JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для отстыковки пенотелировых клеток (CEC) от мембраны Десцемета (DM) с помощью неодимия:YAG (Nd:YAG) лазер в качестве модели ex vivo болезни для булловой кератопатии (BK).

Аннотация

Nd: YAG лазеры были использованы для выполнения неинвазивных внутриглазной хирургии, такие как капсулотомия в течение нескольких десятилетий. Резкий эффект зависит от оптической поломки при лазерном фокусе. Создаются акустические ударные волны и кавитационные пузыри, что приводит к разрыву тканей. Размеры пузырьков и амплитуды давления варьируются в зависимости от импульсной энергии и положения координационного центра. В этом исследовании, энуклеированные свиные глаза были расположены перед коммерчески доступным nd:YAG лазера. Были протестированы переменные импульсные энергии, а также различные положения очаговых пятен, задних к роговице. Полученные поражения оценивались двухфотонической микроскопией и гистологией для определения наилучших параметров для эксклюзивного отделения эндотелиальных клеток роговицы (CEC) с минимальным сопутствующим ущербом. Преимуществами этого метода являются точная абляция ЦИК, снижение сопутствующего ущерба и, прежде всего, бесконтактное лечение.

Введение

Прозрачность роговицы необходима для передачи света на сетчатку и ее фоторецепторов1. В связи с этим, относительное состояние обезвоживания имеет решающее значение для поддержания коллагеновых волокон в роговицы стромы правильно выровнены. Этот гомеостаз поддерживается эндотелиальных клеток роговицы (CEC), расположенных на мембране Descemet (DM)2. Эндотелий является самым внутренним слоем роговицы. Он имеет важный барьер и насос функции, которая имеет решающее значение для прозрачности роговицы3. В отличие от эпителия, эндотелий не способен самостоятельно обновить4. Таким образом, любое повреждение клеток, вызванных болезнью или травмой стимулирует оставшиеся эндотелиальные клетки, чтобы увеличить и мигрировать, для покрытия результирующих дефектов и для поддержания функциональности роговицы5. Однако, если плотность ЦИК падает ниже критического порога, декомпенсация эндотелия приводит к отеку, что приводит к затуманенное зрение и дискомфорт или даже сильная боль4. Несмотря на наличие препаратов для облегчения симптомов, в настоящее время единственным окончательным лечением в этих случаях является трансплантация роговицы, которая может быть выполнена в виде полной толщины трансплантата или ламеллярной эндотелиальной трансплантации. Последняя процедура доступна как мембранная эндотелиальная кератопластика Десцемета (DMEK), а также зачистка Десемета автоматизированной эндотелиальной кератопластики (DSAEK)6. Однако защита оставшихся ЦИК и повышение их выживания могут быть альтернативной мишенью, которая нуждается в адекватной модели заболевания для тестирования потенциальных терапевтических препаратов.

Текущие модели болезни потери ЦИК сосредоточиться на разрушении эндотелия путем инъекции токсичных агентов (например, хлорид бензалкония) в переднюю камеру или механической ссадении клеток с использованием инвазивной техники descemetorhexis7,8. Хотя эти модели хорошо зарекомендовали себя, существуют такие недостатки, как общая воспалительная реакция и неточный сопутствующий ущерб. Таким образом, эти модели, скорее всего, представляют собой заключительные стадии заболевания, когда вышеупомянутые хирургические варианты неизбежны.

С достижениями в клеточных стратегий лечения, таких как стволовые клетки и генной терапии, применение этих клеточных методов лечения может быть полезным на ранних стадиях потери ЦИК9. Впоследствии нам нужна модель, которая представляет эти ранние стадии заболевания более адекватно. В этой связи, модели клеточной культуры улучшились за последнее десятилетие, но все еще ограничены в своей действительности, так как клетки in vitro не могут приблизиться к репликации сложных взаимодействий, которые происходят между различными типами клеток в роговице10. Таким образом, модели ex vivo и in vivo по-прежнему пользуется большим спросом, и улучшение существующих представляет наибольший интерес.

Неинвазивная, внутриглазная хирургия с помощью лазера neodymium:YAG (Nd:YAG) стала обычной процедурой для офтальмологов во всем мире с момента его введения в конце1970-х годов 11. Фотонарушение зависит от нелинейного поглощения света, что приводит к образованию плазмы, генерации акустических ударных волн и созданию кавитационных пузырей, всякий раз, когда сайт приложения находится в жидкой среде12. В целом, эти процессы способствуют предполагаемому эффекту точной резки тканей. Тем не менее, они также могут быть источником ненужного сопутствующего ущерба, ограничивающего местное заключение лазерной хирургии13.

Прогнозирование полученных механических эффектов значительно улучшилось за счет характеристики курса распространения ударной волны и кавитации. Наша цель – нацелиться на ТО, чтобы ЦИК нацелился на как можно меньше ею, чтобы обеспечить неинвазивную модель экспериментального заболевания с лазерной помощью на ранних стадиях потери ЦИК. Для этого необходимо определить оптимальные импульсные энергии и положение фокусных пятен лазера.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры, связанные с тканью животных, следуют рекомендациям местного комитета по уходу за животными и этике.

