos têm crescido em complexidade. Em princípio, qualquer estrutura poderia ser adaptada para este fim, desde que seja modificada para incluir sítios de fixação de ADN de ligação única para motores e fluoróforos. Os projetos e os atributos específicos do chassi podem ser úteis para sondar perguntas particulares sobre o comportamento emergente de conjuntos dos motores. Por exemplo, hastes rígidas têm sido usadas para desenvolver o conhecimento fundamental de como o número de cópias afeta o transporte por equipes de dyneins e kinesins^7,15,18e 2D plataformas têm sido usadas para estudar miosina Ensemble navegação das redes actina²². As estruturas com flexibilidade variável ou sintonizável foram usadas para compreender as funções do acoplamento elástico entre motores e para sondar como a sincronização de piso afeta a motilidade^8,24. Mais recentemente, as estruturas esféricas estão sendo usadas para obter a introspecção em como as limitações geométricas à ligação da motor-trilha afetam a dinâmica da motilidade²⁵.

Neste protocolo, nós oferecemos etapas específicas para experiências do conjunto no chassi segmentado com rigidez variável. Os locais de ligação no chassi são chamados às vezes como "punhos", quando as seqüências complementares do ADN que ligam estes punhos forem denominadas "antihandles". O número de motores nestes chassis é determinado pelo qual os segmentos contêm grampos extendidos do punho com complementaridade ao oligo do antihandle nos motores oligo-etiquetados. O uso de diferentes sequências de alça em diferentes segmentos permite a vinculação de diferentes tipos de motores a locais específicos no chassi. O chassi detalhado aqui é compor de 7 segmentos rígidos sequenciais, cada um compreendido de 12 hélices dobro-encalhado do ADN arranjados em 2 anéis concêntricos⁸. Os segmentos rígidos contêm os punhos do motor e são conectados através das regiões que podem ser o ADN único-encalhado flexível ou o ADN dobro-encalhado rígido, dependendo da ausência ou da presença, respectivamente, de grampos do "linker". A conformidade da estrutura do chassi é determinada assim pela presença ou pela ausência destes grampos do "linker". Veja os relatórios precedentes para mais detalhes e seqüências específicas⁸do ADN. Além disso, vários métodos podem ser usados para purificar o chassi²⁶. O método de centrifugação de gradiente de glicerol taxa-zonal²⁷ é descrito aqui.

Protocolo

1. crescimento, expressão e colheita de proteínas motoras controladas por um promotor induzido por galactose

1. Usando uma placa de cultura de levedura-peptona-dextrose (YPD) e uma vara de inocular estéril, raia desejada estirpe de levedura congelada e incubar por 3-4 dias a 30 ° c.
2. Dia 1 de crescimento da cultura: na parte da tarde, adicione 10 mL de mídia de cultura YP com dextrose a 2% a um tubo de cultura de vidro de 1 "de diâmetro e inocula-o com uma única colônia da placa. Cresça em um cilindro ràpida de giro do rolo em 30 ° c durante a noite.
3. Dia 2: na parte da tarde, transfira os 10 mL de cultura para um balão de 250 mL contendo 50 mL de meios de cultura YP com 2% de raffinose. Incubar durante a noite a 30 ° c enquanto treme a 250 rpm em um agitador orbital.
4. Dia 3: na parte da tarde, transfira o 60 mL de cultura para um balão de 3 L contendo 1 L de meios de cultura YP com 2% de galactose. Incubar durante a noite a 30 ° c enquanto treme a 250 rpm em um agitador orbital.
5. Dia 4: começando no meio da manhã, monitore a densidade óptica (OD) da cultura a 600 nm a cada 2 h. Quando a cultura está entre um OD 1,5 e 2, continue com as seguintes etapas para colher as células. A colheita fora desta escala do OD pode reduzir o rendimento devido às baixas contagens da pilha antes do OD 1,5, ou a degradação celular e a deterioração da proteína acima de OD 2.
6. Decantar a cultura da pilha em frascos do centrifugador e girar em ~ 6200 x g em 4 ° c por 8 min. derrame fora o sobrenadante e descarte.
7. Ressuscitem a pelota da pilha no frasco com H₂o dobro-destilado (DDH₂o).
8. Gire as células em ~ 6200 x g a 4 ° c por 8 min. Despeje o sobrenadante e descarte.
9. Dependendo da viscosidade do pellet celular, adicione até 2 mL de ddH₂o para criar um fluido de solução suficiente para pipetagem.
10. Usando um controlador motorizado da pipeta cabido com uma pipeta de 10 mL, dispense lentamente a pasta da pilha no nitrogênio líquido uma gota de cada vez. Isso produzirá pelotas congeladas de células de levedura.
11. Armazene as pilhas congeladas em-80 ° c até que apronte para purify.

