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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.

Zusammenfassung

Die klonale Hämatopoese ist eine weit verbreitete altersbedingte Erkrankung, die sich aus der Anhäufung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) ergibt. Mutationen in Treibergenen, die zelluläre Fitness verleihen, können zur Entwicklung expandierender HSPC-Klone führen, die zunehmend zu Nachkommenleukozyten führen, die die somatische Mutation beherbergen. Da klonale Hämatopoese mit Herzerkrankungen, Schlaganfall und Mortalität in Verbindung gebracht wurde, ist die Entwicklung experimenteller Systeme, die diese Prozesse modellieren, der Schlüssel zum Verständnis der Mechanismen, die diesem neuen Risikofaktor zugrunde liegen. Knochenmarktransplantationsverfahren mit myeloablativer Konditionierung bei Mäusen, wie z. B. Ganzkörperbestrahlung (TBI), werden häufig eingesetzt, um die Rolle von Immunzellen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen. Eine gleichzeitige Schädigung der Knochenmarknische und anderer interessensvoller Stellen wie Herz und Gehirn ist bei diesen Verfahren jedoch unvermeidbar. Daher hat unser Labor zwei alternative Methoden entwickelt, um mögliche Nebenwirkungen durch TBI zu minimieren oder zu vermeiden: 1) Knochenmarktransplantation mit Bestrahlungsabschirmung und 2) adoptive BMT bei nicht konditionierten Mäusen. In abgeschirmten Organen bleibt die lokale Umgebung erhalten, was die Analyse der klonalen Hämatopoese ermöglicht, während die Funktion der ansässigen Immunzellen ungestört ist. Im Gegensatz dazu hat die adoptive BMT bei nicht konditionierten Mäusen den zusätzlichen Vorteil, dass sowohl die lokale Umgebung der Organe als auch die hämatopoetische Nische erhalten bleiben. Hier vergleichen wir drei verschiedene hämatopoetische Zellrekonstitutionsansätze und diskutieren ihre Stärken und Grenzen für Studien zur klonalen Hämatopoese bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Einleitung

Klonale Hämatopoese (CH) ist eine Erkrankung, die häufig bei älteren Menschen beobachtet wird und als Folge eines erweiterten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellklons (HSPC) auftritt, der eine genetische Mutation trägt1. Es wurde vermutet, dass die meisten Individuen im Alter von 50 Jahren durchschnittlich fünf exonische Mutationen in jedem HSPC2erworben haben, aber die meisten dieser Mutationen werden zu wenig oder keinen phänotypischen Folgen für das Individuum führen. Wenn jedoch zufällig eine dieser Mutationen dem HSPC einen Wettbewerbsvorteil verschafft - z. B. durch die Förderung seiner Proliferation, Selbsterneuerung, Überleben oder einer Kombination davon - kann dies zu einer bevorzugten Expansion des mutierten Klons im Vergleich zu den anderen HSPCs führen. Infolgedessen wird sich die Mutation zunehmend durch das hämatopoetische System ausbreiten, da das mutierte HSPC zu reifen Blutzellen führt, was zu einer ausgeprägten Population mutierter Zellen im peripheren Blut führt. Während Mutationen in Dutzenden verschiedener Kandidatentreibergene mit klonalen Ereignissen innerhalb des hämatopoetischen Systems in Verbindung gebracht wurden, sind unter diesen Mutationen in DNA-Methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) und zehn elf Translokation 2 (TET2) am häufigsten3. Mehrere epidemiologische Studien haben ergeben, dass Personen, die diese genetischen Mutationen tragen, ein signifikant höheres Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), Schlaganfall und gesamtverursachende Mortalität haben3,4,5,6,7. Während diese Studien festgestellt haben, dass ein Zusammenhang zwischen CH und erhöhter Inzidenz von CVD und Schlaganfall besteht, wissen wir nicht, ob dieser Zusammenhang kausal oder ein gemeinsames Epiphänomen mit dem Alterungsprozess ist. Um diesen Zusammenhang besser zu verstehen, sind geeignete Tiermodelle erforderlich, die den menschlichen Zustand von CH korrekt rekapitulieren.

