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Neste Artigo

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Resumo

Descrevemos três métodos de transplante de medula óssea (TMO): TMO com irradiação total do corpo, TMO com irradiação blindada e método de TMO sem pré-condicionamento (TMO adotivo) para o estudo da hematopoiese clonal em modelos de camundongos.

Resumo

A hematopoiese clonal é uma condição predominante associada à idade que resulta do acúmulo de mutações somáticas em células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Mutações nos genes do driver, que conferem aptidão celular, podem levar ao desenvolvimento da expansão de clones HSPC que cada vez mais dão origem a leucócitos progêneros que abrigam a mutação somática. Como a hematopoiese clonal tem sido associada a doenças cardíacas, acidente vascular cerebral e mortalidade, o desenvolvimento de sistemas experimentais que modelam esses processos é fundamental para entender os mecanismos que fundamentam esse novo fator de risco. Procedimentos de transplante de medula óssea envolvendo condicionamento mieloablativo em camundongos, como a irradiação total do corpo (TCE), são comumente empregados para estudar o papel das células imunes em doenças cardiovasculares. No entanto, danos simultâneos ao nicho da medula óssea e outros locais de interesse, como o coração e o cérebro, são inevitáveis com esses procedimentos. Assim, nosso laboratório desenvolveu dois métodos alternativos para minimizar ou evitar possíveis efeitos colaterais causados pelo TCE: 1) transplante de medula óssea com blindagem de irradiação e 2) TMO adotivo para camundongos não condicionados. Em órgãos blindados, o ambiente local é preservado permitindo a análise de hematopoiese clonal enquanto a função das células imunes residentes não é perturbada. Em contrapartida, o BMT adotivo para camundongos não condicionados tem a vantagem adicional de que tanto os ambientes locais dos órgãos quanto o nicho hematopoiético sejam preservados. Aqui, comparamos três diferentes abordagens de reconstituição de células hematopoiéticas e discutimos suas forças e limitações para estudos de hematopoiese clonal em doenças cardiovasculares.

Introdução

A hematopoiese clonal (CH) é uma condição que é frequentemente observada em idosos e ocorre como resultado de um clone de célula hematopoiética e progenitora expandida (HSPC) portador de uma mutação genética1. Foi sugerido que, aos 50 anos, a maioria dos indivíduos terá adquirido uma média de cinco mutações exônicas em cada HSPC2,mas a maioria dessas mutações resultará em pequenas ou nenhuma consequências fenotípicas para o indivíduo. No entanto, se por acaso uma dessas mutações confere uma vantagem competitiva ao HSPC — como promover sua proliferação, auto-renovação, sobrevivência ou alguma combinação delas — isso pode levar à expansão preferencial do clone mutante em relação aos outros HSPCs. Como resultado, a mutação se espalhará cada vez mais pelo sistema hematopoiético à medida que o HSPC mutado dá origem a células sanguíneas maduras, levando a uma população distinta de células mutantes dentro do sangue periférico. Enquanto mutações em dezenas de diferentes genes de driver candidatos têm sido associadas a eventos clonais dentro do sistema hematopoiético, entre eles, mutações no DNA metiltransferase 3 alfa(DNMT3A) e dez onze translocação 2(TET2) são as mais prevalentes3. Vários estudos epidemiológicos descobriram que indivíduos que carregam essas mutações genéticas têm um risco significativamente maior de doenças cardiovasculares (DCV), acidente vascular cerebral e mortalidade causal3,4,5,6,7. Embora esses estudos tenham identificado que existe associação entre ACS e aumento da incidência de DCV e AVC, não sabemos se essa relação é causal ou um epifenômeno compartilhado com o processo de envelhecimento. Para obter uma melhor compreensão dessa associação, são necessários modelos animais adequados que recapitulem corretamente a condição humana do ACS.

