Imagem fotoacoustic de pequeno animal de varredura dupla raster-scaning para visualização vascular

Resumo

Foi projetado um imager fotoacoustic de varredura dupla rastering, que integrou imagens de campo amplo e imagens em tempo real.

Resumo

A imagem de redes vasculares em animais de pequeno porte tem desempenhado um papel importante na pesquisa biomédica básica. A tecnologia de imagem fotoacoustic tem grande potencial para aplicação na imagemologia de pequenos animais. A imagem fotoacâmica de campo largo de pequenos animais pode fornecer imagens com alta resolução espástica, penetração profunda e múltiplos contrastes. Além disso, o sistema de imagem fotoacâmica em tempo real é desejável observar as atividades hemodinâmicas da vasculatura de pequenos animais, que podem ser usadas para pesquisar o monitoramento dinâmico de características fisiológicas de pequenos animais. Aqui, um imager fotoacoustic de varredura dupla é apresentado, apresentando uma função de imagem de modo duplo comutavel. A imagem de campo largo é conduzida por um estágio de tradução motorizada bidimensional, enquanto a imagem em tempo real é realizada com galvanômetros. Ao definir diferentes parâmetros e modos de imagem, a visualização in vivo da rede vascular de pequenos animais pode ser realizada. A imagem em tempo real pode ser usada para observar a mudança de pulso e a mudança de fluxo sanguíneo de induzida por drogas, etc. A imagem de campo largo pode ser usada para acompanhar a mudança de crescimento da vasculatura tumoral. São fáceis de serem adotados em diversas áreas da pesquisa básica de biomedicina.

Introdução

No campo biomédico básico, pequenos animais podem simular a função fisiológica humana. Portanto, a imagem de pequenos animais desempenha um papel importante na orientação da pesquisa de doenças homólogas humanas e na busca de um tratamento eficaz¹. A imagem fotoacâmica (PAI) é uma técnica de imagem não invasiva que combina as vantagens da imagem óptica e da imagem de ultrassom². A microscopia fotoacústica (PAM) é um valioso método de imagem para pesquisa básica de animais de pequeno porte³. Pam pode facilmente obter imagens de alta resolução, penetração profunda, alta especificidade e alto contraste com base na excitação óptica e detecção de ultrassom⁴.

Um laser de pulso com um comprimento de onda específico é absorvido por cromóforos endógenos de tecidos. Posteriormente, a temperatura do tecido sobe, o que resulta na produção de ondas ultrassônicas induzidas por foto. As ondas ultrassônicas podem ser detectadas por um transdutor ultrassônico. Após aquisição de sinal e reconstrução de imagem, a distribuição espacial do absorvente pode ser obtida⁵. Por um lado, a visualização da rede vascular de órgãos inteiros requer um amplo campo de visão. O processo de varredura em larga área geralmente leva muito tempo para garantir alta resolução^6,7,8. Por outro lado, observar as atividades hemodinâmicas de pequenos animais requer imagens rápidas em tempo real. A imagem em tempo real é benéfica para estudar os sinais vitais de pequenos animais em tempo real^9,10,11. O campo de visão da imagem em tempo real geralmente é suficientemente pequeno para garantir uma alta taxa de atualização. Assim, muitas vezes há uma troca entre alcançar um amplo campo de visão e imagens em tempo real. Anteriormente, dois sistemas diferentes eram usados para imagens em larga campo ou imagens em tempo real, separadamente.

Este trabalho relata um imager fotoacústico de varredura dupla (DRS-PAI), que integrou imagens de campo largo com base em um estágio de tradução motorizada bidimensional e imagens em tempo real baseadas em um scanner galvanômetro de dois eixos. O modo de imagem de campo largo (WIM) é realizado para mostrar morfologia vascular. Para o modo de imagem em tempo real (RIM), existem atualmente duas funções. Primeiro, o RIM pode fornecer imagens de varredura B em tempo real. Medindo o deslocamento da vasculatura ao longo da direção de profundidade, as características da respiração ou pulso podem ser reveladas. Em segundo lugar, o RIM pode medir quantitativamente a área específica na imagem WIM. Ao fornecer imagens comparáveis das regiões locais de WIM, os detalhes da mudança local podem ser revelados com precisão. O sistema projeta uma transição flexível entre imagens de campo amplo de visualização vascular e imagens em tempo real da dinâmica local. O sistema é desejável em pesquisas biomédicas básicas onde há necessidade de imagens de pequenos animais.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes fornecidas pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Normal do Sul da China, Guangzhou, China.