Mehrere CH-Tiermodelle wurden von unserer Gruppe und anderen mit Zebrafischen, Mäusen und nicht-menschlichen Primaten8,9,10,11,12,13,14erstellt. Diese Modelle verwenden häufig hämatopoetische Rekonstitutionsmethoden durch Transplantation genetisch veränderter Zellen, manchmal unter Verwendung der Cre-lox-Rekombination oder des CRISPR-Systems. Dieser Ansatz ermöglicht die Analyse einer spezifischen Genmutation in hämatopoetischen Zellen, um zu beurteilen, wie sie zur Krankheitsentwicklung beiträgt. Darüber hinaus verwenden diese Modelle oft kongenische oder Reporterzellen, um die Wirkungen mutierter Zellen von normalen oder Wildtypzellen zu unterscheiden. In vielen Fällen ist ein Vorkonditionierungsschema erforderlich, um hämatopoetische Spenderstammzellen erfolgreich zu transplantieren.

Derzeit kann die Transplantation von Knochenmark auf Empfängermäuse in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: 1) myeloablative Konditionierung und 2) nicht konditionierte Transplantation. Die myeloablative Konditionierung kann durch eine von zwei Methoden erreicht werden, nämlich Die Ganzkörperbestrahlung (TBI) oder die Chemotherapie15. TBI wird durchgeführt, indem der Empfänger einer tödlichen Dosis Gamma- oder Röntgenbestrahlung unterzogen wird, wodurch DNA-Brüche oder Querverbindungen innerhalb sich schnell teilender Zellen erzeugt werden, wodurch sie irreparabel werden16. Busulfan und Cyclophosphamid sind zwei häufig verwendete Chemotherapeutika, die die hämatopoetische Nische stören und in ähnlicher Weise DNA-Schäden an sich schnell teilenden Zellen verursachen. Das Nettoergebnis der myeloablativen Vorkonditionierung ist die Apoptose hämatopoetischer Zellen, die das hämatopoetische System des Empfängers zerstört. Diese Strategie ermöglicht nicht nur die erfolgreiche Transplantation der Spender-HSPCs, sondern kann auch eine Transplantatabstoßung verhindern, indem das Immunsystem des Empfängers unterdrückt wird. Die myeloablative Vorkonditionierung hat jedoch schwere Nebenwirkungen wie Schäden an Geweben und Organen und deren ansässigen Immunzellen sowie Die Zerstörung der nativen Knochenmarknische17. Daher wurden alternative Methoden vorgeschlagen, um diese unerwünschten Nebenwirkungen zu überwinden, insbesondere im Hinblick auf Schäden an den interessierender Organen. Diese Methoden umfassen die abgeschirmte Bestrahlung von Empfängermäusen und die adoptive BMT auf nicht konditionierte Mäuse9,17. Die Abschirmung des Thorax, der Bauchhöhle, des Kopfes oder anderer Regionen vor Bestrahlung durch die Platzierung einer Bleibarriere schützt das interessierende Gewebe vor den schädlichen Auswirkungen der Bestrahlung und erhält seine ansässige Immunzellpopulation. Auf der anderen Seite hat die adoptive BMT von HSPCs für nicht konditionierte Mäuse einen zusätzlichen Vorteil, da sie die native hämatopoetische Nische bewahrt. In diesem Manuskript beschreiben wir die Protokolle und Ergebnisse der HSPC-Transplantation nach mehreren Transplantationsschemata bei Mäusen, insbesondere die Abgabe von HSPC an TBI-Mäuse, an Mäuse, die teilweise vor Bestrahlung geschützt sind, und an nicht konditionierte Mäuse. Das übergeordnete Ziel ist es, den Forschern zu helfen, die verschiedenen physiologischen Auswirkungen jeder Methode zu verstehen und zu verstehen, wie sie die experimentellen Ergebnisse im Rahmen von CH und Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflussen.

Protokoll

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Virginia genehmigt.