Vários modelos de animais CH foram estabelecidos pelo nosso grupo e outros usando zebrafish, camundongos e primatas não humanos8,9,10,11,12,13,14. Esses modelos frequentemente usam métodos de reconstituição hematopoiética por meio do transplante de células geneticamente modificadas, às vezes usando recombinação cre-lox ou o sistema CRISPR. Essa abordagem permite a análise de uma mutação genética específica em células hematopoiéticas para avaliar como ela contribui para o desenvolvimento da doença. Além disso, esses modelos geralmente empregam células congênicas ou repórteres para distinguir os efeitos das células mutantes de células normais ou do tipo selvagem. Em muitos casos, um regime pré-condicionado é necessário para engrafar com sucesso células-tronco hematopoiéticas doadoras.

Atualmente, o transplante de medula óssea para camundongos receptores pode ser dividido em duas categorias principais: 1) condicionamento mieleloblativo e 2) transplante não condicionado. O condicionamento mieloblativo pode ser alcançado por um dos dois métodos, a ver: irradiação corporal total (TCE) ou quimioterapia15. O TBI é realizado submetendo o receptor a uma dose letal de irradiação gama ou raios-X, gerando quebras de DNA ou cruzamentos dentro de células rapidamente divididas, tornando-as irreparáveis16. Busulfan e ciclofosfameda são duas drogas quimioterapias comumente usadas que interrompem o nicho hematopoiético e causam danos ao DNA para células rapidamente divididas. O resultado líquido do pré-condicionamento mieloblativo é apoptose das células hematopoiéticas, que destrói o sistema hematopoiético do receptor. Essa estratégia não só permite o enxerto bem-sucedido dos HSPCs doadores, mas também pode evitar a rejeição do enxerto suprimindo o sistema imunológico do receptor. No entanto, o pré-condicionamento mieloblativo tem efeitos colaterais graves, como danos a tecidos e órgãos e suas células imunes residentes, bem como destruição do nicho de medula óssea nativo17. Por conseguinte, foram propostos métodos alternativos para superar esses efeitos colaterais indesejáveis, particularmente no que diz respeito aos danos aos órgãos de interesse. Esses métodos incluem a irradiação blindada de camundongos receptores e o BMT adotivo para camundongos não condicionados9,17. Proteger o tórax, a cavidade abdominal, a cabeça ou outras regiões da irradiação pela colocação de barreiras de chumbo mantém os tecidos de interesse protegidos dos efeitos nocivos da irradiação e mantém sua população de células imunes residentes. Por outro lado, o BMT adotivo de HSPCs para camundongos não condicionados tem uma vantagem adicional porque preserva o nicho hematopoiético nativo. Neste manuscrito, descrevemos os protocolos e resultados do enxerto de HSPC após vários regimes de transplante em camundongos, especificamente a entrega de HSPC a camundongos TBI, a camundongos parcialmente protegidos da irradiação e a ratos não condicionados. O objetivo geral é ajudar os pesquisadores a entender os diferentes efeitos fisiológicos de cada método, bem como como eles afetam os desfechos experimentais no cenário de ACS e doenças cardiovasculares.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia.

1. Antes do pré-condicionamento

  1. Coloque os camundongos receptores em água suplementada com antibióticos (5 mM sulfametoxazol, 0,86 mM trimeoprim) ~24 h antes da irradiação. Isso é necessário para prevenir a infecção, pois o sistema imunológico será suprimido após a irradiação, e mantido por 2 semanas após a irradiação. Neste ponto, suplemente camundongos com gel nutricional/hidratante para incentivar a alimentação e prevenir a perda de peso e a desidratação após a irradiação.