1. Configuração do sistema

1. Caminho óptico(Figura 1)
   1. Use um laser de pulso de 532 nm como fonte de laser do sistema. Defina a taxa de repetição do laser para 10 kHz, a energia de saída para 100% e a configuração do gatilho externo para o gatilho externo usando um programa definido pelo usuário.
   2. Acople o raio laser à fibra de modo único (SMF) através de um acoalador de fibra óptica (FC1). Cobrem o raio laser usando um collimador de fibra óptica (FC2) em um estágio motorizado bidimensional (Motor, velocidade máxima: 20 mm/s).
   3. Desvie o raio laser usando um scanner galvanômetro de dois eixos (Galva). Use um espelho movevel (M1) para refletir o feixe. Concentre o feixe através de uma lente objetiva de 4× (OL, abertura numérica: 0,1).
   4. Use um suporte de tradutor XY (TM) para corrigir o transdutor ultrassônico oco auto-fabricado (UT, frequência central: 25 MHz; Largura de banda: mais de 90%; Orifício central: 3 mm) na parte inferior do OL¹². Passe o feixe focado através do buraco central do transdutor ultrassônico.
2. Caminho de digitalização
   1. Bloqueie a Galva usando uma matriz de portão programável de campo (FPGA 2) durante o WIM. Defina o intervalo de varredura apropriado e a velocidade de digitalização por um programa definido pelo usuário.
   2. Bloqueie o motor usando uma matriz de portão programável de campo (FPGA 1) durante o RIM. Defina a frequência de digitalização e o número de pontos de varredura usando FPGA 2. Use um programa definido pelo usuário para controlar o início e parar a varredura.
3. Aquisição de dados
   1. Use um amplificador de 50 dB (AMP) para amplificar o sinal PA. Digitalizar o sinal pelo cartão de aquisição de dados (DAQ). Obtenha o sinal de gatilho através de FPGA 1 ou FPGA 2.
   2. Use uma unidade de processamento gráfica (GPU) para processar dados e exibir imagens em paralelo¹³.
4. Sistema de imagem CCD
   1. Use um LED branco em forma de anel (Temperatura da cor: 6500 K; Illuminance: 40000 lux; Diâmetro: 7,5 cm) como fonte de iluminação. Remova M1, use um espelho fixo (M2) para refletir a luz.
   2. Registo as imagens usando uma câmera CCD (6,3 milhões de pixels) no sistema de imagem PA. Exibir as imagens com um software de exibição.

2. Alinhamento do sistema

1. Selecione um reservatório de água (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; janela inferior: 3 cm × 3 cm). Cubra todo o reservatório de água usando uma membrana de polietileno (membrana grossa: 10 μm). Adicione água ultrauso suficiente.
2. Coloque o reservatório de água na etapa de trabalho.
3. Ligue o interruptor laser. Selecione o programa de controle a laser. Pré-aqueça por 5 minutos. Pressione o botão "ON" no interruptor de bombeamento. Defina os parâmetros de laser conforme a etapa 1.1.1. Abra o defletor do laser.
4. Selecione o programa coletado da linha A. Pressione o botão "Iniciar" para capturar o sinal de ponto único e exibir amplitude e espectro do sinal atual da linha A.
5. Coloque uma lâmina no fundo do reservatório de água. Mergulhe a parte inferior da UT no reservatório de água para acoplamento acústico. Evite bolhas na parte inferior da UT.
6. Ajuste a posição de Galva, ajuste o tradutor XY entre UT e OL para evitar sinal de oscilação e certifique-se de que isso seja confocal.
7. Ajuste a altura do estágio de trabalho para maximizar a amplitude do sinal e determine a posição de foco.