1. Подготовка культуры органов и лазерное лечение

  1. Получить свежеэнкулеционированные свиные глаза из местной скотобойни. Держите их в прохладном (4 кС) в модифицированной среде Орел Dulbecco (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненный L-глютамина, пируват натрия, пенициллин / стрептомицин (1%), и свиная сыворотка (10%), отныне упоминается в этой статье в качестве полной среде.
  2. Удалить внеклеточные ткани с ножницами и замочить глаза в 5% повид-йод офтальмологический раствор в течение 5 минут, прежде чем поместить их в стерилизованных фосфат-буферных солей (PBS) до использования.
  3. Экран ные глаза для основных патологий переднего сегмента, таких как рубцы роговицы, отеки и другие непрозрачности с спектральной домен оптической компиральной томографии устройства (Таблица материалов).
  4. Расположите глаза перед разрезом лампы, оснащенной лазером Nd:YAG(Таблица материалов),который имеет длину волны 1064 нм и диаметр фокусного пятна 10 мкм в воздухе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального позиционирования используется 3D-печатный холдинговой аппарат, который был разработан, чтобы держать глаз фирмы, не оказывая слишком много давления на него (Рисунок 1).
  5. Используйте увеличение 12x и отвлечь освещение, чтобы визуализировать отдельные слои роговицы.
  6. Установите импульсную энергию (например, 1,6 мДж) и точку фокусировки (например, 0,16 мм) для селективной абляции эндотелиальных клеток.
  7. Поместите четкий парасентез роговицы близко к лимбу и вводить вязкоупругий (Таблица материалов) для стабилизации передней камеры.
  8. Акциз лазерной обработки центральной роговицы с помощью 8 мм трефина.
  9. Поместите вырезанную роговицу в колодец из 12-колодца пластины с эндотелиальным участком, обращенным вверх, и инкубировать образец в 3 мл полной среды при 37 градусах Цельсия в течение 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Потенциальные цитопротекторные агенты могут быть добавлены к среде во время этого шага.

2. Подготовка к гистологии

  1. Подготовьте буфер Соренсена с рН 7,4, содержащий 19,6 мл 133 мМ KH2PO4 и 80,4 мл 133 мМ Na2HPO4.
  2. Удалить среду из роговицы, содержащей хорошо и зафиксировать ткани в течение 20 минут при комнатной температуре (RT) с помощью метанола без параформальдегида (4%) в буфере Соренсена.
  3. Поместите ткани в 20% сахарозы в PBS до погружения ткани (1 ч), а затем в 30% сахарозы в PBS ночь на RT. Позаботьтесь, чтобы избежать контакта с пузырьками и интерфейсом поверхности воздуха. Встраивай ткань в оптимальную температуру резки (OCT) и храните при температуре -80 градусов по Цельсию.
  4. Вырезать разделы 10 мкм толщиной с помощью криостата при -27 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Верблюжья расческа полезна, чтобы помочь возникающим раздел над лезвием ножа.
  5. Перенесите секцию на слайд микроскопа, коснувшись слайда в ткани в течение 1 мин резки его, чтобы избежать замораживания сушки ткани. Храните слайды при -80 градусах По Цельсию.

3. Гематоксилин и эозин (Н И Э) окрашивание

  1. Воздух сухие разделы в течение нескольких минут, чтобы удалить влагу.
  2. Пятно с фильтрованным 0,1% Майерс гематоксилин в течение 10 мин в 50 мл трубки.
  3. В банку Коплин, промыть в прохладном работает ddH2O в течение 5 мин и окунуться в 0,5% эозин 10x.
  4. Dip в ddH2O до тех пор, пока эозин останавливается полос, а затем окунуться в 50% (10x), а также 70% (10x) EtOH.
  5. Равновесие в 95% EtOH (30 s) и 100% EtOH (60 s) перед погружением в ксилен несколько раз.
  6. Наконец смонтировать и coverslip образца, прежде чем принимать изображения с помощью светового микроскопа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя представленную здесь процедуру, мы обработали глаза лазером Nd:YAG, оценивая различные импульсные энергии (1,0–4,6 мДж) и положения фокусных точек (расстояние от задней поверхности роговицы: 0,0–0,2 мм), чтобы найти оптимальные параметры. Для каждого созвездия параметров лазера (12 x 21...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Результаты этого экспериментального исследования показывают, что nd:YAG лазер может быть использован для выборочно абляции роговицы эндотелиальных клеток, когда соответствующие параметры для дозы энергии и точки фокуса позиции выбраны.

Поскольку эндотелиальная функция ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Кристино Эрон и Яна А. М. Сочурек за помощь в экспериментальных методах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BARRON VACUUM TREPHINEKatenaK20-2058
CryostatLeicaCM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucosePAAE-15009
Eye holderSelfN/A
Inverted MicroscopeLeicaDMI 6000 B
KH2PO4Merck529568
Na2HPO4Merck1065860500
Nd:YAG laserZeiss MeditecvisuLAS YAG II plus
OCT Tissue TekSakura Finetechnical4583
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco10010056
Porcine serumSigma-Aldrich12736C
Spectral-domain optical coherence tomographHeidelberg EngineeringSpectralis
Tissue culture plate 12-wellSarstedt833921
Two-Photon MicroscopeJenLabDermaInspect
ViscoelasticOmniVisionMethocel

Ссылки

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
  3. Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
  4. Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
  5. He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047(2016).
  6. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  7. Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
  8. Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
  9. Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
  10. Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
  11. Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
  12. Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
  13. Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
  14. Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
  15. Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
  16. Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
  17. Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
  18. Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).
  19. Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
  20. Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
  21. McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
  22. Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

158Nd YAG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены