Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert die Anwendung von lebenden Pankreasgewebeschnitten auf die Untersuchung der Inselphysiologie und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen.

Zusammenfassung

Lebende Pankreasgewebeschnitte ermöglichen die Untersuchung der Physiologie und Funktion von Inseln im Kontext einer intakten Inselmikroumgebung. Die Scheiben werden aus lebendem Pankreasgewebe von Mensch und Maus hergestellt, das in Agarose eingebettet ist und mit einem Vibratom geschnitten wird. Diese Methode ermöglicht es dem Gewebe, die Lebensfähigkeit und Funktion aufrechtzuerhalten und die zugrunde liegenden Pathologien wie Typ-1-Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) zu erhalten. Die Slice-Methode ermöglicht neue Richtungen bei der Untersuchung der Bauchspeicheldrüse durch die Aufrechterhaltung der komplexen Strukturen und verschiedener interzellulärer Wechselwirkungen, die das endokrine und exokrine Gewebe der Bauchspeicheldrüse umfassen. Dieses Protokoll zeigt, wie man Färbung und Zeitraffermikroskopie von lebenden endogenen Immunzellen in Pankreasschnitten zusammen mit Bewertungen der Inselphysiologie durchführt. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verfeinert werden, um Immunzellpopulationen zu erkennen, die für Inselzellantigene spezifisch sind, wobei wichtige Histokompatibilitäts-Komplex-Multimer-Reagenzien verwendet werden.

Einleitung

Die Beteiligung der Bauchspeicheldrüse ist pathognomonisch bei Krankheiten wie Pankreatitis, T1D und T2D1,2,3. Die Untersuchung der Funktion in isolierten Inseln beinhaltet in der Regel die Entfernung der Inseln aus ihrer ^Umgebung4. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts wurde entwickelt, um die Untersuchung von Pankreasgewebe unter Beibehaltung intakter Inselmikroumgebungen zu ermöglichen und die Verwendung von stressigen Inselisolationsverfahren zu ^{vermeiden5,6,7}. Pankreasgewebeschnitte aus menschlichem Spendergewebe wurden erfolgreich zur Untersuchung von T1D verwendet und haben Prozesse des Betazellverlustes und der Funktionsstörung zusätzlich zur Immunzellinfiltration gezeigt8,9,10,11,12,13. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts kann sowohl auf Maus- als auch auf menschliches Pankreasgewebe angewendet ^werden5,6,8. Menschliche Pankreasgewebeschnitte aus Organspendergewebe werden durch eine Zusammenarbeit mit dem Netzwerk für Pankreasorganspender mit Diabetes (nPOD) gewonnen. Mausscheiben können aus einer Vielzahl verschiedener Mausstämme generiert werden.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf nicht-fettleibige Diabetiker-Rekombination aktivierendes Gen-1-null (NOD. Rag1^-/-) und T-Zell-Rezeptor transgen (AI4) (NOD. Rag1^-/-. AI4 ^α/β) Mausstämme. NICKEN. Rag1^-/- Mäuse können aufgrund einer Störung des rekombinationsaktivierenden Gens 1 (Rag1)¹⁴ keine T- und B-Zellen entwickeln. NICKEN. Rag1^-/-. AI4 ^α/β Mäuse werden als Modell für beschleunigten Typ-1-Diabetes verwendet, da sie einen einzigen T-Zell-Klon produzieren, der auf ein Epitop von Insulin abzielt, was zu einer konsistenten Inselinfiltration und einer schnellen Krankheitsentwicklung ^führt15. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt Verfahren für funktionelle und immunologische Studien mit lebenden Pankreasschnitten von Mensch und Maus durch die Anwendung konfokaler Mikroskopieansätze. Die hierin beschriebenen Techniken umfassen Lebensfähigkeitsbewertungen, Identifizierung und Lokalisierung von Inselchen, zytosolische ^Ca2+ -Aufzeichnungen sowie Färbung und Identifizierung von Immunzellpopulationen.

Protokoll

ANMERKUNGEN: Alle experimentellen Protokolle mit Mäusen wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Florida (201808642) genehmigt. Menschliche Pankreasschnitte von Gewebespendern beiderlei Geschlechts wurden über die Gewebebank Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) der University of Florida gewonnen. Die menschliche Bauchspeicheldrüse wurde von zertifizierten Organbeschaffungsorganisationen, die mit nPOD zusammenarbeiten, in Übereinstimmung mit den Organspendegesetzen und -vorschriften von Leichenorganspendern entnommen und vom Institutional Review Board (IRB) der University of Florida (IRB Nr. 392-2008) als "Non-Human Subjects" eingestuft, wobei auf die Notwendigkeit einer Zustimmung verzichtet wurde. nPOD-Gewebe, die speziell für dieses Projekt verwendet wurden, wurden von der University of Florida IRB (IRB20140093) als nichtmenschlich zugelassen. Die Ziele der Abschnitte 1-3 dieses Protokolls bestehen darin, zu erklären, wie man eine Maus erfolgreich seziert, die Bauchspeicheldrüse vorbereitet und verarbeitet und lebende Pankreasgewebeschnitte erzeugt. Lösungen sollten im Voraus vorbereitet werden, und die Rezepte finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1. Zeit ist der kritischste Faktor während dieser Protokollschritte. Sobald die Maus geopfert wurde, beginnt die Lebensfähigkeit des Gewebes zu sinken. Alle drei Teile dieses Protokolls müssen so schnell wie möglich abgeschlossen werden, bis alle erforderlichen Slices generiert sind.

