Doppia scansione Raster Photoacoustic Small-Animal Imager per la visualizzazione vascolare

Riepilogo

È stato progettato un doppio imager fotoacustico a scansione raster, che integrava l'imaging a campo largo e l'imaging in tempo reale.

Abstract

L'imaging di reti vascolari su piccoli animali ha svolto un ruolo importante nella ricerca biomedica di base. La tecnologia di imaging fotoacustico ha un grande potenziale di applicazione nell'imageologia dei piccoli animali. L'imaging fotoacustico ad ampio campo di piccoli animali può fornire immagini ad alta risoluzione spaziotemporale, penetrazione profonda e contrasti multipli. Inoltre, il sistema di imaging fotoacustico in tempo reale è auspicabile per osservare le attività emodinamiche della vascucolatura dei piccoli animali, che possono essere utilizzate per ricercare il monitoraggio dinamico delle caratteristiche fisiologiche dei piccoli animali. Qui viene presentato un imager fotoacustico a scansione doppia raster, dotato di una funzione di imaging a doppia modalità commutabile. L'imaging a campo largo è guidato da una fase di traslazione motorizzata bidimensionale, mentre l'imaging in tempo reale è realizzato con galvanometri. Impostando diversi parametri e modalità di imaging, è possibile eseguire la visualizzazione in vivo della rete vascolare di piccoli animali. L'imaging in tempo reale può essere utilizzato per osservare il cambiamento cardiaco e il cambiamento del flusso sanguigno indotto dal farmaco, ecc. L'imaging a campo largo può essere utilizzato per tenere traccia del cambiamento di crescita della vascucolatura tumorale. Questi sono facili da adottare in vari settori della ricerca biomedicina di base.

Introduzione

Nel campo biomedico di base, i piccoli animali possono simulare la funzione fisiologica umana. Pertanto, l'imaging di piccoli animali svolge un ruolo importante nel guidare la ricerca di malattie omologhe umane e nella ricerca di un trattamento^{efficace 1}. L'imaging fotoacustico (PAI) è una tecnica di imaging non invasiva che combina i vantaggi dell'imaging ottico e dell'imaging ad^{ultrasuoni 2}. La microscopia fotoacustica (PAM) è un prezioso metodo di imaging per la ricerca di base di piccoli animali³. PAM può facilmente ottenere immagini ad alta risoluzione, penetrazione profonda, ad alta specificità e ad alto contrasto basate sull'eccitazione ottica e sul rilevamento degli ultrasuoni⁴.

Un laser a impulsi con una lunghezza d'onda specifica viene assorbito da cromofori endogeni dei tessuti. Successivamente, la temperatura del tessuto aumenta, il che si traduce nella produzione di onde ultrasoniche foto indotte. Le onde ultrasoniche possono essere rilevate da un trasduttore ad ultrasuoni. Dopo l'acquisizione del segnale e la ricostruzione dell'immagine, la distribuzione spaziale dell'assorbitore può essere^{ottenuta 5}. Da un lato, la visualizzazione della rete vascolare di organi interi richiede un ampio campo visivo. Il processo di scansione a campo largo di solito richiede molto tempo per garantire un'alta^{risoluzione 6,7,8}. D'altra parte, osservare le attività emodinamiche dei piccoli animali richiede immagini veloci in tempo reale. L'imaging in tempo reale è utile per studiare i segni vitali dei piccoli animali in tempo^{reale 9,10,11}. Il campo visivo dell'imaging in tempo reale è in genere sufficientemente piccolo da garantire un alto tasso di aggiornamento. Pertanto, c'è spesso un compromesso tra il raggiungimento di un ampio campo visivo e l'imaging in tempo reale. In precedenza, due diversi sistemi erano utilizzati per l'imaging a campo largo o l'imaging in tempo reale, separatamente.

Questo lavoro riporta un doppio imager fotoacustico a scansione raster (DRS-PAI), che integrava l'imaging a campo largo basato su uno stadio di traduzione motorizzato bidimensionale e l'imaging in tempo reale basato su uno scanner galvanometrico a due assi. La modalità di imaging a campo largo (WIM) viene eseguita per mostrare la morfologia vascolare. Per la modalità di imaging in tempo reale (RIM), attualmente ci sono due funzioni. Innanzitutto, RIM può fornire immagini B-scan in tempo reale. Misurando lo spostamento della vascucolatura lungo la direzione di profondità, si possono rivelare le caratteristiche della respirazione o dell'impulso. In secondo luogo, il RIM può misurare quantitativamente l'area specifica nell'immagine WIM. Fornendo immagini comparabili delle regioni WIM locali, i dettagli del cambiamento locale possono essere rivelati con precisione. Il sistema progetta una transizione flessibile tra l'imaging a campo largo della visualizzazione vascolare e l'imaging in tempo reale della dinamica locale. Il sistema è auspicabile nella ricerca biomedica di base, dove è necessaria l'imaging di piccoli animali.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti nel rispetto delle linee guida fornite dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della South China Normal University, Guangzhou, Cina.