1. Vor der Vorkonditionierung

  1. Legen Sie die Empfängermäuse ~24 h vor der Bestrahlung auf antibiotikahaltiges Wasser (5 mM Sulfamethoxazol, 0,86 mM Trimethoprim). Dies ist notwendig, um eine Infektion zu verhindern, da das Immunsystem nach der Bestrahlung unterdrückt und nach der Bestrahlung für 2 Wochen aufrechterhalten wird. Ergänzen Sie Mäuse an dieser Stelle mit einem Ernährungs- / Trinkgel, um die Fütterung zu fördern und Gewichtsverlust und Austrocknung nach der Bestrahlung zu verhindern.

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Abbildung 1: Bilder, die verschiedene Vorkonditionierungs-Setups zeigen. (A) Pie-cage Ganzkörperbestrahlungsaufbau mittels Gammastrahl (Cäsium-137): Der Strahlungsstrahl kommt von der Rückseite des Bestrahlungsgeräts in y-Achsenrichtung (horizontale Strahlung). (B) Mauskäfig Ganzkörperbestrahlungsaufbau mittels Röntgenstrahlen: Der Mauskäfig wird in die reflektierende Kammer gelegt. Der Strahlungsstrahl kommt von der Oberseite des Bestrahlungskörpers in Form eines Kegels (vertikale Strahlung). Der Abstand von der Strahlungsquelle zum Käfig beträgt 530 mm. (C) Einstellbares Fach im Röntgenstrahler: Dieser Aufbau wird für die teilweise abgeschirmte Bestrahlung mittels Röntgen verwendet. Der Strahlungsstrahl kommt von der Oberseite des Bestrahlungskörpers in Form eines Kegels (vertikale Strahlung). Der Abstand von der Strahlungsquelle zum Tablett beträgt 373 mm und der Radius beträgt 250 mm. (D) Thorax-Abschirmung: Anästhesierte Mäuse werden auf ein Tablett gelegt. Die Mäuse werden in Rückenlage in Rückenlage mit voll ausgestreckten Armen und Beinen in Rückenlage platziert. Das untere Ende des Bleischildes ist mit dem Xiphisternumknochen und das obere Ende mit dem Thymus ausgerichtet. (E) Abdominal-Abschirmung: Betäubtete Mäuse werden wie in der Thorax-Abschirmung platziert, wobei das untere Ende des Bleischildes mit dem Anus und das obere Ende unterhalb des Zwerchfells ausgerichtet sind. (F) Kopfabschirmungsbestrahlung mit Gammastrahlen (Cäsium-137): Die Forepaws der betäubten Maus werden abgeklebt und die Maus in einen konischen Rückhaltegriff gelegt. Der schwarze Bleischild (markiert) bedeckt den Kopf und die Ohren der Maus. Der Strahlungsstrahl kommt von der Rückseite des Bestrahlungsgerätes in Richtung der Y-Achse (horizontale Strahlung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Vorkonditionierung von Empfängermäusen (optional)

  1. Ganzkörperbestrahlung
    1. Setzen Sie die Empfängermäuse in einen gleichmäßig geschnittenen Tortenkäfig oder einen Mauskäfig in der reflektierenden Kammer innerhalb des berechneten Radius, um die gleiche Bestrahlungsdosis zu erhalten. Es wird jedoch empfohlen, maximal 8 Mäuse pro Tortenkäfig und 5 Mäuse pro Mauskäfig zu gewährleisten (Abbildung 1A, B).
    2. Um eine vollständige Myeloablation zu erreichen, stellen Sie sicher, dass die Empfängermäuse eine Gesamtstrahlendosis von 11 Gy in zwei 5,5 Gy-Fraktionen erhalten, die durch ein Intervall von 4-24 h getrennt sind.
      HINWEIS: Während eine optimale Transplantation durch die Implementierung eines 4-Stunden-Intervalls zwischen den Fraktionen erreicht werden kann, kann dies auf ein 24-Stunden-Intervall ausgedehnt werden, was hilfreich sein kann, wenn die Arbeit und / oder der Bestrahlungskörper nicht verfügbar sind.
  2. Teilweise abgeschirmte Bestrahlung
    1. Anästhesie der Empfängermäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (80–100 mg/kg) und Xylazin (5–10 mg/kg). Die Zurückhaltung der Mausbewegung ist entscheidend, um eine gleichmäßige Bestrahlung und einen wirksamen Schutz der Zielorgane während des Abschirmungsprozesses zu gewährleisten.
    2. Zur Thorax- und Abdomenabschirmung richten Sie den Strahlungsstrahl des Röntgenstrahlers vertikal zur Maus aus (Abbildung 1C).
      1. Positionieren Sie die betäubten Mäuse auf einer flachen Platte und zentrieren Sie die Strahlungsquelle von oben. Platzieren Sie die Mäuse umgekehrt in Rückenlage mit voll ausgestreckten Armen und Beinen (Abbildung 1D, E).
        HINWEIS: Die Röntgenbestrahlungsanlage ermöglicht für dieses Experiment, dass zwei Mäuse gleichzeitig innerhalb des effektiven Radius positioniert werden können, der eine gleichmäßige Bestrahlung ermöglicht. Während der effektive Radius auf der Grundlage des Abstands zwischen der Strahlungsquelle und der Schale berechnet wird, hängt die Anzahl der Tiere, die gleichzeitig bestrahlt werden können, vom spezifischen Bestrahlungskörper ab.
      2. Befestigen Sie die Pfoten der Mäuse mit Klebeband auf der Platte, um sicherzustellen, dass die Mäuse während des Bestrahlungsverfahrens immobilisiert werden. Platzieren Sie die Bleiabschirmung so, dass sie Bereiche abdeckt, die geschützt werden müssen.
      3. Für die Thoraxabschirmung bereiten Sie den Bleischild vor, indem Sie die Länge vom Xiphisternumknochen der Maus bis zum Thymus messen und die Dicke berechnen, die einen ausreichenden Schutz vor der Bestrahlungsquelle bietet. Platzieren Sie die Bleiabschirmung so, dass das untere Ende mit dem Xiphisternumknochen ausgerichtet ist. Das obere Ende der Bleibarriere passt in die Nähe des Thymus (Abbildung 1D).
      4. Bereiten Sie für die Bauchabschirmung den Bleischild vor, indem Sie die Länge vom Anus der Maus bis zur Membran messen und die Dicke berechnen, die einen ausreichenden Schutz vor der Bestrahlungsquelle bietet. Platzieren Sie die Bleiabschirmung so, dass das untere Ende mit dem Anus ausgerichtet ist. Das obere Ende der Bleiabschirmung passt unter die Membran (Abbildung 1E).
        HINWEIS: Die Lokalisierung des Bleischildes, um zwischen den Kohorten konsistent zu sein, kann einige Unterschiede in Bezug auf die Größe der Mäuse reduzieren.
    3. Zur Kopfabschirmung richten Sie den Strahlungsstrahl des Cäsiumbestrahlungsators horizontal zur Maus aus.
      1. Kleben Sie die Forepaws einer betäubten Maus vorsichtig auf den Bauch. Dies stellt sicher, dass die Arme eine volle Bestrahlungsdosis erhalten und nicht vom Schild bedeckt sind.
      2. Zur Kopfabschirmung legen Sie die Maus in einen konischen Rückhalteer, der in einen Bleischild passt. Sobald sich die Maus im konischen Rückhalteschild befindet, schieben Sie den Rückhalteer in den Steckplatz innerhalb der Bleiabschirmung (Abbildung 1F). Der Bleischild sollte den Kopf und die Ohren der Maus vollständig bedecken (~ 3,2 cm), so dass der Rest des Mauskörpers für die Bestrahlung freigelegt bleibt. Die Position des Rückhalteers im Inneren des Schildes kann an Tiere unterschiedlicher Größe angepasst werden, indem er weiter innerhalb oder außerhalb des Schildes liegt.
      3. Platzieren Sie Mäuse in den Bestrahlungskörper, senkrecht zur Bestrahlungsquelle.
    4. Setzen Sie Mäuse zwei 5,5-Gy-Bestrahlungsfraktionen (Gesamtdosis von 11 Gy) aus, die durch ein Intervall von 4 bis 24 Stunden getrennt sind.
    5. Nach jeder Bestrahlungsfraktion legen Sie die Käfige mit betäubten Mäusen auf beheizte Matten oder unter rote Wärmelampen, um Unterkühlung zu verhindern und die Erholung von der Anästhesie zu unterstützen.
      HINWEIS: Es ist vorsichtsgemerkt, die betäubte Maus bei der Verwendung einer Lampe nicht zu überhitzen, da sie der Hitze nicht entkommen kann. Wie oben beschrieben, können die Positionierung der Tiere und die Dicke des Bleischildes zwischen den Studien aufgrund der spezifischen Merkmale des Bestrahlungskörpers (Strahlungsart/Strahlrichtung usw.) variieren. Die Forscher müssen ihre Experimente entsprechend anpassen.

3. Knochenisolierung

HINWEIS: Idealerweise sollten Spendermäuse und Empfängermäuse im Alter ähnlich sein und innerhalb von 8-12 Wochen alt sein. Die Verwendung von mindestens 3 Mäusen als Spender (anstelle eines einzelnen Spenders) wird bevorzugt, um die Heterogenität zu minimieren (selbst bei Verwendung von Mäusen mit demselben Genotyp). Ungefähr 40 Millionen unfraktionierte Knochenmarkzellen können aus sechs Knochen (zwei Oberschenkelknochen, zwei Tibias und zwei Humeri) einer einzigen Maus gewonnen werden. Die Transplantation von 5 Millionen Knochenmarkzellen an jede Empfängermaus sorgt typischerweise für die Transplantation.

  1. Euthanisieren Sie Spendermäuse durch zervikale Dislokation ohne Anästhesie (bevorzugte Methode, um eine chemische Kontamination der Zellen zu vermeiden) und legen Sie jede Maus auf ein saugfähiges Pad.
  2. Desinfizieren Sie die Haut mit einem 70% Ethanolspray.
  3. Machen Sie einen kleinen Querschnitt in der Haut unterhalb des Brustkorbs und halten Sie die Haut fest auf beiden Seiten des Schnitts, reißen Sie in entgegengesetzte Richtungen zum Kopf und zu den Füßen. Schälen Sie die Haut von allen Gliedmaßen ab.
  4. Schneiden Sie über die Schultern und die Ellenbogengelenke und entfernen Sie die angeschlossenen Muskeln und bindegewebe mit Hilfe eines Kimwipe, um die Humeri zu erhalten.
  5. Verrenken Sie vorsichtig die Hüftgelenke zwischen Femur und Hüftknochen. Verwenden Sie eine stumpfe Schere, um den Femurkopf entlang zu schneiden und die Beine zu lösen. Schneiden Sie über das Kniegelenk, um Femur und Tibia zu trennen, und entfernen Sie vorsichtig die angeschlossenen Muskeln und Bindegewebe mit Hilfe eines Kimwipe, um den Femur und die Tibia zu ernten.
    HINWEIS: Achten Sie besonders darauf, die Knochenepiphyse während dieses Schritts intakt zu halten. Entsorgen Sie alle gebrochenen Knochen aufgrund des Verlustes der Sterilität. Hüftknochen und Wirbelsäulenknochen können zusätzlich zu Femur, Tibia und Humerus gesammelt werden. Um Wirbelsäulenknochen zu sammeln, können ein Mörser und ein Stößel verwendet werden, um die Knochen in Stücke zu zerkleinern und die Knochenmarkzellen zu ernten.
  6. Legen Sie die isolierten Knochen von Mäusen des gleichen Genotyps in ein entsprechend 50 ml konisches Röhrchen mit 20 ml eiskaltem sterilem PBS und halten Sie es bis zur weiteren Verwendung auf Eis. Achten Sie besonders darauf, die Knochen korrekt in Röhren mit abgestimmten Genotypen zu legen.
  7. Wiederholen Sie die obigen Schritte für jedes Spendertier, das zwischen jeder Maus handschuhe wechselt. Reinigen Sie auch Scheren und andere Instrumente mit 70% Ethanol zwischen jeder Maus.

4. Isolierung von Knochenmarkzellen

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II aus.

  1. Vorbereitung von Röhrchensets: Machen Sie ein kleines Loch in den Boden eines sterilen 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchens mit einer 18 G Nadel und legen Sie es in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das unten 100 μL eiskaltes steriles PBS enthält.
    HINWEIS: Da nur sechs Knochen in das 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen passen, wird empfohlen, ausreichende Röhrchensätze vorzubereiten, um alle Knochen gleichzeitig zu verarbeiten.
  2. Saugen Sie das PBS an und übertragen Sie die isolierten Knochen auf eine sterile 100-mm-Zellkulturschale. Halten Sie jeden Knochen mit einer feinen Zange, schneiden Sie die Epiphysen vorsichtig von jedem Ende mit einer kleinen Schere, die in einem Autoklaven sterilisiert wurde. Legen Sie die geschnittenen Knochen in die vorbereiteten Rohrsets.
  3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 35 s bei 4 °C.
  4. Bestätigen Sie nach der Zentrifugation, dass das Knochenmark erfolgreich aus den Knochen entfernt wurde. Knochen sollten weiß und durchscheinend mit einem relativ großen roten Pellet am Boden des 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchens erscheinen. Entsorgen Sie das 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Wenn die visuelle Inspektion kein Knochenmark am Boden des 1,5-ml-Röhrchens erkennt, schneiden Sie den Knochen erneut ab und wiederholen Sie Schritt 4.3.
  5. Resuspendieren Sie das Knochenmark in 1 ml eiskaltem PBS und übertragen Sie dann die Zellsuspension aus demselben Genotyp in ein abgestimmtes 50 ml konisches Rohr.
  6. Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Mal durch eine 18 G-Nadel mit einer 10-ml-Spritze führen.
  7. Filtern Sie Einzelzellsuspensionen durch ein 70 μm Zellsieb. Fügen Sie zusätzliches eiskaltes PBS zu einem Endvolumen von 10 ml hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch die sanfte Verwendung von Pipettenhilfe.
  8. Zentrifuge bei 310 x g für 10 min bei 4 °C.
  9. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 ml serumfreiem RPMI-Medium. 30 μL dieses Materials für die Zellzählung frei.
  10. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler und berechnen Sie das volumen der Zellsuspension, das für die Transplantation erforderlich ist. Für das Beispiel einer 100% BMT werden für jede Empfängermaus 5 x10 6 Knochenmarkzellen benötigt.
    HINWEIS: Für eine kompetitive BMT bereiten Sie insgesamt 5 x 106 Knochenmarkzellen vor, die eine Mischung aus Spenderzellen (z. B. CD45.2+) und Konkurrenzzellen (z. B. CD45.1+) enthalten. Die Vorbereitung zusätzlicher Knochenmarkzellen wird dringend empfohlen. Wenn es beispielsweise 10 Empfängermäuse pro Versuchsgruppe gibt, bereiten wir typischerweise genügend Zellen für 12 Empfängermäuse vor.
  11. Übertragen Sie das berechnete Volumen der Zellsuspension in ein neues 50 ml konisches Rohr. Zentrifuge bei 310 x g für 10 min bei 4 °C.
  12. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die Zellen mit der berechneten Menge an serumfreiem RPMI-Medium, um die entsprechende Zelldichte und das entsprechende Zellvolumen zu erreichen. Typischerweise sind 200 μL das optimale Volumen für eine retroorbitale Injektion.

5. Transplantation von Knochenmarkzellen an bestrahlte Mäuse

  1. Betäuben Sie die Empfängermäuse mit 5% Isofluran.
  2. Während Mäuse betäubt werden, injizieren Sie langsam 200 μL Knochenmarkzellen in die retroorbitale Vene mit einer 28-30 G Nadel mit einer Insulinspritze.
    1. Alternativ können Sie die Abgabe der Spenderzellen durch intravenöse Injektion der Schwanzvene und intramedulläre Femurinjektion mit einem maximalen Volumen von 0,2 ml bzw. 25 μL durchführen.
  3. Sobald die Zellen injiziert sind, legen Sie einen Tropfen Proparacain-haltige Augentropfen auf die Oberfläche des Auges zur Schmerzlinderung. Dem Tier kann dann erlaubt werden, das Bewusstsein wiederzuerlangen.

6. Transplantation von Knochenmarkzellen an nicht konditionierte Mäuse

  1. Betäuben Sie die Empfängermäuse durch Inhalation von 5% Isofluran.
  2. Injizieren Sie 5 x10 6 unfraktionierte Knochenmarkzellen aus beiden Genotypen retroorbital in nicht bestrahlte Empfängermäuse mit 28–30 G Insulinspritze.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 und 6.2 an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, so dass die Empfängermäuse mit insgesamt 1,5 x 107 Knochenmarkzellen transplantiert werden.
    HINWEIS: Da die adoptive BMT ohne Vorkonditionierungsverfahren eine Knochenmarktransplantation für 3 aufeinanderfolgende Tage erfordert, sollte man versuchen, die Augen für jede Injektion zu wechseln.
  4. Nach der Injektion verabreichen Sie dem betroffenen Auge einen Tropfen Proparacain-haltige Augentropfen.

Ergebnisse

Um die Wirkung von drei BMT/Vorkonditionierungsmethoden auf die Spenderzelltransplantation zu vergleichen, wurden die Fraktionen von Spenderzellen in peripherem Blut und Herzgewebe mittels Durchflusszytometrie nach 1 Monat nach BMT analysiert. Isolierte Zellen wurden für spezifische Leukozytenmarker gefärbt, um die verschiedenen Untergruppen von Leukozyten zu identifizieren. In diesen Experimenten wurden Wildtyp(WT) C57BL/6 (CD45.2) Spenderknochenmarkzellen an WT B6 abgegeben. SJL-Ptprc<...

Diskussion

Für Studien der klonalen Hämatopoese beschrieben wir drei Methoden der BMT: BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit Bestrahlung mit partieller Abschirmung und eine weniger häufig verwendete BMT-Methode, die keine Vorkonditionierung beinhaltet (adoptive BMT). Diese Methoden wurden verwendet, um die Auswirkungen der klonalen Hämatopoese auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu bewerten. Forscher können diese Methoden entsprechend dem spezifischen Zweck ihrer Studie modifizieren.

Klonale H...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der US National Institutes of Health an K. Walsh (HL131006, HL138014 und HL132564), an S. Sano (HL152174), american Heart Association grant an M. A. Evans (20POST35210098) und ein Japan Heart Foundation Grant an H. Ogawa unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5ml microcentrifugeFisher Scientific05-408-121general supply
1.5ml microcentrifugeFisher Scientific05-408-129general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGEEXELINT26028general supply
Absolute Ethanol (200 prfof)Fisher chemical200559general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch NeedleBecton Dickinson309626general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)Becton Dickinson395195general supply
Cesium-137 IrradiatorJ. L. Shepherd Mark IVequipment
DietGel 76AClear H2O70-01-5022general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture DishLife Sciences353003general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific352098general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μmFisher Scientific22363548general supply
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10general supply
Hardened Fine ScissorsFine Science Tools14090-09general supply
Isothesia (Isoflurane) solutionHenry Schein29404Solution
KetamineZoetis043-304injection
Kimwipes Delicate Task WipersKimtech ScienceKCC34155general supply
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
RadDisk – Rodent Irradiator DiskBraintree ScientificIRD-P Mgeneral supply
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfamethoxazole and TrimethoprimTEVA0703-9526-01injection
XylazineAkorn139-236injection
X-ray irradiatorRad sourceRS-2000equipment

Referenzen

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