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Figura 1: Imagens que mostram várias configurações de pré-condicionamento. (A) Configuração de irradiação total do corpo da gaiola de torta usando raios gama (Césio-137): O feixe de radiação vem da parte de trás do irradiador na direção do eixo y (radiação horizontal). (B) Configuração total de irradiação do corpo da gaiola do rato usando raio-X: A gaiola do rato é colocada na câmara reflexiva. O feixe de radiação vem do topo do irradiador na forma de um cone (radiação vertical). A distância da fonte de radiação até a gaiola é de 530 mm. (C) Bandeja ajustável no irradiador de raios-X: Esta configuração é usada para irradiação parcialmente blindada usando raios-X. O feixe de radiação vem do topo do irradiador na forma de um cone (radiação vertical). A distância da fonte de radiação até a bandeja é de 373 mm, e o raio é de 250 mm.(D) Escudo de tórax: ratos anestesiados são colocados em uma bandeja. Os ratos são colocados invertidos uns aos outros em posições supinas com braços e pernas totalmente estendidos. A extremidade inferior do escudo de chumbo está alinhada com o osso xiphisternum e a extremidade superior com o timo. (E) Blindagem abdominal: Camundongos anestesiados são colocados como na configuração de proteção ao tórax com a extremidade inferior do escudo de chumbo alinhada com o ânus e a extremidade superior abaixo do diafragma. (F) Configuração de irradiação de proteção da cabeça usando raios gama (Césio-137): As prevabas do rato anestesiado são coladas e o mouse é colocado em um conterrâneo cônico. O escudo de chumbo preto (marcado) cobre a cabeça e as orelhas do mouse. O feixe de radiação vem da parte de trás do irradiador na direção do eixo Y (radiação horizontal). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Pré-condicionamento de camundongos receptores (opcional)

  1. Irradiação total do corpo
    1. Coloque ratos receptores em uma gaiola de torta uniformemente fatiada, ou uma gaiola de rato na câmara reflexiva dentro do raio calculado para receber a mesma dose de irradiação; no entanto, recomenda-se um máximo de 8 ratos por pie-cage e 5 ratos por gaiola de rato para garantir a irradiação uniforme(Figura 1A,B).
    2. Para alcançar a mieloablação completa, certifique-se de que os camundongos receptores recebam uma dose total de radiação de 11 Gy em duas frações de 5,5 Gy separadas por um intervalo de 4-24 horas.
      NOTA: Embora o enxerto ideal possa ser obtido implementando um intervalo de 4h entre frações, isso pode ser estendido para um intervalo de 24 horas, o que pode ser útil quando o trabalho e/ou o irradiador não estiver disponível.
  2. Irradiação parcialmente blindada
    1. Anestesiar os camundongos receptores por injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg). A contenção do movimento do rato é fundamental para garantir a irradiação uniforme e a proteção efetiva dos órgãos de mira durante o processo de blindagem.
    2. Para blindagem do tórax e abdômen, oriente o feixe de radiação do irradiador de raios-X verticalmente para o camundongo(Figura 1C).
      1. Posicione os ratos anestesiados em uma placa plana, centralizando a fonte de radiação de cima. Coloque os ratos invertidos uns aos outros em uma posição supina com braços e pernas totalmente estendidos(Figura 1D,E).
        NOTA: A instalação de irradiador de raios-X, para este experimento, permite que dois ratos por vez possam ser posicionados dentro do raio eficaz que permite a irradiação uniforme. Embora o raio efetivo seja calculado com base na distância entre a fonte de radiação e a bandeja, o número de animais que podem ser irradiados simultaneamente dependerá do irradiador específico.
      2. Fixe as patas dos ratos na placa usando fita adesiva para garantir que os ratos sejam imobilizados durante o procedimento de irradiação. Coloque a blindagem de chumbo para cobrir regiões que requerem proteção.
      3. Para blindagem do tórax, prepare o escudo de chumbo medindo o comprimento do osso xiphisternum do rato até o timo e calculando a espessura que fornecerá proteção suficiente da fonte de irradiação. Coloque a blindagem de chumbo para que a extremidade inferior se alinhe com o osso xiphisternum. A extremidade superior da barreira de chumbo caberá perto do timo(Figura 1D).
      4. Para blindagem do abdômen, prepare o escudo de chumbo medindo o comprimento do ânus do rato até o diafragma e calculando a espessura que fornecerá proteção suficiente da fonte de irradiação. Coloque a blindagem de chumbo para que a extremidade inferior se alinhe com o ânus. A extremidade superior do escudo de chumbo caberá abaixo do diafragma(Figura 1E).
        NOTA: A localização do escudo de chumbo para ser consistente entre as coortes pode reduzir alguma variação em relação ao tamanho dos ratos.
    3. Para blindagem da cabeça, oriente o feixe de radiação do irradiador de césio horizontalmente para o rato.
      1. Grave cuidadosamente as previs de um rato anestesiado no abdômen. Isso garante que os braços obtenham uma dose completa de irradiação e não sejam cobertos pelo escudo.
      2. Para blindagem da cabeça, coloque o mouse em um contidor cônico, que se encaixa dentro de um escudo de chumbo. Uma vez que o mouse esteja dentro do conterrâneo cônico, deslize o conterrâneo para dentro do slot dentro do escudo de chumbo(Figura 1F). O escudo de chumbo deve cobrir completamente a cabeça e as orelhas do mouse (~3,2 cm), deixando o resto do corpo do rato exposto para irradiação. A posição do conterrâneo dentro do escudo pode ser ajustada para caber animais de diferentes tamanhos deslizando-o mais para dentro ou fora do escudo.
      3. Coloque ratos dentro do irradiador, perpendicular à fonte de irradiação.
    4. Exponha os camundongos a duas frações de 5,5 gy de irradiação (dose total de 11 Gy) separadas por um intervalo de 4-24 horas.
    5. Após cada fração de irradiação, coloque as gaiolas com camundongos anestesiados em tapetes aquecidos ou sob lâmpadas de calor vermelhas para evitar hipotermia e ajudar na recuperação da anestesia.
      NOTA: Deve-se ter cuidado para não superaquecer o rato anestesiado ao usar uma lâmpada, pois não podem escapar do calor. Como descrito acima, o posicionamento dos animais e a espessura do escudo de chumbo podem diferir entre estudos baseados nas características específicas do irradiador (tipo de radiação/direção do feixe, etc.). Os pesquisadores precisarão ajustar seus experimentos de acordo.