2. purificação de proteínas do motor de células de levedura

1. Lise celular e extração de proteínas solúveis
   1. Prepare 1 mL de uma solução fresca de 0,1 M PMSF em etanol puro. Aguarde para adicionar o PMSF para buffers aquosos como ele é instável na água; também, evite a exposição à água até dentro de 20 min (a meia-vida aproximada de PMSF em água) de uso.
   2. Prepare 50 mL de 4x de tampão de Lise no gelo com suplementos do estoque 5x de tampão de Lise, mas não Adicione PMSF até pouco antes do buffer é aplicado para o pellet de levedura.
   3. Moer as pelotas de levedura de nitrogênio líquido congelado em um pó fino com um moedor de café tipo lâmina que foi pré-refrigerada com nitrogênio líquido.
      Nota: esta extração da proteína começa tipicamente com a pelota da pilha colhida de 2 litros da cultura do fermento. A quantidade inicial de cultura de levedura pode ser ajustada para cima ou para baixo com ajustes proporcionais aos volumes de contas de IgG e oligos de DNA nas etapas 2.2.2 e 2.3.1 abaixo.
   4. Alíquota 15 mL do tampão de lise de 4x com DTT e mg-ATP no gelo e adicionar PMSF para o tampão para atingir uma concentração final de 2 mM, completando a preparação do tampão de lise de 4x com suplementos.
   5. Colete o fermento em pó em um pre-refrigerado ~ 100 mL taça de vidro no gelo. Adicione um pequeno volume do tampão de Lise 4x com suplementos no pó para que a concentração final do tampão não exceda 1x. Normalmente, adicione ~ 1,5 mL do tampão para cada 10 mL de fermento em pó.
   6. Descongelar rapidamente o pó para a fase líquida, colocando o copo em um banho de água de 37 ° c com agitação constante usando uma espátula.
   7. Coloque a taça de lisado de volta no gelo imediatamente após o descongelar, estimar o volume de lisado usando um 50 mL tubo cônico, e adicionar mais 4x tampão de Lise com suplementos para que a concentração final do buffer é ~ 1x. Tipicamente, 2 litros de cultura de levedura produz um total de 25-35 mL de lisado contendo 1x tampão de Lise.
   8. Distribuir uniformemente o lisado para centrifugar garrafas no gelo. Balance cuidadosamente as garrafas para uma diferença de massa não superior a 0, 1 g entre cada par, assegurando que cada garrafa esteja acima do volume mínimo necessário para evitar o colapso do frasco. Centrifugador a ~ 290.000 x g durante 25 min a 4 ° c.
   9. Colete o sobrenadante contendo proteínas solúveis em um tubo cônico de 50 mL no gelo e descarte a pelota contendo detritos celulares e grandes organelas. Evite coletar quaisquer porções nebulosos do sobrenadante, pois eles podem obstruir a coluna de fluxo de gravidade usada em etapas subsequentes. Salvar 10 μL do sobrenadante para análise de SDS-PAGE.
2. Purificação da afinidade de IgG
   1. Durante a rotação acima, configurar uma coluna de cromatografia de fluxo de gravidade no gelo ou em uma sala fria.
   2. Transfira 200 μL de polpa de cordão de afinidade de IgG 50% para a coluna utilizando uma ponta de pipeta P-1000 cortada com uma lâmina de barbear para ampliar o diâmetro do seu porto de entrada. Se purificar mais ou menos de 2 L da pelota da cultura de pilha, ajuste o volume da pasta do grânulo proporcionalmente, com um volume mínimo de 100 μL.
   3. Alíquota mais 15 mL do tampão de lise de 4x com DTT e mg-ATP e Adicione PMSF ao tampão para alcançar uma concentração final de 2mM. Diluir o buffer 4x no gelo para 1x, adicionando ddH₂o.