1. Configurazione del sistema

1. Percorso ottico (Figura 1)
   1. Utilizzare un laser a impulsi da 532 nm come sorgente laser di sistema. Impostare la velocità di ripetizione del laser su 10 kHz, l'energia di uscita al 100% e l'impostazione del trigger sul trigger esterno utilizzando un programma definito dall'utente.
   2. Accoppiare il raggio laser alla fibra monomodale (SMF) tramite un accoppiatore in fibra ottica (FC1). Collimare il raggio laser utilizzando un collimatore in fibra ottica (FC2) su uno stadio motorizzato bidimensionale (Motore, velocità massima: 20 mm/s).
   3. Deviare il raggio laser utilizzando uno scanner galvanometrico a due assi (Galva). Utilizzare uno specchio spostabile (M1) per riflettere la trave. Mettere a fuoco il fascio attraverso una lente × 4 punti (OL, apertura numerica: 0,1).
   4. Utilizzare un supporto per traduttori XY (TM) per fissare il trasduttore ad ultrasuoni cavo autoprodotto (UT, frequenza centrale: 25 MHz; Larghezza di banda: oltre il 90%; Foro centrale: 3 mm) sul fondo dell'OL¹². Passare il fascio focalizzato attraverso il foro centrale del trasduttore ad ultrasuoni.
2. Percorso di scansione
   1. Bloccare galva utilizzando un array di gate programmabile sul campo (FPGA 2) durante WIM. Impostare l'intervallo di scansione e la velocità di scansione appropriati in base a un programma definito dall'utente.
   2. Bloccare il motore utilizzando un array di gate programmabile sul campo (FPGA 1) durante RIM. Impostare la frequenza di scansione e il numero di punti di scansione utilizzando FPGA 2. Utilizzare un programma definito dall'utente per controllare l'avvio e interrompere la scansione.
3. Acquisizione dati
   1. Utilizzare un amplificatore da 50 dB (AMP) per amplificare il segnale PA. Digitalizzare il segnale tramite la scheda di acquisizione dati (DAQ). Ottenere il segnale di innesco tramite FPGA 1 o FPGA 2.
   2. Utilizzare un'unità di elaborazione grafica (GPU) per elaborare i dati e visualizzare le immagini in parallelo¹³.
4. Sistema di imaging CCD
   1. Utilizzare un LED bianco a forma di anello (temperatura del colore: 6500 K; Illuminamento: 40000 lux; Diametro: 7,5 cm) come fonte di illuminazione. Rimuovere M1, utilizzare uno specchio fisso (M2) per riflettere la luce.
   2. Registra le immagini utilizzando una fotocamera CCD (6,3 milioni di pixel) sul sistema di imaging PA. Visualizzare le immagini con un software di visualizzazione.

2. Allineamento del sistema

1. Selezionare un serbatoio dell'acqua (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; finestra inferiore: 3 cm × 3 cm). Coprire l'intero serbatoio dell'acqua utilizzando una membrana in polietilene (membrana spessa: 10 μm). Aggiungere acqua ultrapura sufficiente.
2. Posizionare il serbatoio dell'acqua sulla fase di lavoro.
3. Accendere l'interruttore laser. Selezionare il programma di controllo laser. Preriscaldare per 5 minuti. Premere il tasto "ON" sull'interruttore di pompaggio. Impostare i parametri laser come da passaggio 1.1.1. Apri il deflettori del laser.
4. Selezionare il programma raccolto dalla riga A. Premere il pulsante "Start" per acquisire il segnale a punto singolo e visualizzare l'ampiezza e lo spettro del segnale di linea A corrente.
5. Posizionare una lama sul fondo del serbatoio dell'acqua. Immergere la parte inferiore dell'UT nel serbatoio dell'acqua per l'accoppiamento acustico. Evitare bolle nella parte inferiore dell'UT.
6. Regolare la posizione di Galva, regolare il traduttore XY tra UT e OL per evitare il segnale di oscillazione e assicurarsi che sia confocale.
7. Regolare l'altezza della fase di lavoro per massimizzare l'ampiezza del segnale e determinare la posizione di messa a fuoco.