3. Isolamento ósseo

NOTA: Idealmente, camundongos doadores e camundongos receptores devem ser semelhantes em idade, e dentro de 8 a 12 semanas de idade. Usar pelo menos 3 camundongos como doadores (em vez de doador único) é preferido para minimizar a heterogeneidade (mesmo quando se usa camundongos com o mesmo genótipo). Aproximadamente, 40 milhões de células de medula óssea não fratuladas podem ser obtidas de seis ossos (dois fêmures, duas tíbias e dois úmeros) de um único rato. O transplante de 5 milhões de células de medula óssea em cada rato receptor normalmente garantirá o enxerto.

  1. Eutanize camundongos doadores por luxação cervical sem anestesia (método preferido para evitar contaminação química das células) e coloque cada rato em uma almofada absorvente.
  2. Desinfete a pele usando um spray de 70% de etanol.
  3. Faça um pequeno corte transverso na pele abaixo da caixa torácica e segure a pele firmemente em ambos os lados da incisão, rasgue em direções opostas em direção à cabeça e aos pés. Retire a pele de todos os membros.
  4. Corte sobre os ombros e as articulações do cotovelo, e remova os músculos ligados e tecidos conjuntivos com o auxílio de um Kimwipe para obter o úmero.
  5. Desloque cuidadosamente as articulações do quadril entre os ossos do fêmur e do quadril. Use uma tesoura sem corte para cortar ao longo da cabeça do fêmur e desprender as pernas. Corte sobre a articulação do joelho para separar o fêmur e a tíbia, e remova cuidadosamente os músculos ligados e os tecidos conjuntivos com o auxílio de um Kimwipe para colher o fêmur e a tíbia.
    NOTA: Preste atenção especial para manter a epífise óssea intacta durante esta etapa. Descarte os ossos quebrados devido à perda de esterilidade. Ossos do quadril e ossos da coluna podem ser coletados além do fêmur, tíbia e úmero. Para coletar ossos da coluna vertebral, uma argamassa e um pilão podem ser usados para esmagar os ossos em pedaços e colher as células da medula óssea.
  6. Coloque os ossos isolados de camundongos do mesmo genótipo em um tubo cônico correspondente de 50 mL contendo PBS estéreis de 20 mL, e mantenha-o no gelo até que seja usado. Preste especial atenção para colocar corretamente os ossos em tubos com genótipos combinados.
  7. Repita os passos acima para cada animal doador trocando luvas entre cada rato. Além disso, tesoura limpa e outros instrumentos com 70% de etanol entre cada rato.

