각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

요약

여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.

초록

Nd:YAG 레이저는 지금 수십 년 동안 capsulotomy와 같은 비침범성 안구 수술을 수행하는 데 사용되었습니다. 절개 효과는 레이저 초점의 광학 고장에 의존합니다. 음향 충격파와 캐비테이션 버블이 발생하여 조직 파열을 일으킵니다. 기포 크기와 압력 진폭은 펄스 에너지와 초점 위치에 따라 달라집니다. 본 연구에서, 핵핵 돼지 눈은 시판되는 Nd:YAG 레이저 앞에 위치시켰다. 가변 펄스 에너지뿐만 아니라 각막에 대한 초점 반점 후방의 상이한 위치를 시험했다. 결과 병변은 최소한의 부수적 손상으로 각막 내피 세포 (CEC)의 독점적 인 분리를위한 최상의 매개 변수를 결정하기 위해 2 광자 현미경 검사법과 조직학에 의해 평가되었다. 이 방법의 장점은 CEC의 정밀한 절제, 감소된 부수적 손상, 그리고 무엇보다도 비접촉 식 치료입니다.

서문

각막의 투명성은 망막과 광수용체에 빛의 투과에 필수적이다^1. 이와 관련하여, 탈수의 상대적인 상태는 각막 기질 내의 콜라겐 섬유를 정확하게 정렬시키는 데 중요합니다. 이 항상성은 Descemet의 막에 있는 각막 내피 세포 (CEC)에 의해 유지됩니다 (DM)^2. 내피는 가장 안쪽 각막 층입니다. 그것은 각막 투명성에 중요한 장벽과 펌프 기능을 가지고^3. 상피와는 달리, 내피는 자기 갱신 할 수 없습니다⁴. 따라서 질병 이나 외상으로 인한 임의의 세포 손상은 남은 내피 세포를 자극하여 확대 및 마이그레이션하고, 그로 인한 결함을 커버하고 각막 기능을 유지한다^5. 그러나 CEC 밀도가 임계 값 이하로 떨어지면 내피의 부전이 발생하여 시력이 흐려지고 불편함이 생기거나 심한^{통증이 발생합니다 4.} 증상을 완화하는 약물의 가용성에도 불구하고, 현재 이러한 경우 유일한 확실한 치료는 각막 이식이며, 이는 전체 두께 이식 또는 라멜라 내피 이식의 형태로 수행 될 수 있습니다. 후자의 절차는 Descemet의 막 내피 각막 각질 성형술 (DMEK)뿐만 아니라 Descemet의 스트리핑 자동화 된 내피 각막 성형술⁶(DSAEK)6으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 남아 있는 CEC의 보호 및 그들의 생존을 강화하는 것은 잠재적인 치료 약을 시험하기 위하여 적당한 질병 모형을 필요로 하는 대체 표적이 될 수 있었습니다.

현재 CEC 손실 질환 모델은 침습적 데시메터헥시스 기술을 사용하여 전위 챔버 내로 또는 세포의 기계적 마모에 의한 독성 제제(예를 들어, 벤잘코늄 염화물)의 주입을 통한 내피의 파괴에 초점을 맞추고^있다.,8 이 모형은 잘 설치되는 동안, 일반적인 선동적인 반응 및 부정확한 부수적인 손상과 같은 단점이 존재합니다. 따라서, 이 모형은 전술한 외과 선택권이 불가피할 때 질병의 마지막 단계를 나타낼 확률이 높습니다.

줄기 세포 및 유전자 치료와 같은 세포 치료 전략의 발전과 함께, 이러한 세포 치료법의 적용은 CEC 손실^9의초기 단계에서 유용 할 수 있습니다. 그 후, 우리는 질병의 이 초기 단계를 더 적당하게 나타내는 모형이 필요합니다. 이와 관련하여, 세포 배양 모델은 지난 10년 동안 개선되었지만, 시험관내 세포가 각막^내의상이한 세포 유형 사이에서 발생하는 복잡한 상호작용을 복제하는 데 근접할 수 없기 때문에 그들의 타당성은 여전히 제한적이다. 따라서, 생체내 및 생체내 질환 모델은 여전히 수요가 많고 기존 것들을 개선하는 것이 가장 큰 관심사이다.

네오디뮴을 사용하여 사진 파괴에 의한 비침습적, 안구 내 수술:YAG (Nd:YAG) 레이저는 1970년대 후반^11에도입된 이래 전 세계 안과 의사를 위한 일상적인 절차가 되었습니다. 광파괴는 적용 부위가 액체 환경에 위치할 때마다 플라즈마의 형성, 음향 충격파의 생성 및 캐비테이션 기포의 생성으로 이어지는 비선형 광 흡수에 의존한다^12. 일반적으로, 이러한 과정은 정확한 조직 절단의 의도 된 효과에 기여한다. 그러나, 이들은 또한 레이저^{수술(13)의}국소 감금을 제한하는 불필요한 부수적 손상의 원인이 될 수 있다.

충격파 전파 및 캐비테이션 과정의 특성화를 통해 기계적 효과의 예측이 크게 향상되었습니다. CEC 손실의 초기 단계에 대한 비침습적, 레이저 보조 실험 적 질병 모델을 제공하기 위해 가능한 한 주변 조직에 대한 손상이 적은 CEC를 대상으로하는 것이 우리의 목표입니다. 이를 위해, 최적의 펄스 에너지와 레이저의 초점 반점의 위치를 결정할 필요가있다.

