Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).

Resumo

Os lasers Nd:YAG têm sido usados para realizar cirurgias intraoculares não invasivas, como a capsulotomia há várias décadas. O efeito incisivo depende da quebra óptica no foco do laser. Ondas de choque acústicas e bolhas de cavitação são geradas, causando ruptura tecidual. Os tamanhos das bolhas e as amplitudes de pressão variam com a energia do pulso e a posição do ponto focal. Neste estudo, os olhos de porco enucleados foram posicionados em frente a um laser Nd:YAG comercialmente disponível. Foram testadas energias de pulso variáveis, bem como diferentes posições dos pontos focais posteriores à córnea. As lesões resultantes foram avaliadas por microscopia e histologia de dois fótons para determinar os melhores parâmetros para um descolamento exclusivo de células endoteliais córneas (CEC) com dano colateral mínimo. As vantagens deste método são a ablação precisa da CEC, redução dos danos colaterais e, sobretudo, o tratamento sem contato.

Introdução

A transparência da córnea é essencial para a transmissão da luz para a retina e seus fotorreceptores¹. Nesse sentido, um estado relativo de desidratação é fundamental para manter as fibras de colágeno dentro do estroma da córnea corretamente alinhadas. Esta homeostase é mantida por células endoteliais córneas (CEC) localizadas na membrana de Descemet (DM)². O endotélio é a camada córnea mais interna. Possui uma importante função de barreira e bomba, que é crucial para a transparência da córnea³. Em contraste com o epitélio, o endotélio não é capaz de se auto-renovar⁴. Portanto, qualquer dano celular causado por doença ou trauma estimula as células endoteliais remanescentes a aumentar e migrar, para cobrir defeitos resultantes e manter a funcionalidade da córnea⁵. No entanto, se a densidade do CEC cair abaixo de um limiar crítico, a descompensação do endotélio leva a um edema, resultando em visão turva e desconforto ou até mesmo dor severa⁴. Apesar da disponibilidade de medicamentos para aliviar os sintomas, atualmente o único tratamento definitivo nesses casos é o transplante de córnea, que pode ser realizado na forma de enxerto de espessura total ou transplante endotelial lamellar. Este último procedimento está disponível como a ceratoplastia endotelial de membrana de Descemet (DMEK), bem como a ceratoplastia automatizada de descascamento de Descemet (DSAEK)⁶. No entanto, a proteção da CEC remanescente e o aumento de sua sobrevivência podem ser um alvo alternativo, que precisa de um modelo de doença adequado para testar possíveis drogas terapêuticas.

Os modelos atuais de doença de perda de CEC concentram-se na destruição do endotélio através da injeção de agentes tóxicos (por exemplo, cloreto de benzalkonium) na câmara anterior ou por abrasão mecânica das células utilizando uma técnica de descemetorhexis invasiva^7,8. Embora esses modelos estejam bem estabelecidos, existem desvantagens como a resposta inflamatória geral e danos colaterais imprecisos. Portanto, esses modelos são mais propensos a representar os estágios finais da doença, quando as opções cirúrgicas acima mencionadas são inevitáveis.

Com os avanços nas estratégias de tratamento celular, como células-tronco e terapia genética, a aplicação dessas terapias celulares poderia ser útil nos estágios iniciais da perda de CEC⁹. Posteriormente, precisamos de um modelo que represente esses estágios iniciais da doença de forma mais adequada. Nesse sentido, os modelos de cultura celular melhoraram na última década, mas ainda são limitados em sua validade, pois as células in vitro não podem chegar perto de replicar as interações complexas que ocorrem entre os diferentes tipos de células dentro da córnea¹⁰. Portanto, os modelos de doenças ex vivo e in vivo ainda estão em alta demanda e melhorar os existentes é de extremo interesse.

A cirurgia intraocular não invasiva por fotodisrupção usando um laser neodímio:YAG (Nd:YAG) tornou-se um procedimento de rotina para oftalmologistas em todo o mundo desde sua introdução no final da década de 1970¹¹. A fotointerrupção depende da absorção de luz não linear que leva à formação de plasma, geração de ondas de choque acústicas e criação de bolhas de cavitação, sempre que o local de aplicação estiver localizado em um ambiente líquido¹². Em geral, esses processos contribuem para o efeito pretendido do corte preciso do tecido. No entanto, eles também podem ser a fonte de danos colaterais desnecessários que limitam o confinamento local da cirurgia a laser¹³.

A previsão de efeitos mecânicos resultantes melhorou significativamente através da caracterização do curso de propagação e cavitação da onda de choque. Nosso objetivo é atingir a CEC com o mínimo de dano possível ao tecido circundante para fornecer um modelo de doença experimental não invasiva, assistida a laser para os estágios iniciais da perda de CEC. Para isso, é necessário determinar as energias e posições de pulso ideais dos pontos focais do laser.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo tecido animal seguem as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidado Animal local.

1. Preparação da cultura de órgãos e tratamento a laser

1. Obtenha olhos suínos recém-enucleados do matadouro local. Mantenha-os frios (4 °C) no meio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com alta glicose, suplementado com L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina (1%) e soro suíno (10%), a partir de agora referido neste artigo como meio completo.
2. Remova os tecidos extracelulares com uma tesoura e mergulhe os olhos em uma solução oftalmológica de 5% de povidone-iodo por 5 minutos antes de colocá-los em solução salina esterilizada com fosfato tamponado (PBS) até o uso.
3. Olhos de tela para as principais patologias do segmento anterior, como cicatrizes na córnea, edema e outras opacidades com um dispositivo de tomografia de coerência óptica de domínio espectral(Tabela de Materiais).
4. Posicione os olhos em frente a uma unidade de lâmpada de fenda equipada com um laser Nd:YAG(Table of Materials),que tem um comprimento de onda de 1.064 nm e um diâmetro focal de 10 μm de ar.
   NOTA: Para um posicionamento ideal é utilizado um aparelho de retenção impresso em 3D, que foi projetado para segurar o olho firme, sem colocar muita pressão sobre ele(Figura 1).
5. Use uma ampliação de 12x e desvie a iluminação para visualizar as camadas córneas individuais.
6. Defina a energia de pulso (por exemplo, 1,6 mJ) e o ponto de foco (por exemplo, 0,16 mm) para ablação seletiva de células endoteliais.
7. Coloque uma paracentese de córnea clara perto do membro e injete viscoelástico(Tabela de Materiais)para estabilizar a câmara anterior.
8. Excisão da córnea central tratada a laser usando uma tifina de 8 mm.
9. Coloque a córnea excisa em um poço de 12 poços com o sítio endotelial voltado para cima e incubar o espécime em 3 mL de meio completo a 37 °C por até 3 dias.
   NOTA: Potenciais agentes citoprotetores podem ser adicionados ao meio durante esta etapa.

2. Preparação para a histologia

1. Prepare o buffer de Sorensen com um pH de 7,4 contendo 19,6 mL de 133 mM KH₂PO₄ e 80,4 mL de 133 mM Na₂HPO₄.
2. Remova o meio do poço contendo córneas e fixar o tecido por 20 min à temperatura ambiente (RT) usando paraformaldeído livre de metanol (4%) no tampão de Sorensen.
3. Coloque o tecido em 20% de sacarose na PBS até que o tecido afunde (1 h) e depois em 30% de sacarose na PBS durante a noite no RT. Tome cuidado para evitar o contato com bolhas e a interface da superfície do ar. Incorpore tecido no composto de temperatura de corte ideal (OCT) e armazene a -80 °C.
4. Corte as seções de 10 μm de espessura usando um criostato a -27 °C.
   NOTA: Uma escova de cabelo de camelo é útil para ajudar a guiar a seção emergente sobre a lâmina da faca.
5. Transfira a seção para um slide de microscópio tocando o slide para o tecido dentro de 1 min de corte para evitar a secagem congelada do tecido. Armazene os slides a -80 °C.

3. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)

1. Seções secas a ar por vários minutos para remover a umidade.
2. Mancha com hematoxilina mayers filtrada por 10 min em um tubo de 50 mL.
3. Em um frasco de Coplin, enxágue em ddH₂O fresco por 5 min e mergulhe em 0,5% eosin 10x.
4. Mergulhe em ddH₂O até que a eosina pare de estriae e depois mergulhe em 50% (10x) bem como 70% (10x) EtOH.
5. Equilibre em 95% EtOH (30 s) e 100% EtOH (60 s) antes de mergulhar em xileno várias vezes.
6. Finalmente montar e cobrir o espécime antes de tirar imagens usando um microscópio leve.

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Resultados

Utilizando o procedimento aqui apresentado, tratamos os olhos com um laser Nd:YAG, avaliando diferentes energias de pulso (1,0-4,6 mJ) e posições de pontos focais (distância da superfície posterior da córnea: 0,0−0,2 mm) para encontrar os parâmetros ideais. Foram avaliadas múltiplas réplicas (n = 3) para cada constelação dos parâmetros do laser (12 x 21).

Além do protocolo acima mencionado, a amostra foi analisada com um microscópio de dois fótons antes da fixação e coloraç?...

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Discussão

Os resultados deste estudo piloto indicam que um laser Nd:YAG pode ser usado para abmar seletivamente células endoteliais da córnea quando forem escolhidos parâmetros apropriados para dose de energia e posição de ponto de foco.

Como a função endotelial é importante para a transparência da córnea e para a salvaguarda da córnea a partir de edema estromo, os modelos de disfunção endotelial desempenham um papel importante no desenvolvimento de medicamentos anti-edematosos ou procedime...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BARRON VACUUM TREPHINE	Katena	K20-2058
Cryostat	Leica	CM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	PAA	E-15009
Eye holder	Self	N/A
Inverted Microscope	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd:YAG laser	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
OCT Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010056
Porcine serum	Sigma-Aldrich	12736C
Spectral-domain optical coherence tomograph	Heidelberg Engineering	Spectralis
Tissue culture plate 12-well	Sarstedt	833921
Two-Photon Microscope	JenLab	DermaInspect
Viscoelastic	OmniVision	Methocel