3. Esperimento animale

1. Utilizzare un mouse BALB/c di 5\u20126 settimane con un peso corporeo di 20\u201230 g.
2. Anestetizzare l'animale usando uretano (1 g/kg) iniettato per via intraperitoneale prima dell'esperimento.
3. Condurre la transizione tra WIM e RIM.
   1. Utilizzare un trasduttore ad ultrasuoni planare. Radere la pelliccia sul retro del mouse usando un trimmer e una crema depilatoria. Posizionare il mouse sul supporto (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) in posizione soggetta.
   2. Consentire alla regione di imaging di essere a contatto con la membrana in polietilene utilizzando il gel ad ultrasuoni. Evitare bolle nella parte di contatto.
   3. Posizionare il supporto sul palco di lavoro per l'accoppiamento acustico. Seguire i passaggi 2.3\u20122.4 per avviare il laser e raccogliere il segnale di linea A. Seguire i passaggi 2.6\u20122.7 per allinearli. Premere "Interrompi" per terminare la raccolta dopo l'allineamento.
   4. Selezionare il programma WIM. Assegnare un nome alla cartella appena creata. Impostare il parametro di scansione su 20 mm/s nella scheda "Velocità di scansione", "20 mm*20 mm" nella scheda "Area di scansione" e "20" nella scheda "Passo". Fare clic sul pulsante Raccogli per avviare la scansione.
   5. Fare clic sul pulsante Interrompi per terminare la scansione dopo l'acquisizione. Fate clic su Torna a zero (Return to Zero) per portare il motore a zero. Chiudi il deflettori laser. Impostare l'impostazione del trigger sul trigger interno. Premere il tasto OFF per l'interruttore di pompaggio.
   6. Sostituire il trigger WIM come trigger RIM e collegarlo al trigger laser esterno. Premere il tasto ON per l'interruttore di pompaggio. Impostare l'impostazione del trigger sul trigger esterno. Fare clic sul pulsante Esci per uscire dal programma WIM.
   7. Utilizzare il passaggio 2.4 per raccogliere il segnale della linea A. Apri il deflettori laser. Seguire i passaggi 2.6\u20122.7 per allinearli. Premere Interrompi per terminare la raccolta dopo l'allineamento.
   8. Selezionate il programma RIM. Assegnare un nome alla cartella appena creata. Fare clic sul pulsante Raccogli per avviare la scansione.
   9. Fare clic sul pulsante Interrompi per terminare la scansione dopo aver completato l'acquisizione. Fate clic sul pulsante Esci (Exit) per uscire dal programma RIM.
   10. Eutanasia l'animale usando la lussazione cervicale al termine dell'imaging.
4. Condurre WIM di visualizzazione vascolare.
   1. Utilizzare un trasduttore ad ultrasuoni focalizzato (frequenza centrale: 25 MHz; Larghezza di banda: oltre il 90%; Lunghezza focale: 8 mm). Rimuovere i capelli dell'orecchio o del cuoio capelluto dei topi.
      1. Usa un bisturi per fare una piccola incisione sul lato laterale della parte superiore temporale cranica del topo (profondità al cranio). Usa le forbici oftalmiche per iniziare da questa incisione. Tagliare il cuoio capelluto intorno al lato esterno del cranio. Comprimere il punto di sanguinamento per interrompere il sanguinamento. Lavare la ferita con la normale soluzione salina. Posizionare il mouse sul supporto.
   2. Consentire alla regione di imaging di essere a contatto con la membrana in polietilene utilizzando il gel ad ultrasuoni. Evitare bolle nella regione di contatto (Figura complementare 1).
   3. Posizionare il supporto sul palco di lavoro per l'accoppiamento acustico. Utilizzare i passaggi 2.3\u20122.4 per aprire il laser e raccogliere il segnale di linea A. Utilizzare il passaggio 2.6\u20122.7 per allinearlo. Premere Interrompi per terminare la raccolta dopo l'allineamento.
   4. Selezionare programma WIM. Assegnare un nome alla cartella appena creata. Impostare il parametro di scansione su "10 mm/s" nella scheda "Velocità di scansione", "10 mm*10 mm" sotto la scheda "Area di scansione" e "10" nella scheda "Passo". Fare clic sul pulsante Raccogli per avviare la scansione.
   5. Fare clic sul pulsante Interrompi per terminare la scansione dopo aver completato l'acquisizione. Fate clic sul pulsante Torna a zero (Return to Zero) per fare in modo che il motore ritorni a zero. Fare clic sul pulsante Esci per uscire dal programma WIM.
   6. Eutanasia l'animale al termine della procedura mentre l'animale è ancora in anestesia.
5. Condurre RIM per il monitoraggio dinamico dei piccoli animali.
   1. Radersi i capelli dell'addome del topo. Posizionare il mouse sul supporto in posizione supina.
   2. Consentire alla regione di imaging di essere a contatto con la membrana in polietilene utilizzando il gel ad ultrasuoni. Evitare bolle nell'area di contatto.
   3. Posizionare il supporto sul palco di lavoro per l'accoppiamento acustico. Eseguire i passaggi 2.3\u20122.4 per avviare il laser e raccogliere il segnale di linea A. Eseguire il passaggio 2.6\u20122.7 per allinearlo. Premere Interrompi per terminare la raccolta dopo l'allineamento.
   4. Selezionate il programma RIM. Assegnare un nome alla cartella appena creata. Fare clic sul pulsante Raccogli per avviare la scansione.
   5. Fare clic sul pulsante Interrompi per terminare la scansione dopo aver completato l'acquisizione. Fate clic sul pulsante Esci (Exit) per uscire dal programma RIM.
6. Utilizzate i dati RIM per la ricostruzione della proiezione di ampiezza massima (MAP) lungo la direzione di profondità per programma definito dall'utente. Osserva i cambiamenti dinamici nell'animale.