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프로토콜

동물 조직과 관련된 모든 절차는 지역 동물 관리 및 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 장기 배양 및 레이저 치료 준비

1. 현지 아바토이르에서 갓 핵을 얻은 돼지 눈을 얻으실 수 있습니다. L-글루타민, 피루비테 나트륨, 페니실린/스트렙토마이신(1%), 돼지 혈청(10%)으로 보충된 높은 포도당으로 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 시원하게(4°C) 유지하고, 돼지 혈청(10%)을 이 기사에서 전체 배지로 지칭합니다.
2. 가위로 세포 외 조직을 제거하고 사용할 때까지 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS)에 넣기 전에 5 분 동안 5 % 포비도 요오드 안과 용액에 눈을 담그십시오.
3. 각막 흉터, 부종 및 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 장치(재료표)와같은 주요 전방 세그먼트 병리에 대한 화면 눈.
4. 1,064 nm의 파장과 10 μm의 초점 공대 직경을 가진 Nd:YAG 레이저(재료 표)가장착 된 슬릿 램프 장치 앞에 눈을 배치하십시오.
   참고 : 최적의 위치 지정을 위해 3D 인쇄 된 홀딩 장치가 사용되며, 이는 너무 많은 압력을 가하지 않고 눈을 단단히 고정하도록 설계되었습니다(그림 1).
5. 12배배의 배율을 사용하고 조명을 편향하여 개별 각막 층을 시각화합니다.
6. 내피 세포의 선택적 절제에 대한 펄스 에너지(예를 들어, 1.6 mJ) 및 초점 포인트(예를 들어, 0.16 mm)를 설정합니다.
7. 사지에 가까운 명확한 각막 파라센티스를 배치하고 점탄성(재료의 표)를주입하여 전방 챔버를 안정화시다.
8. 8mm 트레핀을 사용하여 레이저 처리 된 중앙 각막을 절제하십시오.
9. 절제된 각막을 내피 부위가 위쪽을 향하는 12웰 플레이트의 우물에 놓고 37°C에서 37°C에서 3 mL의 시편을 최대 3일 동안 배양한다.
   참고: 이 단계에서 잠재적인 세포 보호 제는 배지에 첨가될 수 있습니다.

2. 역학 준비

1. 133 mM KH₂PO₄ 및 133 mM Na₂HPO_4의80.4 mL의 19.6 mL를 포함하는 7.4의 pH로 소렌슨의 버퍼를 준비한다.
2. 메탄올이 함유된 배지를 잘 함유하고 실온(RT)에서 20분 동안 조직을 고정하여 메탄올이 없는 파라포름알데히드(4%)를 사용한다. 소렌슨의 버퍼에 있습니다.
3. 조직이 가라 앉을 때까지 PBS에서 20 % 자당에 조직을 놓고 (1 시간) 다음 RT에서 밤새 PBS에서 30 % 자당에. 기포와 공기 표면 인터페이스와의 접촉을 피하기 위해주의하십시오. 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물에 조직을 포함하고 -80 °C에서 저장합니다.
4. -27°C에서 저온 중지를 사용하여 10 μm 두께의 절편을 절단합니다.
   참고: 낙타 헤어브러시는 칼날 위로 새롭게 떠오르는 부분을 안내하는 데 유용합니다.
5. 슬라이드를 절단 한 후 1 분 이내에 조직에 슬라이드를 터치하여 현미경 슬라이드로 섹션을 옮겨 조직의 동결 건조를 피하십시오. 슬라이드를 -80°C에서 보관합니다.

3. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색

1. 수분을 제거하기 위해 몇 분 동안 공기 건조 섹션.
2. 50 mL 튜브에서 10 분 동안 0.1 % 메이어 스 헤마톡클린을 걸러진 얼룩.
3. 코플린 항아리에 시원한 달리기 ddH₂O로 5분간 헹구고 0.5% 에오신 10배로 찍어 드세요.
4. ddH₂O에 찍어 서신이 줄무늬를 멈출 때까지 담근 다음 50% (10x) 및 70% (10x) EtOH에 담급니다.
5. 자일렌에 여러 번 담그기 전에 95 % EtOH (30 s) 및 100 % EtOH (60 s)에서 평형화하십시오.
6. 마지막으로 가벼운 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하기 전에 시편을 장착하고 덮습니다.

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결과

여기에 제시된 절차를 사용하여, 우리는 Nd:YAG 레이저로 눈을 치료하고, 다른 펄스 에너지 (1.0-4.6 mJ)와 초점 의 위치 (각막의 후방 표면에서 의 거리 : 0.0-0.2 mm)를 평가하여 최적의 매개 변수를 찾습니다. 다중 복제(n=3)는 레이저 파라미터(12 x 21)의 각 별자리에 대해 평가되었다.

전술한 프로토콜 이외에, 시편은 고정 및 H&E 염색 전에 2광자 현미경으로 분석되었다. 2광자 현미경은...

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토론

이 파일럿 연구의 결과는 Nd:YAG 레이저가 에너지 용량 및 초점 포인트 위치에 대한 적절한 매개 변수가 선택적으로 각막 내피 세포를 ablate하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다.

내피 기능은 각막 투명성과 기질 부종에서 각막을 보호하기 위해 중요하기 때문에, 내피 기능 장애의 모델은 항 부종 약물 이나 외과 적 절차의 개발에 중요한 역할을한다. 생체 내 상황^1...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BARRON VACUUM TREPHINE	Katena	K20-2058
Cryostat	Leica	CM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	PAA	E-15009
Eye holder	Self	N/A
Inverted Microscope	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd:YAG laser	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
OCT Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010056
Porcine serum	Sigma-Aldrich	12736C
Spectral-domain optical coherence tomograph	Heidelberg Engineering	Spectralis
Tissue culture plate 12-well	Sarstedt	833921
Two-Photon Microscope	JenLab	DermaInspect
Viscoelastic	OmniVision	Methocel