   4. Lave as esferas 2x com 5 mL de tampão de Lise 1x com suplementos.
   5. Ressuspender os grânulos em 200 μL de tampão de Lise 1x com suplementos.
   6. Adicione a suspensão do cordão ao extrato proteico obtido da centrifugação e incubar a mistura a 4 ° c por 1 h com rotação suave.
   7. Durante a incubação, prepare 25 mL do tampão de lavagem (receita detalhada na tabela 1) no gelo e 50 ml de tampão de 1x TeV (receita detalhada na tabela 1) no gelo.
   8. Após a incubação de 1 h, filtre a mistura do lisado-grânulo no gelo ou na sala fria através da mesma coluna da cromatografia usada na etapa 2.2.2 acima. Guarde 10 μL do fluxo para análise de SDS-PAGE.
   9. Lave os restantes grânulos ligados ao motor no gelo 2x com 5 mL de tampão de lavagem. Guarde 10 μL da primeira lavagem para análise de SDS-PAGE.
   10. Lave as contas no gelo uma vez com 5 mL de tampão TEV 1x. Permitir que o buffer para drenar totalmente da coluna.
3. Etiquetagem com oligonucleotídeos de DNA e clivagem de TeV
   1. Remova a coluna de cromatografia da configuração e tampe a parte inferior da coluna. Dentro da mesma coluna, incubar as esferas do motor com 100 μL de tampão TEV 1x contendo 10-20 μM do BG-oligo purificado à temperatura ambiente (RT) por 10-15 min. Se purificar mais ou menos de 2 L de pellet cultura celular, ajustar o volume de 1x tampão TEV e purificada BG-oligos proporcionalmente. Aumente o tempo de incubação de acordo com as instruções do fabricante, se necessário, para aumentar o rendimento e a taxa de rotulagem do motor, mas esteja ciente de que os tempos de incubação mais longos também podem aumentar a proporção de motores disfuncionais devido à desnaturação de proteínas na RT.
   2. Ressuspender suavemente as contas a cada minuto da incubação.
   3. Lave o motor-grânulos rotulados 4x com 4 mL de 1x TEV buffer usando a mesma coluna de cromatografia e configuração como antes. Permitir que a lavagem final para drenar totalmente a partir da coluna.
   4. Tampe a parte inferior da coluna, ressuscite o motor-Beads em não mais de 200 μL de 1x tampão de TEV, e transfira a um tubo do microcentrifugador da redondo-parte inferior de 2 mL.
   5. Incubar a suspensão com ~ 0,3 unidades de protease de TEV por μL de mistura do motor-grânulo em 16 ° c para 1 h com rotações suaves. O tubo deve ser montado de modo a minimizar a área de superfície total do tubo com que as contas entram em contato.
   6. Centrifugue o tubo em um microcentrifugador em 21.130 x g por 30 s em uma sala fria para concentrar a mistura na parte inferior do tubo.
   7. Ainda na sala fria, use uma ponta de pipeta P-1000 cortada para transferir a mistura para uma coluna de giro e centrifugar a 21.130 x g por 30 s. recolher o filtrado contendo o TeV-cleaved, motores purificados. A protease de TEV estará no filtrado assim como nos motores.
   8. Guarde 10 μL do filtrado para análise de SDS-PAGE. Aliquot o filtrado remanescente em volumes de 2 μL para experimentos TIRF ou 50 μL para purificação de afinidade com microtúse. O flash congela as alíquotas em nitrogênio líquido e armazena a-80 ° c.
   9. Ressuscitar as contas restantes no filtro em 1x buffer TEV para análise de SDS-PAGE. Use o mesmo volume de 1x TEV buffer como na etapa 2.3.4 acima.