Risultati

Lo schema del DRS-PAI è illustrato nella figura 1. Il sistema consente il passaggio flessibile e ripetibile tra WIM e RIM. Il segnale PA acquisito viene elaborato rapidamente per generare immagini PA B-Scan e MAP. La telecamera CCD può fornire fotografie di campioni.

Tutti i componenti del DRS-PAI sono integrati e assemblati in una configurazione di imager (Figura 2), semplificando l'assemblaggio e il funzionamento. Nel WIM viene ut...

Discussione

Qui abbiamo presentato un doppio imager fotoacustico a scansione raster per la visualizzazione vascolare non invasiva che è stato progettato e sviluppato per catturare la struttura della vascolarizzazione e il relativo cambiamento dinamico del sangue. Il vantaggio di DRS-PAI è che integra il WIM e il RIM in un unico sistema, il che rende più facile studiare la struttura della rete dinamica vascolare e vascolare dei piccoli animali. Il sistema può fornire una visualizzazione vascolare ad ampio campo ad alta risoluzion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 bit multi-purpose digitizer	Spectrum	M3i.3221	Data acquisition card
A-line collected program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
Amplifier	RF Bay	LNA-650	Amplifier
Depilatory Cream	Veet	33-II	Animal depilatory
Fiberport Coupler	Thorlab	PAF-X-7-A	Fiber Coupler
Field Programmable Gate Array	Altera	Cyclone IV	Trigger Control
Fixed Focus Collomation Packages	Thorlabs	F240FC-532	Fiber Collimator
Foused ultrasonic transducer	Self-made
Graphics Processing Unit	NVIDIA	GeForce GTX 1060	Processing data
Holder	Self-made		Animal fixation
Laser control program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
Mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	BALB/c	Animal Model
Microscope camera	Mshot	MS60	CCD camera
Microscope Objective	Daheng Optics	GCO-2111	Objective Lens
Mirror	Daheng Optics	GCC-1011	Moveable/Fixed Mirror
Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner	Century Sunny	S8107	real-time scanner
Mshot image analysis system	Mshot		Display software
Normal Saline	CR DOUBLE-CRANE	H34023609	Normal Saline
Ophthalmic Scissors	SUJIE		Scalp Remove
Planar ultrasonic transducer	Self-made
Plastic Wrap	HJSJLSL		Polyethylene Membrane
Program Control Software	National Instrument	LabVIEW	User-defined Program
Pulsed Q-swithched Laser	Laser-export	DTL-314QT	532-nm pulse Laser
Real-time imaging program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
Ring-shaped white LED	Self-made
Shaver	Codos	CP-9200	Animal Shaver
Single-Mode Fibers	Nufern	460-HP	Single-mode fiber
Surgical Blade	SUJIE	11	Blade
Surgical Scalpel	SUJIE	7	Scalp Remove
Translation Stage	Jiancheng Optics	LS2-25T	wide-field scanning stage
Ultrasonic Transducer	Self-made
Ultrasound gel	GUANGGONG PAI	ZC4252418	Acoustic Coupling
Urethane	Tokyo Chemical Industry	C0028	Animal Anestheized
Water tank	Self-made
Wide-field imaging program	National Instrument	LabVIEW	User-defined program
XY Translator Mount	Self-made