Dual Raster-Scanning Photoakustischer Kleintier-Imager für Vaskuläre Visualisierung

Zusammenfassung

Es wurde ein doppelter Raster-Scanning-Foto-Imager entwickelt, der Weitfeld-Bildgebung und Echtzeit-Bildgebung integriert.

Zusammenfassung

Die Bildgebung von Gefäßnetzwerken an Kleintieren hat in der biomedizinischen Grundlagenforschung eine wichtige Rolle gespielt. Die photoakustische Bildgebungstechnologie hat ein großes Anwendungspotenzial in der Bildkunde von Kleintieren. Die großfläbige photoakustische Bildgebung von Kleintieren kann Bilder mit hoher raumzeitlicher Auflösung, tiefem Eindringen und mehreren Kontrasten liefern. Auch das photoakustische Bildgebungssystem in Echtzeit ist wünschenswert, um die hämodynamischen Aktivitäten der Kleintiervaskulatur zu beobachten, die zur Erforschung der dynamischen Überwachung der physiologischen Merkmale von Kleintieren verwendet werden kann. Hier wird ein photoakustischer Imager mit dualem Rasterscannen vorgestellt, der über eine schaltbare Doppelmodus-Bildgebungsfunktion verfügt. Die Weitfeld-Bildgebung wird durch eine zweidimensionale motorisierte Übersetzungsstufe angetrieben, während die Echtzeit-Bildgebung mit Galvanometern realisiert wird. Durch die Einstellung verschiedener Parameter und Bildgebungsmodi kann die In-vivo-Visualisierung des kleintierischen Gefäßnetzwerks durchgeführt werden. Die Echtzeit-Bildgebung kann verwendet werden, um Pulswechsel und Durchblutungsänderungen von medikamenteninduzierten, etc. zu beobachten. Die Weitfeldbildgebung kann verwendet werden, um die Wachstumsveränderung der Tumorvaskulatur zu verfolgen. Diese lassen sich in verschiedenen Bereichen der biomedizinischen Grundlagenforschung leicht anwenden.

Einleitung

Im grundlegenden biomedizinischen Bereich können Kleintiere die physiologische Funktion des Menschen simulieren. Daher spielt die Kleintierbildgebung eine wichtige Rolle bei der Erforschung von humanen homologen Krankheiten und der Suche nach einer wirksamen Behandlung¹. Photoakustische Bildgebung (PAI) ist eine nicht-invasive Bildgebungstechnik, die die Vorteile der optischen Und Ultraschall-Bildgebung²kombiniert. Die Photoakustische Mikroskopie (PAM) ist ein wertvolles bildgebendes Verfahren für die Grundlagenforschung von Kleintieren³. PAM kann problemlos hochauflösende, tiefdurchdrungene, hochspezifische und kontrastreiche Bilder auf Basis optischer Anregung und Ultraschallerkennung^{erhalten 4}.

Ein Pulslaser mit einer bestimmten Wellenlänge wird von endogenen Chromophoren des Gewebes absorbiert. Anschließend steigt die Temperatur des Gewebes, was zur Produktion von photoinduzierten Ultraschallwellen führt. Die Ultraschallwellen können von einem Ultraschallwandler erfasst werden. Nach Signalaufnahme und Bildrekonstruktion kann die räumliche Verteilung des Absorbers⁵erreicht werden. Einerseits erfordert die Visualisierung des ganzorganären Gefäßnetzes ein weites Sichtfeld. Der Prozess des Breitfeld-Scannens dauert in der Regel eine lange Zeit, um eine hohe Auflösung^6,7,8zu gewährleisten. Andererseits erfordert die Beobachtung der hämodynamischen Aktivitäten von Kleintieren eine schnelle Echtzeit-Bildgebung. Die Echtzeit-Bildgebung ist vorteilhaft, um die Vitalzeichen von Kleintieren in Echtzeit^9,10,11zu studieren. Das Sichtfeld der Echtzeit-Bildgebung ist in der Regel ausreichend klein, um eine hohe Aktualisierungsrate zu gewährleisten. Daher gibt es oft einen Kompromiss zwischen der Erzielung eines weiten Sichtfeldes und der Echtzeit-Bildgebung. Zuvor wurden zwei verschiedene Systeme für Weitfeld-Bildgebung oder Echtzeit-Bildgebung verwendet, getrennt.

Diese Arbeit berichtet über einen dualen Raster-Scanning Photoacoustic Imager (DRS-PAI), der Weitfeld-Bildgebung auf Basis einer zweidimensionalen motorisierten Übersetzungsstufe und Echtzeit-Bildgebung auf Basis eines zweiachsigen Galvanometerscanners integriert hat. Der Wide-Field Imaging Mode (WIM) wird durchgeführt, um vaskuläre Morphologie anzuzeigen. Für den Echtzeit-Imaging-Modus (RIM) gibt es derzeit zwei Funktionen. Zunächst kann RIM B-Scan-Bilder in Echtzeit bereitstellen. Durch die Messung der Verschiebung der Vaskulatur entlang der Tiefenrichtung können die Eigenschaften der Atmung oder des Pulses aufgedeckt werden. Zweitens kann der RIM den spezifischen Bereich im WIM-Bild quantitativ messen. Durch die Bereitstellung vergleichbarer Bilder lokaler WIM-Regionen können die Details der lokalen Veränderung genau aufgedeckt werden. Das System entwirft einen flexiblen Übergang zwischen weiträumiger Bildgebung der Gefäßvisualisierung und Echtzeit-Bildgebung der lokalen Dynamik. Das System ist in der biomedizinischen Grundlagenforschung wünschenswert, wenn eine Kleintierbildgebung erforderlich ist.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschusses der South China Normal University, Guangzhou, China, durchgeführt.

1. System-Setup

1. Optischer Pfad (Abbildung 1)
   1. Verwenden Sie einen 532 nm Pulslaser als Systemlaserquelle. Stellen Sie die Wiederholungsrate des Lasers auf 10 kHz, die Ausgangsenergie auf 100 % und die Triggereinstellung auf externe Trigger mit einem benutzerdefinierten Programm ein.
   2. Koppeln Sie den Laserstrahl über einen Optischen Faserkoppler (FC1) mit Singlemode Fiber (SMF). Kollimieren Sie den Laserstrahl mit einem optischen Faserkollimator (FC2) auf einer zweidimensionalen motorisierten Bühne (Motor, Höchstgeschwindigkeit: 20 mm/s).
   3. Lenken Sie den Laserstrahl mit einem zweiachsigen Galvanometerscanner (Galva). Verwenden Sie einen beweglichen Spiegel (M1), um den Strahl zu reflektieren. Fokussieren Sie den Strahl durch eine 4× Objektivlinse (OL, Numerische Blende: 0,1).
   4. Verwenden Sie eine XY-Übersetzerhalterung (TM), um den selbstgebauten Hohlultraschallwandler (UT, Zentralfrequenz: 25 MHz; Bandbreite: mehr als 90%; Mittelloch: 3 mm) auf der Unterseite des OL¹². Passieren Sie den fokussierten Strahl durch das Mittelloch des Ultraschallwandlers.
2. Scanpfad
   1. Sperren Sie die Galva mit einem feldprogrammierbaren Gate-Array (FPGA 2) während WIM. Legen Sie den entsprechenden Scanbereich und die Scangeschwindigkeit durch ein benutzerdefiniertes Programm fest.
   2. Sperren Sie den Motor mit einem feldprogrammierbaren Gate-Array (FPGA 1) während RIM. Legen Sie die Scanhäufigkeit und die Anzahl der Scanpunkte mit FPGA 2 fest. Verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Programm, um den Start zu steuern und den Scanvorgang zu beenden.
3. Datenerfassung
   1. Verwenden Sie einen 50-dB-Verstärker (AMP), um das PA-Signal zu verstärken. Digitalisieren Sie das Signal durch die Datenerfassungskarte (DAQ). Erhalten Sie das Triggersignal über FPGA 1 oder FPGA 2.
   2. Verwenden Sie eine Grafikverarbeitungseinheit (GPU), um Daten zu verarbeiten und Bilder parallel¹³anzuzeigen.
4. CCD-Bildgebungssystem
   1. Verwenden Sie eine ringförmige weiße LED (Farbtemperatur: 6500 K; Beleuchtungsstärke: 40000 Lux; Durchmesser: 7,5 cm) als Lichtquelle. Entfernen Sie M1, verwenden Sie einen festen Spiegel (M2), um das Licht zu reflektieren.
   2. Zeichnen Sie die Bilder mit einer CCD-Kamera (6,3 Millionen Pixel) auf dem PA-Bildgebungssystem auf. Zeigen Sie die Bilder mit einer Anzeigesoftware an.

2. Systemausrichtung

1. Wählen Sie einen Wassertank (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; unteres Fenster: 3 cm × 3 cm). Bedecken Sie den gesamten Wassertank mit einer Polyethylenmembran (Membrandicke: 10 m). Fügen Sie ausreichend Reinstwasser hinzu.
2. Stellen Sie den Wassertank auf die Arbeitsbühne.
3. Schalten Sie den Laserschalter ein. Wählen Sie das Lasersteuerungsprogramm aus. Vorheizen für 5 min. Drücken Sie die Taste "ON" am Pumpenschalter. Stellen Sie die Laserparameter gemäß Schritt 1.1.1 ein. Öffnen Sie die Blende des Lasers.
4. Wählen Sie das gesammelte Programm A-Line aus. Drücken Sie die "Start"-Taste, um das Einzelpunktsignal zu erfassen und Amplitude und Spektrum des aktuellen A-Liniensignals anzuzeigen.
5. Legen Sie eine Klinge an den Boden des Wassertanks. Tauchen Sie den unteren Teil der UT in den Wassertank für die akustische Kopplung ein. Vermeiden Sie Blasen im unteren Teil der UT.
6. Stellen Sie die Position von Galva ein, passen Sie den XY-Übersetzer zwischen UT und OL an, um Einschwingsignale zu vermeiden, und stellen Sie sicher, dass dies konfokale ist.
7. Passen Sie die Höhe der Arbeitsstufe an, um die Amplitude des Signals zu maximieren, und bestimmen Sie die Fokusposition.

3. Tierversuch

1. Verwenden Sie eine 5-u20126 Wochen alte BALB/c-Maus mit einem Körpergewicht von 20-u201230 g.
2. Anästhetisieren Sie das Tier mit Urethan (1 g/kg), das vor dem Experiment intraperitoneal injiziert wurde.
3. Führen Sie den Übergang zwischen WIM und RIM.
   1. Verwenden Sie einen planaren Ultraschallwandler. Rasieren Sie das Fell auf der Rückseite der Maus mit einem Trimmer und Enthaarungscreme. Legen Sie die Maus auf den Halter (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) in anfälliger Position.
   2. Lassen Sie den Bildbereich mit Ultraschallgel mit der Polyethylenmembran in Kontakt kommen. Vermeiden Sie Blasen im Kontaktteil.
   3. Stellen Sie den Halter für die akustische Kopplung auf die Arbeitsbühne. Befolgen Sie die Schritte 2.3-u20122.4, um den Laser zu starten und ein A-Liniensignal zu sammeln. Führen Sie die Schritte 2.6-u20122.7 aus, um sie auszurichten. Drücken Sie "Stop", um die Auflistung nach der Ausrichtung zu beenden.
   4. Wählen Sie das WIM-Programm aus. Benennen Sie den neu erstellten Ordner. Stellen Sie den Scanparameter auf 20 mm/s in der Registerkarte "Scangeschwindigkeit", "20 mm*20 mm" in der Registerkarte "Scanbereich" und "20" in der Registerkarte "Schritt" ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sammeln, um mit dem Scannen zu beginnen.
   5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, um den Scanvorgang nach der Erfassung zu beenden. Klicken Sie auf Return to Zero, um den Motor auf Null zu bringen. Schließen Sie die Laserblende. Legen Sie die Triggereinstellung auf internen Trigger fest. Drücken Sie die AUS-Taste für den Pumpschalter.
   6. Ersetzen Sie den WIM-Trigger als RIM-Trigger und schließen Sie ihn an den externen Laserauslöser an. Drücken Sie die ON-Taste für den Pumpschalter. Legen Sie die Triggereinstellung auf den externen Trigger fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Beenden, um das WIM-Programm zu beenden.
   7. Verwenden Sie Schritt 2.4, um das A-Liniensignal zu erfassen. Öffnen Sie die Laserblende. Führen Sie die Schritte 2.6-u20122.7 aus, um sie auszurichten. Drücken Sie Stop to end collection after alignment.
   8. Wählen Sie das RIM-Programm aus. Benennen Sie den neu erstellten Ordner. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sammeln, um mit dem Scannen zu beginnen.
   9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, um den Scanvorgang nach Abschluss der Erfassung zu beenden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Beenden, um das RIM-Programm zu beenden.
   10. Euthanisieren Sie das Tier mit Zervix-Dislokation am Ende der Bildgebung.
4. Führen Sie WIM der vaskulären Visualisierung durch.
   1. Verwenden Sie einen fokussierten Ultraschallwandler (Zentralfrequenz: 25 MHz; Bandbreite: mehr als 90%; Brennweite: 8 mm). Entfernen Sie die Haare von Mäuseohr oder Kopfhaut.
      1. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt auf der Seitlichen Seite der Schädel-Temporal-Oberseite der Maus (Tiefe zum Schädel) zu machen. Verwenden Sie die Augenschere, um von diesem Schnitt aus zu beginnen. Schneiden Sie die Kopfhaut um die Außenseite des Schädels. Komprimieren Sie den Blutungspunkt, um die Blutung zu stoppen. Waschen Sie die Wunde mit normaler Saline. Legen Sie die Maus auf den Halter.
   2. Lassen Sie den Bildbereich mit Ultraschallgel mit der Polyethylenmembran in Kontakt kommen. Vermeiden Sie Blasen im Kontaktbereich (Ergänzende Abbildung 1).
   3. Stellen Sie den Halter für die akustische Kopplung auf die Arbeitsbühne. Verwenden Sie die Schritte 2.3-u20122.4, um den Laser zu öffnen und ein A-Liniensignal zu erfassen. Verwenden Sie Schritt 2.6-u20122.7, um sie auszurichten. Drücken Sie Stop to end collection after alignment.
   4. Wählen Sie Das WIM-Programm aus. Benennen Sie den neu erstellten Ordner. Stellen Sie den Scanparameter auf "10 mm/s" in der Registerkarte "Scangeschwindigkeit", "10 mm*10 mm" unter der Registerkarte "Scanbereich" und "10" in der Registerkarte "Schritt" ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sammeln, um mit dem Scannen zu beginnen.
   5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, um den Scanvorgang nach Abschluss der Erfassung zu beenden. Klicken Sie auf Return to Zero, um den Motor auf Null zurück zu bringen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Beenden, um das WIM-Programm zu beenden.
   6. Euthanisieren Sie das Tier am Ende des Verfahrens, während das Tier noch unter Anästhesie ist.
5. Führen Sie RIM für die dynamische Überwachung von Kleintieren.
   1. Rasieren Sie die Haare des Mausbauchs. Platzieren Sie die Maus auf dem Halter in Supine-Position.
   2. Lassen Sie den Bildbereich mit Ultraschallgel mit der Polyethylenmembran in Kontakt kommen. Vermeiden Sie Blasen im Kontaktbereich.
   3. Stellen Sie den Halter für die akustische Kopplung auf die Arbeitsbühne. Führen Sie die Schritte 2.3-u20122.4 aus, um den Laser zu starten und ein A-Liniensignal zu sammeln. Führen Sie schritt 2.6-u20122.7 aus, um es auszurichten. Drücken Sie Stop to end collection after alignment.
   4. Wählen Sie das RIM-Programm aus. Benennen Sie den neu erstellten Ordner. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sammeln, um mit dem Scannen zu beginnen.
   5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, um den Scanvorgang nach Abschluss der Erfassung zu beenden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Beenden, um das RIM-Programm zu beenden.
6. Verwenden Sie die RIM-Daten für die Rekonstruktion der maximalen Amplitudenprojektion (MAP) entlang der Tiefenrichtung durch ein benutzerdefiniertes Programm. Beobachten Sie die dynamischen Veränderungen im Tier.

Ergebnisse

Der Schaltplan des DRS-PAI ist in Abbildung 1dargestellt. Das System ermöglicht ein flexibles und wiederholbares Umschalten zwischen WIM und RIM. Das erfasste PA-Signal wird schnell verarbeitet, um PA B-Scan- und MAP-Images zu erzeugen. Die CCD-Kamera kann Fotos von Proben zur Verfügung stellen.

Alle Komponenten des DRS-PAI sind integriert und in einem Imager-Setup montiert (Abbildung 2), wodurch die Montage und Bedienung einfach is...

Diskussion

Hier präsentierten wir einen dualen Raster-Scanning-Photoakustischen Kleintier-Imager für nichtinvasive Gefäßvisualisierung, der entwickelt und entwickelt wurde, um die Struktur der Vaskulatur und die damit verbundene dynamische Veränderung des Blutes zu erfassen. Der Vorteil von DRS-PAI ist, dass es die WIM und den RIM in ein System integriert, was es einfacher macht, die vaskuläre dynamische und vaskuläre Netzwerkstruktur von Kleintieren zu untersuchen. Das System bietet hochauflösende Weitfeld-Gefäßvisualisi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 bit multi-purpose digitizer	Spectrum	M3i.3221	Data acquisition card
A-line collected program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
Amplifier	RF Bay	LNA-650	Amplifier
Depilatory Cream	Veet	33-II	Animal depilatory
Fiberport Coupler	Thorlab	PAF-X-7-A	Fiber Coupler
Field Programmable Gate Array	Altera	Cyclone IV	Trigger Control
Fixed Focus Collomation Packages	Thorlabs	F240FC-532	Fiber Collimator
Foused ultrasonic transducer	Self-made
Graphics Processing Unit	NVIDIA	GeForce GTX 1060	Processing data
Holder	Self-made		Animal fixation
Laser control program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
Mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	BALB/c	Animal Model
Microscope camera	Mshot	MS60	CCD camera
Microscope Objective	Daheng Optics	GCO-2111	Objective Lens
Mirror	Daheng Optics	GCC-1011	Moveable/Fixed Mirror
Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner	Century Sunny	S8107	real-time scanner
Mshot image analysis system	Mshot		Display software
Normal Saline	CR DOUBLE-CRANE	H34023609	Normal Saline
Ophthalmic Scissors	SUJIE		Scalp Remove
Planar ultrasonic transducer	Self-made
Plastic Wrap	HJSJLSL		Polyethylene Membrane
Program Control Software	National Instrument	LabVIEW	User-defined Program
Pulsed Q-swithched Laser	Laser-export	DTL-314QT	532-nm pulse Laser
Real-time imaging program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
Ring-shaped white LED	Self-made
Shaver	Codos	CP-9200	Animal Shaver
Single-Mode Fibers	Nufern	460-HP	Single-mode fiber
Surgical Blade	SUJIE	11	Blade
Surgical Scalpel	SUJIE	7	Scalp Remove
Translation Stage	Jiancheng Optics	LS2-25T	wide-field scanning stage
Ultrasonic Transducer	Self-made
Ultrasound gel	GUANGGONG PAI	ZC4252418	Acoustic Coupling
Urethane	Tokyo Chemical Industry	C0028	Animal Anestheized
Water tank	Self-made
Wide-field imaging program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
XY Translator Mount	Self-made