3. polimerização de microtubule (MT)

1. Preparação de misturas tubulina para ensaios TIRF
   1. Em uma sala fria, dissolva separadamente a tubulina liofilizada de cada tipo (tubulina bovina sem rótulo, tubulina biotinilada e tubulina fluorescente) no tampão de reconstituição (receita detalhada na tabela 2) para fazer uma concentração final de 10 mg/ml. Deixe sentar no gelo por 10 min.
      1. Misture os seguintes componentes e deixe sentar-se no gelo por 10 min na sala fria (as concentrações finais são indicadas parenticamente): 18 μL de tubulina bovina (~ 8,2 mg/mL), 2 μL de tubulina biotinilada (~ 0,9 mg/mL) e 2 μL de tubulina fluorescente (~ 0,9 mg/mL).
   2. Preparar 3 μL de alíquotas da mistura de tubulina e congelar o flash em azoto líquido. Conservar as misturas a-80 ° c.
2. Preparação do tubulina para a purificação da afinidade do MT dos motores
   1. Em uma sala fria, dissolva tubulina bovina liofilizada no tampão de reconstituição para fazer uma concentração final de 10 mg/mL. Deixe sentar no gelo por 10 min.
   2. Preparar 3 μL de alíquotas da mistura de tubulina e congelar o flash em azoto líquido. Conservar as misturas a-80 ° c.
3. Polimerização de tubulina em MTs
   1. Retire uma alíquota de 3 μL de tubulina do congelador-80 ° c e descongele muito rapidamente e brevemente para a fase líquida segurando a parte inferior do tubo. Imediatamente colocar no gelo e incubar por pelo menos 3 min.
   2. Mergulhe suavemente 3 μL de mistura de polimerização 2x (receita detalhada na tabela 2) em cima da solução de tubulina. Misture suavemente o tubo, mas não misture com pipetagem, pois as forças de cisalhamento podem interromper a nucleação e o alongamento da MT.
   3. Incubar a mistura num banho de água a 37 ° c durante 30 min.
   4. Gentilmente camada 6 μL de RT 1x BRB80 com suplementos (receita detalhada na tabela 2) em cima e misture por flicking. Não misture com pipetagem.
   5. Incubar a mistura a 37 ° c durante pelo menos 10 min.
   6. Prossiga para a purificação de afinidade MT, ou se fazendo ensaios TIRF, incubar MTs no escuro em RT durante a noite para formar mais MTs.
   7. Armazene MTs polimerizados por semanas no escuro em RT.

4. purificação da afinidade de microtubule (MT)

1. Remoção de tubulinas não polimerizadas por centrifugação
   1. Misture os seguintes componentes para fazer uma almofada de glicerol 60%: 1x BRB80 (sem suplementos; receita detalhada na tabela 2), 20 ΜM de Taxol (dissolvido em DMSO), 1 mm de dtt e 60% de glicerol.
   2. Transferir 60 μL da almofada de glicerol para um tubo ultracentlee. Mergulhe suavemente 12 μL dos MTs sem rótulo polimerizados anteriormente na parte superior da almofada. Para evitar o corte de MTs, transferi-los usando uma ponta de pipeta de corte.
   3. Centrifugue a mistura a ~ 97.300 x g a 22 ° c durante 15 min. Após o giro, os as excedentes permanecem na camada líquida superior, quando os MTS formarem uma pelota na parte inferior. Marque a borda externa do tubo antes da rotação para ajudar a localizar o pellet, como a pelota pode não ser visível a olho nu.
   4. Retire cuidadosamente a camada líquida (~ 12 μL) acima da almofada de glicerol e guarde 10 μL para análise de SDS-PAGE.
   5. Lave suavemente a interface entre a camada líquida e a almofada com 20 μL de 1x BRB80 com suplementos. Retire e elimine a enxaguadura de 20 μL.
   6. Retire cuidadosamente a almofada de glicerol (~ 60 μL) e guarde 10 μL para análise de SDS-PAGE. Tenha cuidado para não perturbar o pellet MT.
   7. Lave suavemente a pelota com 60 μL de 1x BRB80 com suplementos (receita detalhada na tabela 2). Tenha cuidado para não perturbar o pellet MT. Descarte a solução de enxágüe.
   8. Ressuscita o pellet MT em 24 μL de tampão de Lise suplementado com Taxol (receita detalhada na tabela 3) usando uma ponta de pipeta cortada.
2. Purificação de motores funcionais por cromatografia de afinidade baseada em MT
   1. Remover 2 50 μL de alíquotas de motores purificados de levedura do congelador-80C e descongelar rapidamente para a fase líquida. Imediatamente coloque no gelo.
   2. Adicione os seguintes componentes a um novo tubo ultracentlee na ordem indicada e incubar a mistura em RT por 10 min: (1) 100 μL dos motores purificados a partir de levedura, (2) 29 μL de 5x ATP/Taxol Mix (receita detalhada na tabela 3), então (3) 12 μL de Tran de MTS purificados transferidos com uma ponta da pipeta do corte.
   3. Centrifugue a mistura a ~ 97.300 x g e 22 ° c durante 15 min. Após a rotação, os motores funcionais permanecem no sobrenadante, e MTs formam uma pelota, junto com os motores não funcionais vinculados a eles.
   4. Colete o sobrenadante, o congelamento de flash em 2 μL de alíquotas e armazene a-80 ° c.
   5. Salvar 10 μL do sobrenadante para análise de SDS-PAGE. Ressuscite o pellet em 141 μL de 1x BRB80 para análise de SDS-PAGE, também. Use padrões proteicos, como a actina, para criar uma curva padrão para quantificar a concentração dos motores purificados como anteriormente detalhado¹⁷.
   6. Use esta informação de concentração ao conjugando motores ao chassi na etapa 6.1.3.

5. produção de chassis de origami de DNA segmentada

1. Formação de chassis
   1. Encomende os oligonucleotídeos de grampos listados nas tabelas previamente publicadas⁸ em 96 placas de poços molhadas a 250 μm em tampão Tris, ou seque e depois ressuscitem-as para 250 μm com tampão Tris.
   2. Crie um conjunto de grampos de núcleo misturando 5 μL de cada grampo de núcleo (ver tabela S1 no Driller-Colangelo 2016⁸).
   3. Crie um pool dos grampos do vinculador misturando 5 μL de cada grampo do vinculador (veja tabela de grampos do vinculador em Driller-Colangelo 2016⁸).
   4. Crie um conjunto de grampos de ligação de fluoróforo misturando 5 μL de cada grampo de punho de fluoróforo (ver tabela do punho do fluoróforo no Driller-Colangelo 2016⁸).
   5. Misture 50 μL de reações dobráveis com os seguintes componentes: 1x amortecedor dobrável; 100 nM 8064 andaime; 600 nM núcleo de piscina de grampo; 600 nm fluoróforo pool de grampos; vertente fluoróforo de 9 μM (ver tabela antipuxador fluoróforo no Driller-Colangelo 2016⁸); para cada local de ligação do motor, ou 4,2 μM estendeu vertentes do punho ou 600 fios do nanômetro sem punhos como desejado (Veja o punho do motor/tabela dos grampos do antihandle em Driller-Colangelo 2016⁸); 600 linkers nM como desejado⁸; adicional de 6 mM MgCl₂; e água.
   6. Dobre em um ciclador térmico usando o seguinte programa: aquecimento rápido a 80 ° c, refrigerar em incrementos do único grau a 65 ° c sobre 75 minutos, a seguir refrigerar adicional em incrementos do único grau a 30 ° c sobre 17,5 h.
   7. Qualidade de dobramento do ensaio em um gel do agarose de 2% no amortecedor de 0.5 x TBE (veja tabela 4 para a receita) suplementado com 11 milímetros MgCl₂ e mancha do gel do ADN (veja a tabela dos materiais). Funcione o gel no amortecedor de 0.5 x TBE suplementado com 11 milímetros MgCl₂ em 70 V para 60-90 minutos. funcione géis em um banho de água do gelo ou em uma sala fria para impedir o aquecimento excessivo e a desnaturação subseqüente de estruturas do chassi.
   8. Imagem o gel que usa as circunstâncias apropriadas para a mancha do gel do ADN usada na etapa 5.1.7.
2. Purificação de chassis
   1. No final da tarde, o dia antes da purificação, criar gradientes de glicerol por camadas suavemente 80 μL cada um dos 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, e 15% glicerol em 1x Origami Folding buffer em um tubo de centrífuga (ver tabela 4 para a receita). Os limites entre as camadas devem ser ligeiramente visíveis.
   2. Incubar gradientes a 4 ° c durante a noite.
   3. Na manhã seguinte, adicione 45% de glicerol em 1x Origami Folding buffer para a solução de chassi dobrado para uma concentração final de 10% de glicerol. Misture suavemente e camada na parte superior do gradiente no tubo de centrífuga.
   4. Gire o gradiente com o chassi em 243.000 x g por 130 min a 4 ° c.
   5. Colete 50 μL de frações do tubo em uma direção de cima para baixo.
   6. Molde um gel do agarose de 2% no amortecedor de 0.5 x TBE suplementado com 11 milímetros MgCl₂ e mancha do gel do ADN.
   7. Carregar 5 μL de cada fração no gel e correr gel em 0,5 x TBE tampão suplementado com 11 mM MgCl₂ para 90-120 min em 70 V. Run géis em um banho de água gelada ou em uma sala fria para evitar o aquecimento excessivo e subsequente desnaturação de estruturas de chassis.
   8. Imagem o gel que usa as circunstâncias apropriadas para a mancha do gel do ADN usada na etapa 5.2.6.
   9. Selecione frações para experimentos futuros que exibem estruturas monoméricas bem dobradas livres de grampos não incorporados.
   10. Concentrações quantificadas de frações selecionadas utilizando métodos espectroscópicos adequados, como a absorção de UV a 260 nm. Use esta informação de concentração ao conjugando motores ao chassi na etapa 6.1.3.