3. Experimento animal

1. Use um mouse BALB/c de 5\u20126 semanas de idade com um peso corporal de 20\u201230 g.
2. Anestesiar o animal usando uretano (1 g/kg) injetado intraperitoneally antes do experimento.
3. Realizar transição entre WIM e RIM.
   1. Use um transdutor ultrassônico planar. Raspe a pele na parte de trás do mouse usando um aparador e creme depilatório. Coloque o mouse no suporte (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) na posição propensa.
   2. Permita que a região de imagem esteja em contato com a membrana de polietileno usando gel de ultrassom. Evite bolhas na parte de contato.
   3. Coloque o suporte no estágio de trabalho para acoplamento acústico. Siga os passos 2.3\u20122.4 para iniciar o laser e coletar o sinal de linha A. Siga os passos 2.6\u20122.7 para alinhar. Pressione "Pare" para terminar a coleção após o alinhamento.
   4. Selecione o programa WIM. Nomeie a pasta recém-criada. Defina o parâmetro de digitalização em 20 mm/s na guia "Velocidade de varredura", "20 mm*20 mm" na guia "Área de varredura" e "20" na guia "Passo". Clique no botão Coletar para iniciar a varredura.
   5. Clique no botão Parar para finalizar a digitalização após a aquisição. Clique em Devolver a Zero para trazer o Motor a zero. Feche o defletor do laser. Ajuste a configuração do gatilho para o gatilho interno. Pressione o botão OFF para o interruptor de bombeamento.
   6. Substitua o gatilho WIM como gatilho RIM e conecte-o ao gatilho externo do laser. Pressione o botão ON para o interruptor de bombeamento. Ajuste a configuração do gatilho para o gatilho externo. Clique no botão Sair para sair do programa WIM.
   7. Use a etapa 2.4 para coletar o sinal da linha A. Abra o defletor do laser. Siga os passos 2.6\u20122.7 para alinhar. Pressione Pare para finalizar a coleta após o alinhamento.
   8. Selecione o programa RIM. Nomeie a pasta recém-criada. Clique no botão Coletar para iniciar a varredura.
   9. Clique no botão Parar para finalizar a digitalização após concluir a aquisição. Clique no botão Sair para sair do programa RIM.
   10. Eutanize o animal usando luxação cervical na conclusão da imagem.
4. Conduzir WIM de visualização vascular.
   1. Use um transdutor ultrassônico focado (frequência central: 25 MHz; Largura de banda: mais de 90%; Distância focal: 8 mm). Remova o cabelo da orelha ou couro cabeludo dos ratos.
      1. Use um bisturi para fazer uma pequena incisão no lado lateral da parte superior temporal craniana do mouse (profundidade para o crânio). Use uma tesoura oftálmica para começar a partir desta incisão. Corte o couro cabeludo ao redor do lado externo do crânio. Comprimir o ponto de sangramento para parar de sangrar. Lave a ferida com soro fisiológico normal. Coloque o mouse no suporte.
   2. Permita que a região de imagem esteja em contato com a membrana de polietileno usando gel de ultrassom. Evite bolhas na região de contato(Figura Complementar 1).
   3. Coloque o suporte no palco de trabalho para acoplamento acústico. Use as etapas 2.3\u20122.4 para abrir o laser e coletar sinal de linha A. Use a etapa 2.6\u20122.7 para alinhar. Pressione Pare para finalizar a coleta após o alinhamento.
   4. Selecione o programa WIM. Nomeie a pasta recém-criada. Defina o parâmetro de digitalização como "10 mm/s" na guia "Velocidade de varredura", "10 mm*10 mm" sob a guia "Área de varredura" e "10" na guia "Passo". Clique no botão Coletar para iniciar a varredura.
   5. Clique no botão Parar para finalizar a digitalização após concluir a aquisição. Clique no Return to Zero para fazer o Motor voltar a zero. Clique no botão Sair para sair do programa WIM.
   6. Eutanize o animal na conclusão do procedimento enquanto o animal ainda está sob anestesia.
5. Conduzir RIM para monitoramento dinâmico de animais de pequeno porte.
   1. Raspe o cabelo do abdômen do rato. Coloque o mouse sobre o suporte na posição supina.
   2. Permita que a região de imagem esteja em contato com a membrana de polietileno usando gel de ultrassom. Evite bolhas na região de contato.
   3. Coloque o suporte no palco de trabalho para acoplamento acústico. Execute as etapas 2.3\u20122.4 para iniciar o laser e coletar o sinal de linha A. Execute a etapa 2.6\u20122.7 para alinhar. Pressione Pare para finalizar a coleta após o alinhamento.
   4. Selecione o programa RIM. Nomeie a pasta recém-criada. Clique no botão Coletar para iniciar a varredura.
   5. Clique no botão Parar para finalizar a digitalização após concluir a aquisição. Clique no botão Sair para sair do programa RIM.
6. Use os dados RIM para reconstrução da projeção de amplitude máxima (MAP) ao longo da direção de profundidade pelo programa definido pelo usuário. Observe as mudanças dinâmicas no animal.

