Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.

Zusammenfassung

Nd:YAG-Laser werden seit mehreren Jahrzehnten zur Durchführung nichtinvasiver intraokularer Operationen wie Capsulotomie eingesetzt. Der prägnante Effekt beruht auf dem optischen Abbau am Laserfokus. Akustische Schockwellen und Kavitationsblasen werden erzeugt, was zu Gewebebrüchen führt. Blasengrößen und Druckamplituden variieren je nach Pulsenergie und Position des Brennpunkts. In dieser Studie wurden enukleierte Schweineaugen vor einem handelsüblichen Nd:YAG-Laser positioniert. Getestet wurden variable Pulsenergien sowie verschiedene Positionen der Brennpunkte hinter der Hornhaut. Die resultierenden Läsionen wurden durch Zwei-Photonen-Mikroskopie und Histologie bewertet, um die besten Parameter für eine exklusive Ablösung von Hornhaut-Endothelzellen (CEC) mit minimalen Kollateralschäden zu bestimmen. Die Vorteile dieser Methode sind die präzise Ablation der KEK, reduzierte Kollateralschäden und vor allem die berührungslose Behandlung.

Einleitung

Transparenz der Hornhaut ist wichtig für die Übertragung von Licht auf die Netzhaut und ihre Photorezeptoren¹. In dieser Hinsicht ist ein relativer Zustand der Dehydrierung entscheidend, um die Kollagenfasern innerhalb der Hornhautstroma richtig ausgerichtet zu halten. Diese Homöostase wird von hornhauten Endothelzellen (CEC) auf der Descemet-Membran (DM)²aufrechterhalten. Das Endothel ist die innerste Hornhautschicht. Es hat eine wichtige Barriere- und Pumpenfunktion, die für die Hornhauttransparenz³von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Epithel ist das Endothel nicht in der Lage,^{sich 4}zu erneuern. Daher stimuliert jede Durcherkrankung oder ein Trauma verursachte Zellschädigung die verbleibenden Endothelzellen, sich zu vergrößern und zu wandern, die resultierenden Defekte zu decken und die Hornhautfunktionalität aufrechtzuerhalten⁵. Wenn die CEC-Dichte jedoch unter einen kritischen Schwellenwert fällt, führt die Dekompensation des Endothels zu einem Ödem, was zu verschwommenem Sehen und Beschwerden oder sogar starken^Schmerzen4 führt. Trotz der Verfügbarkeit von Medikamenten zur Linderung von Symptomen ist derzeit die einzige definitive Behandlung in diesen Fällen die Hornhauttransplantation, die in Form eines Volldickentransplantats oder einer lamellaren Endotheltransplantation durchgeführt werden kann. Letzteres Verfahren ist als Descemet-Membran-Endothel-Keratoplastik (DMEK) sowie als Descemet-Abisolier-Automatik-Keratoplastik (DSAEK)⁶erhältlich. Der Schutz der verbleibenden KEK und die Verbesserung ihres Überlebens könnten jedoch ein alternatives Ziel sein, das ein angemessenes Krankheitsmodell benötigt, um potenzielle therapeutische Medikamente zu testen.

Aktuelle CEC-Verlustkrankheitsmodelle konzentrieren sich auf die Zerstörung des Endothels durch Injektion von toxischen Wirkstoffen (z.B. Benzalkoniumchlorid) in die Vorderkammer oder durch mechanischea Briesion der Zellen mit einer invasiven Descemetorhexis-Technik^7,8. Während diese Modelle gut etabliert sind, gibt es Nachteile wie allgemeine Entzündungsreaktionen und ungenaue Kollateralschäden. Daher stellen diese Modelle eher die Endstadien der Krankheit dar, wenn die oben genannten chirurgischen Optionen unvermeidlich sind.

Mit Fortschritten in zellulären Behandlungsstrategien wie Stammzellen und Gentherapie könnte die Anwendung dieser zellulären Therapien in frühen Stadien des CEC-Verlusts⁹nützlich sein. Anschließend brauchen wir ein Modell, das diese früheren Stadien der Krankheit angemessener darstellt. In dieser Hinsicht haben sich die Zellkulturmodelle in den letzten zehn Jahren verbessert, sind aber in ihrer Gültigkeit immer noch begrenzt, da Zellen in vitro nicht annähernd an die Replikation der komplexen Wechselwirkungen herankommen können, die zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Hornhaut¹⁰auftreten. Daher sind Ex-vivo- und In-vivo-Krankheitsmodelle nach wie vor sehr gefragt, und die Verbesserung der bestehenden sind von größtem Interesse.