4. Isolamento da célula de medula óssea

NOTA: Execute as seguintes etapas em um gabinete de classe II de biossegurança.

  1. Preparação de conjuntos de tubos: Faça um pequeno furo na parte inferior de um tubo de microcentrifus de 0,5 mL estéril usando uma agulha de 18 G e coloque-o em um tubo de microcentrifuge estéril de 1,5 mL, que contém 100 μL de PBS estéril estéril no fundo.
    NOTA: Como apenas seis ossos podem caber no tubo de microcentrifus de 0,5 mL, recomenda-se preparar conjuntos de tubos suficientes para processar todos os ossos ao mesmo tempo.
  2. Aspire o PBS e transfira os ossos isolados para um prato de cultura celular estéril de 100 mm. Segurando cada osso usando fórceps finos, corte cuidadosamente as epífitas de cada extremidade usando uma pequena tesoura que foi esterilizada em uma autoclave. Coloque os ossos cortados nos conjuntos de tubos preparados.
  3. Centrifugar os tubos a 10.000 x g para 35 s a 4 °C.
  4. Após a centrifugação, confirme que a medula óssea foi removida com sucesso dos ossos. Os ossos devem parecer brancos e translúcidos com uma pelota vermelha relativamente grande na parte inferior do tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Descarte o tubo de microcentrifuuge de 0,5 mL.
    NOTA: Se a inspeção visual não detectar medula óssea na parte inferior do tubo de 1,5 mL, corte o osso novamente e repita o passo 4.3.
  5. Resuspend a medula óssea em 1 mL de PBS gelado, em seguida, transfira a suspensão celular do mesmo genótipo para um tubo cônico de 50 mL compatível.
  6. Dissociar as células passando-as através de uma agulha de 18 G com uma seringa de 10 mL 10 vezes.
  7. Filtrar suspensões de célula única através de um coador de células de 70 μm. Adicione PBS frio adicional a um volume final de 10 mL, e resuspense as células através do uso suave de pipeta-aid.
  8. Centrifugar a 310 x g por 10 min a 4 °C.
  9. Aspire o supernatante e resuspende a pelota celular com 10 mL de mídia RPMI sem soro. Poupe 30 μL deste material para a contagem de células.
  10. Determine a concentração celular com um contador celular e calcule o volume de suspensão celular necessário para o transplante. Para o exemplo de um 100% BMT, 5 x 106 células de medula óssea são necessárias para cada rato receptor.
    NOTA: Para um BMT competitivo, prepare um total de 5 x 106 células de medula óssea que compõem uma mistura de células doadoras (por exemplo, CD45.2+) e células concorrentes (por exemplo, CD45.1+). Preparar células extras de medula óssea é altamente recomendado. Por exemplo, se há 10 ratos receptores por grupo experimental, normalmente preparamos células suficientes para 12 camundongos receptores.
  11. Transfira o volume calculado de suspensão celular para um novo tubo cônico de 50 mL. Centrifugar a 310 x g por 10 min a 4 °C.
  12. Aspire o supernasce e resuspende as células usando a quantidade calculada de meio RPMI livre de soro para alcançar a densidade e volume celular apropriados. Normalmente, 200 μL é o volume ideal para uma injeção retro-orbital.

5. Transplante de células de medula óssea para camundongos irradiados

  1. Anestesiar os camundongos receptores com 5% de isoflurane.
  2. Enquanto os camundongos são anestesiados, injete lentamente 200 μL de células de medula óssea na veia retro-orbital usando uma agulha de 28-30 G com uma seringa de insulina.
    1. Alternativamente, realize a entrega das células doadoras por injeção intravenosa da veia da cauda e injeção intramedular femoral, com volume máximo de 0,2 mL e 25 μL, respectivamente.
  3. Uma vez que as células são injetadas, coloque uma gota de colírios contendo proparaca na superfície do olho para alívio da dor. O animal pode então ser autorizado a recuperar a consciência.

6. Transplante de células de medula óssea para camundongos não condicionados

  1. Anestesiar os camundongos receptores por inalação de 5% de isoflurane.
  2. Injete 5 x 106 células de medula óssea não fracionados de qualquer genótipo retro-orbitalmente em camundongos receptores não irradiados com seringa de insulina de 28 a 30 G.
  3. Repetir as etapas 6.1 e 6.2 ao longo de 3 dias consecutivos, de tal forma que os camundongos receptores serão transplantados com um total de 1,5 x 107 células de medula óssea.
    NOTA: Como o TMO adotivo sem procedimento de pré-condicionamento requer transplante de medula óssea por 3 dias consecutivos, deve-se tentar alternar os olhos para cada injeção.
  4. Após a injeção, administre uma gota de colírios contendo proparacaína no olho afetado.

Resultados

Para comparar o efeito de três métodos de TMO/pré-condicionamento no enxerto celular doador, as frações de células doadoras no sangue e tecido cardíaco periféricos foram analisadas por citometria de fluxo em 1 mês após o TMO. Células isoladas foram manchadas por marcadores leucócitos específicos para identificar os diferentes subconjuntos de leucócitos. Nestes experimentos, foram entregues células de medula óssea do tipo selvagem(WT) C57BL/6 (CD45.2) ao WT B6. SJL-Ptprc...

Discussão

Para estudos de hematopoiese clonal, descrevemos três métodos de BMT: BMT com irradiação total do corpo, BMT com irradiação com blindagem parcial, e um método de BMT menos comumente utilizado que não envolve pré-condicionamento (BMT adotivo). Esses métodos têm sido utilizados para avaliar o impacto da hematopoiese clonal em doenças cardiovasculares. Os pesquisadores podem modificar esses métodos de acordo para se adequarem ao propósito específico de seu estudo.

Modelos d...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do Instituto Nacional de Saúde dos EUA a K. Walsh (HL131006, HL138014 e HL132564), à S. Sano (HL152174), subvenção da American Heart Association a M. A. Evans (20POST35210098), e uma bolsa da Japan Heart Foundation para H. Ogawa.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5ml microcentrifugeFisher Scientific05-408-121general supply
1.5ml microcentrifugeFisher Scientific05-408-129general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGEEXELINT26028general supply
Absolute Ethanol (200 prfof)Fisher chemical200559general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch NeedleBecton Dickinson309626general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)Becton Dickinson395195general supply
Cesium-137 IrradiatorJ. L. Shepherd Mark IVequipment
DietGel 76AClear H2O70-01-5022general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture DishLife Sciences353003general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific352098general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μmFisher Scientific22363548general supply
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10general supply
Hardened Fine ScissorsFine Science Tools14090-09general supply
Isothesia (Isoflurane) solutionHenry Schein29404Solution
KetamineZoetis043-304injection
Kimwipes Delicate Task WipersKimtech ScienceKCC34155general supply
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
RadDisk – Rodent Irradiator DiskBraintree ScientificIRD-P Mgeneral supply
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfamethoxazole and TrimethoprimTEVA0703-9526-01injection
XylazineAkorn139-236injection
X-ray irradiatorRad sourceRS-2000equipment

Referências

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