Resultados

O esquema do DRS-PAI é mostrado na Figura 1. O sistema permite uma comutação flexível e repetível entre WIM e RIM. O sinal PA adquirido é processado rapidamente para gerar imagens PA B-Scan e MAP. A câmera CCD pode fornecer fotografias de amostras.

Todos os componentes do DRS-PAI são integrados e montados em uma configuração de imager(Figura 2),facilitando a montagem e opere. No WIM, é utilizada a varredura contínua de ras...

Discussão

Aqui apresentamos um biomedusor fotoacâmico de pequeno animal para visualização vascular não invasiva que foi projetado e desenvolvido para capturar a estrutura da vasculatura e a mudança dinâmica relacionada do sangue. A vantagem do DRS-PAI é que ele integra o WIM e o RIM em um sistema, o que facilita o estudo da estrutura de rede vascular dinâmica e vascular de pequenos animais. O sistema pode fornecer visualização vascular de campo amplo de alta resolução e dinâmica sanguínea em tempo real.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 bit multi-purpose digitizer	Spectrum	M3i.3221	Data acquisition card
A-line collected program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
Amplifier	RF Bay	LNA-650	Amplifier
Depilatory Cream	Veet	33-II	Animal depilatory
Fiberport Coupler	Thorlab	PAF-X-7-A	Fiber Coupler
Field Programmable Gate Array	Altera	Cyclone IV	Trigger Control
Fixed Focus Collomation Packages	Thorlabs	F240FC-532	Fiber Collimator
Foused ultrasonic transducer	Self-made
Graphics Processing Unit	NVIDIA	GeForce GTX 1060	Processing data
Holder	Self-made		Animal fixation
Laser control program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
Mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	BALB/c	Animal Model
Microscope camera	Mshot	MS60	CCD camera
Microscope Objective	Daheng Optics	GCO-2111	Objective Lens
Mirror	Daheng Optics	GCC-1011	Moveable/Fixed Mirror
Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner	Century Sunny	S8107	real-time scanner
Mshot image analysis system	Mshot		Display software
Normal Saline	CR DOUBLE-CRANE	H34023609	Normal Saline
Ophthalmic Scissors	SUJIE		Scalp Remove
Planar ultrasonic transducer	Self-made
Plastic Wrap	HJSJLSL		Polyethylene Membrane
Program Control Software	National Instrument	LabVIEW	User-defined Program
Pulsed Q-swithched Laser	Laser-export	DTL-314QT	532-nm pulse Laser
Real-time imaging program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
Ring-shaped white LED	Self-made
Shaver	Codos	CP-9200	Animal Shaver
Single-Mode Fibers	Nufern	460-HP	Single-mode fiber
Surgical Blade	SUJIE	11	Blade
Surgical Scalpel	SUJIE	7	Scalp Remove
Translation Stage	Jiancheng Optics	LS2-25T	wide-field scanning stage
Ultrasonic Transducer	Self-made
Ultrasound gel	GUANGGONG PAI	ZC4252418	Acoustic Coupling
Urethane	Tokyo Chemical Industry	C0028	Animal Anestheized
Water tank	Self-made
Wide-field imaging program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
XY Translator Mount	Self-made