Nichtinvasive, intraokulare Chirurgie durch Photodisruption mit einem Neodym:YAG (Nd:YAG) Laser ist seit seiner Einführung ende der 1970er Jahre weltweit zu einem Routineverfahren für Augenärzte weltweit geworden¹¹. Photodisruption beruht auf nichtlinearer Lichtabsorption, die zur Bildung von Plasma, der Erzeugung akustischer Stoßwellen und der Bildung von Kavitationsblasen führt, wenn sich der Einsatzort in einer flüssigen Umgebung befindet¹². Im Allgemeinen tragen diese Prozesse zur beabsichtigten Wirkung eines präzisen Gewebeschneidens bei. Sie können jedoch auch die Quelle unnötiger Kollateralschäden sein, die die lokale Einschließung der Laserchirurgie begrenzen¹³.

Die Vorhersage der resultierenden mechanischen Effekte hat sich durch die Charakterisierung der Stoßwellenausbreitung und des Kavitationsverlaufs deutlich verbessert. Unser Ziel ist es, die KEK mit möglichst geringen Schäden an umgebendem Gewebe ins Visier zu nehmen, um ein nichtinvasives, lasergestütztes experimentelles Krankheitsmodell für die frühen Stadien des CEC-Verlusts bereitzustellen. Dazu ist es notwendig, die optimalen Pulsenergien und Positionen der Brennpunkte des Lasers zu bestimmen.

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Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiergewebe beteiligt ist, folgen den Richtlinien der örtlichen Tierpflege- und Ethikkommission.

1. Vorbereitung der Organkultur und Laserbehandlung

1. Erhalten Sie frisch enucleatierte Schweineaugen aus dem lokalen Schlachthof. Halten Sie sie kühl (4 °C) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit hoher Glukose, ergänzt mit L-Glutamin, Natriumpyruvat, Penicillin/Streptomycin (1 %), und Schweineserum (10 %), fortan in diesem Artikel als vollmittel bezeichnet.
2. Entfernen Sie extrazelluläre Gewebe mit einer Schere und tränken Sie die Augen in 5% Povidon-Jod-Ophthalmologische Lösung für 5 min, bevor Sie sie in sterilisierte Phosphat-gepufferte Saline (PBS) bis zur Verwendung.
3. Bildschirmaugen für große vordere Segmentpathologien, wie Hornhautnarben, Ödeme und andere Trübungen mit einem spektral-domänenoptischen Kohärenztomographiegerät (Tabelle der Materialien).
4. Positionieren Sie die Augen vor einer Schlitzlampeneinheit, die mit einem Nd:YAG-Laser (Materialtabelle) ausgestattet ist, der eine Wellenlänge von 1.064 nm und einen Brennpunktdurchmesser von 10 m in der Luft hat.
   ANMERKUNG: Für eine optimale Positionierung wird ein 3D-gedrucktes Haltegerät verwendet, das entwickelt wurde, um das Auge fest zu halten, ohne zu viel Druck darauf auszuüben (Abbildung 1).
5. Verwenden Sie eine Vergrößerung von 12x und lenken Sie die Beleuchtung ab, um die einzelnen Hornhautschichten zu visualisieren.
6. Stellen Sie die Pulsenergie (z.B. 1,6 mJ) und den Fokuspunkt (z.B. 0,16 mm) für die selektive Ablation von Endothelzellen ein.
7. Legen Sie eine klare Hornhautparazenz in der Nähe des Limbus und injizieren viskolastisch (Tisch der Materialien) die vordere Kammer zu stabilisieren.
8. Verbrauchen Sie die laserbehandelte zentrale Hornhaut mit einem 8 mm Trephin.
9. Die ausgeschnittene Hornhaut in einen Brunnen einer 12-Well-Platte mit der endothelialen Stelle nach oben legen und die Probe in 3 ml Vollmedium bei 37 °C für bis zu 3 Tage bebrüten.
   HINWEIS: Potenzielle zytoprotektive Mittel können in diesem Schritt dem Medium hinzugefügt werden.