6. fazendo as câmaras do ensaio da corrediça

1. Faça uma câmara do ensaio da corrediça furando duas tiras da fita frente e verso a uma corrediça de vidro e coloc uma lamínula na parte superior. A câmara é o espaço estreito imprensado entre a lamínula e a corrediça de vidro, ladeada pelas duas tiras de fita. A Figura 1 ilustra a câmara de ensaio.
2. Ao preparar a corrediça com soluções, use uma pipeta para fluir todo o líquido na câmara de um lado, e use uma tira do papel de filtro para recolher o fluxo do líquido no outro lado.

7. ensaio da motilidade do motor-Ensemble TIRF

1. Conjugação de motores para chassis de DNA
   1. No gelo, prepare 1 mL cada um de BRB80 suplementado com DTT, tampão de Lise suplementado com Taxol e tampão de Lise suplementado com casein-Taxol (receitas detalhadas na tabela 5). Transfira 200 μL de cada tampão para um tubo RT.
   2. Ainda no gelo, use o tampão de lise de casein-Taxol-suplementado frio para preparar a energia 4x e as misturas do scavenger 4x (receitas detalhadas na tabela 5).
   3. Incubar 10 μL de ~ 300 nM de motores purificados com 5 μL de ~ 10 nM de chassis de ADN no gelo durante 15-30 min. Estas concentrações dos motores foram mostradas para saturar os locais de ligação do motor do chassi para este tempo da incubação.
      Nota: a ocupação do motor não é 100%, provavelmente devido aos grampos de punho em falta estocástica em estruturas individuais do chassi^8,28.
   4. Durante a incubação, diluir o MTs 100x de biotina e fluoróforo com o tampão de Lise suplementado com RT Taxol e preparar uma resina de filtração de gel adequada para cromatografia de coluna de exclusão de tamanho seguindo o procedimento descrito abaixo.
2. Remoção de excesso de motores de conjugados de chassis de motor por cromatografia de coluna de exclusão de tamanho
   1. Em um tubo cônico de 50 mL, lave 5 mL da resina de filtração de gel 2x com 45 mL de ddH₂o. Para cada lavagem, misture a resina com água no tubo cônico, e gire a mistura em 460 x g por 1 min. descarte o sobrenadante e salve a resina.
   2. Lave a resina 2x com 45 mL de tampão de Lise 1x (receita detalhada na tabela 5) usando o mesmo método descrito acima.
   3. Resuspend a resina lavada no tampão do lysis 1x em uma relação 1:1, de modo que a resina se torne um ~ 50% chorume no amortecedor. A resina lavada pode ser armazenada a 4 ° c durante pelo menos 1 mês.
   4. Transferir 800 μL da suspensão da resina para uma coluna de centrifugação. Drenar o buffer em excesso pelo fluxo de gravidade por 5 min. Remova qualquer buffer restante com uma rotação de 2 s em 1.000 x g. O volume final da resina deve ser em torno de 350-400 μL.
   5. Diluir a mistura motor-chassis com o tampão de Lise suplementado com caseína-Taxol para um volume final de 50 μL. Transfira a mistura diluída para a coluna de centrifugação embalada com resina.
   6. Centrifugue a coluna da rotação em 1.000 x g para 6 s (esta vez é inclusiva do tempo da aceleração e da retardação). Colete os conjugados puros do motor-chassi conservando o filtrado e rejeite a coluna que retém os motores excedentes.
3. Preparação de lâminas para imagens
   1. Fluxo de 13 μL de 1 mg/mL de albumina sérica de bovinos biotinilados (biotina-BSA) em uma câmara de ensaio deslizante. Incubar por 2 min para permitir a ligação de BSA ao vidro.
   2. Lave a câmara 2x com 20 μL do RT DTT-suplementado BRB80 fluindo no amortecedor em um lado da câmara e wicking o líquido adicional afastado do outro lado usando uma tira do papel de filtro.