2. Vorbereitung auf die Histologie

1. Bereiten Sie Sorensens Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 vor, der 19,6 ml von 133 mM KH₂PO₄ und 80,4 ml von 133 mM Na₂HPO₄enthält.
2. Entfernen Sie das Medium aus dem Hornhaut-haltigen Brunnen und fixieren Sie das Gewebe für 20 min bei Raumtemperatur (RT) mit methanolfreiem Paraformaldehyd (4%) im Puffer von Sorensen.
3. Legen Sie Gewebe in 20% Saccharose in PBS, bis Gewebe sinkt (1 h) und dann in 30% Saccharose in PBS über Nacht bei RT. Achten Sie darauf, den Kontakt mit Blasen und der Luftoberflächenschnittstelle zu vermeiden. Gewebe in optimale Schnitttemperatur (OCT) einbetten und bei -80 °C lagern.
4. Schneiden Sie die 10 m dicken Abschnitte mit einem Kryostat bei -27 °C.
   HINWEIS: Eine Kamelhaarbürste ist nützlich, um den entstehenden Abschnitt über die Messerklinge zu führen.
5. Übertragen Sie den Schnitt auf ein Mikroskopschlitten, indem Sie den Dia innerhalb von 1 min nach dem Schneiden auf das Gewebe berühren, um eine Gefriertrocknung des Gewebes zu vermeiden. Bewahren Sie die Dias bei -80 °C auf.

3. Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung

1. Lufttrockene Abschnitte für mehrere Minuten, um Feuchtigkeit zu entfernen.
2. Mit gefiltertem 0,1% Mayers Hämatoxylin für 10 min in einem 50 ml Schlauch.
3. In einem Coplin-Glas in kühl laufendem ddH₂O für 5 min abspülen und 0,5% Eosin 10x eintauchen.
4. Tauchen Sie in ddH₂O ein, bis das Eosin aufhört zu streifen und dann in 50% (10x) sowie 70% (10x) EtOH eintauchen.
5. Gleichgewicht in 95% EtOH (30 s) und 100% EtOH (60 s) vor dem eintauchen in Xylol mehrmals.
6. Schließlich montieren und decken Sie die Probe, bevor Sie Bilder mit einem Lichtmikroskop.

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Ergebnisse

Mit dem hier vorgestellten Verfahren behandelten wir die Augen mit einem Nd:YAG-Laser, der verschiedene Pulsenergien (1,0 x 4,6 mJ) und Positionen von Brennpunkten (Abstand von der hinteren Oberfläche der Hornhaut: 0,0 x 0,2 mm) bewertete, um die optimalen Parameter zu finden. Für jede Konstellation der Laserparameter (12 x 21) wurden mehrere Replikationen (n = 3) ausgewertet.

Zusätzlich zu dem oben genannten Protokoll wurde die Probe vor der Fixierung und H&E-Färbung mit einem Zwei-Photon...

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Diskussion

Die Ergebnisse dieser Pilotstudie deuten darauf hin, dass ein Nd:YAG-Laser verwendet werden kann, um hornhaut-Endothelzellen selektiv abzuergänzen, wenn geeignete Parameter für Energiedosis und Fokuspunktposition gewählt werden.

Da die endotheliale Funktion wichtig für die Hornhauttransparenz und den Schutz der Hornhaut vor stromalen Ödemen ist, spielen Modelle der endothelialen Dysfunktion eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Antiödemoderoder-Verfahren. Es gibt mehrere etablierte...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BARRON VACUUM TREPHINE	Katena	K20-2058
Cryostat	Leica	CM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	PAA	E-15009
Eye holder	Self	N/A
Inverted Microscope	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd:YAG laser	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
OCT Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010056
Porcine serum	Sigma-Aldrich	12736C
Spectral-domain optical coherence tomograph	Heidelberg Engineering	Spectralis
Tissue culture plate 12-well	Sarstedt	833921
Two-Photon Microscope	JenLab	DermaInspect
Viscoelastic	OmniVision	Methocel