   3. Fluxo em 20 μL de 0,5 mg/mL de streptavidin. Incubar por 2 min para permitir a ligação de estreptavidina à biotina na BSA.
   4. Lave a câmara 2x com 20 μL do tampão de Lise suplementado com Taxol RT.
   5. Flua suavemente em 20 μL do MTs diluído com uma ponta de pipeta cortada. Incubar por 2 min para permitir a ligação entre a biotina em MTs e streptavidin.
   6. Lave 2x com 20 μL do tampão de Lise suplementado com casein-Taxol-RT. Incubar por 2 min para permitir que a caseína permeiam a câmara inteira.
   7. Diluir os conjugados do motor-chassi purified 5x a 10x às condições da único-molécula (~ 10-100 pM) com o tampão casein-Taxol-suplementado frio do lysis. Misture os seguintes componentes para produzir uma mistura final do motor-chassi: 10 μL da diluição do motor-chassi, 5 μL da mistura da energia 4x, e 5 μL da mistura do scavenger 4x.
   8. Fluxo em 20 μL da mistura final do motor-chassi à câmara da corrediça do ensaio e prossiga à microscopia de TIRF.
4. Geração de imagens e aquisição de dados
   1. Imagem do slide imediatamente com um microscópio TIRF. Normalmente, cada slide permanece utilizável para entre 30 e 60 min.
   2. Adquira uma imagem imóvel no canal MT e um filme no canal do chassi. Para os motores neste protocolo, 10 min filmes com uma taxa de quadros de 0,5 fps e tempo de exposição de 200 MS são apropriadas.
   3. Do filme do chassi, gere um quimógrafo para cada MT em ImageJ ou um software de processamento de imagem similar²⁹. Analise as velocidades e execute comprimentos de conjuntos de chassis do motor medindo as inclinações e as distâncias horizontais das funcionamentos no quimógrafo³⁰.

Resultados

Purificações bem-sucedidas de motores e estruturas de chassis foram ensaiadas por eletroforese em gel. A análise de SDS-PAGE confirmou a extração bem sucedida de dynein do fermento (Figura 2), porque o filtrado final coletado na etapa 2.3.7 mostrou uma faixa desobstruída, afiada na posição de ~ 350 kDa. Como esperado, esta faixa do dynein era ausente do flowthrough e da lavagem que removeram proteínas indesejadas, e os grânulos de que o dynein foi c...

Discussão

As técnicas de construção molecular do DNA origami proporcionam uma maneira única de construir conjuntos de motores com arquiteturas definidas, números de motores e tipos, possibilitando estudos de como o comportamento emergente surge a partir de configurações específicas do motor³¹. Como os estudos estruturais e celulares continuam a elucidar exemplos de motores citoesqueléticos que trabalham em equipes, técnicas para isolar e investigar os mecanismos biofísicos e bioquímicos dos moto...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure	Cytoskeleton.com	T333P-A
Biotin-BSA	Sigma	A8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm	Beckman Coulter	356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm	Beckman Coulter	355603
Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL	GE Healthcare	17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty	Bio-Rad	7326204EDU
P8064 Scaffold	Tilibit	2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550
ProTev Protease	Promega	V6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenser	amazon.com	N/A
Sephacryl S-500 HR	GE Healthcare	17061310
Streptavidin	Thermo Fisher	434302
SYBR Safe DNA stain	Invitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain	Cytoskeleton.com	T240-B
Tubulin, HiLyte 647	Cytoskeleton.com	TL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge Tubes	Beckman Coulter	344090