1. Vorbereitung für die Erzeugung von Pankreasscheiben der Maus

1. Klemmen Sie die Klinge auf den Vibratomklingenhalter, aber befestigen Sie sie noch nicht am Vibratom.
2. Schmelzen Sie 100 ml 1,25% w/v Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in einer Mikrowelle. Betreiben Sie die Mikrowelle in 1 min Intervallen und stoppen Sie die Mikrowelle für 10 s, wenn die Agaroselösung zu kochen beginnt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Agarose geschmolzen ist und eine homogene Lösung entsteht. Stellen Sie die Flasche in ein 37 °C warmes Wasserbad.
   HINWEIS: Die niedrige Agarosekonzentration ist für die geringere Dichte der Bauchspeicheldrüse der Maus verantwortlich.
3. Füllen Sie eine 10 ml Luer Lock Spritze mit 3 ml warmer Agarose. Befestigen Sie eine 27 G 25 mm Nadel auf der Spritze. Bewahren Sie die Spritze mit der mit der Kappe befestigten Nadel in einem 37 °C warmen Wasserbad auf, bis die Lösung injiziert werden soll.
   HINWEIS: Eine 27 G Nadel wird bevorzugt, da sie sicher in den gemeinsamen Gallengang von Mäusen zwischen 10-25 g Körpergewicht passt und den Fluss der hochviskosen Agaroselösung ermöglicht. Während Nadeln mit größerer Bohrung für die Verwendung ausgewählt werden können, werden kleinere (größere) Nadeln nicht empfohlen, da diese mit der Agaroselösung leichter verstopft werden können.
4. 20 ml gekühlte extrazelluläre Lösung (ECS) in eine 10 cm Petrischale geben.
   HINWEIS: Das ECS muss zu keinem Zeitpunkt geblasen werden.
5. Füllen Sie zwei 10 cm unbehandelte Petrischalen mit 15 ml Krebs-Ringer Bicarbonatpuffer (KRBH) mit 3 mM D-Glucose und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in einer Konzentration von 0,1 mg/ml pro Schale.
   HINWEIS: Während dieses Protokolls ist es wichtig, dass alle Lösungen, die zur Aufrechterhaltung von Scheiben verwendet werden, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor enthalten, um Gewebeschäden durch Pankreas-Verdauungsproteasen zu verhindern.

2. Pankreasexzision der Maus und Gewebeverarbeitung

HINWEIS: Das Protokoll zum Ausschneiden der Bauchspeicheldrüse, zur Verarbeitung des Gewebes und zum Erzeugen von Scheiben ist von Marciniak et ^al5 modifiziert. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu gewährleisten, minimieren Sie die Zeit zwischen der Entfernung der Bauchspeicheldrüse und der Scheibenbildung. Alle notwendigen Geräte sollten im Voraus vorbereitet und so ausgerichtet werden, dass ein schnelles Fortschreiten durch die folgenden Schritte möglich ist. Gallengangskanüle und -injektion sowie Pankreasexzision werden am besten unter einem Stereoskop durchgeführt.

1. Die Maus wird tief mit Isofluran betäubt und durch zervikale Luxation geopfert.
   HINWEIS: Isofluran ist die bevorzugte Anästhesiemethode. Es sollte eine Konzentration von 5% Isofluran verwendet werden. Zum Beispiel sollten 0,26 ml mit einer 1 L ^Kammer16 verwendet werden. Eine Abnahme der Lebensfähigkeit des Pankreasgewebes wurde beobachtet, wenn _CO2 verwendet wurde.
2. Besprühen Sie die Maus großzügig mit 70% v / v Ethanol, um die Gewebekontamination mit Fell während der Dissektion und Exzision zu reduzieren. Platzieren Sie die Maus in einer dorsalen, ventralen Ausrichtung nach oben mit der vorderen Seite nach links.
3. Öffnen Sie mit einer Schere das Peritoneum und entfernen Sie den Brustkorb, wobei Sie darauf achten, das Herz oder benachbarte Gefäße nicht zu punktieren. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Leber in die Brusthöhle zu drehen und den Darm aus der Körperhöhle zu bewegen, um den gemeinsamen Gallengang freizulegen. Verwenden Sie eine Johns Hopkins Bulldoggenklemme, um die Ampulle von Vater zu verschließen.
4. Holen Sie eine 10 mL Luer Lock Spritze, die mit 3 mL warmer Agaroselösung vorgespannt ist, aus dem 37 °C warmen Wasserbad.
   HINWEIS: Sobald die Spritze mit der Agarose aus dem Wasserbad entfernt wurde, muss die Pankreasinjektion schnell durchgeführt werden, bevor die Agarose abkühlt und in der Spritze aushärtet.
5. Halten Sie die Pinzette in der linken Hand und verwenden Sie sie, um den Gallengang für die Injektion sanft zu stützen und zu stabilisieren.
6. Halten Sie die Spritze in der rechten Hand, führen Sie die Nadel abgeschrägt nach oben in den Gallengang. Langsam und stetig die Bauchspeicheldrüse injizieren. Sobald die Injektion beginnt, kann der Fluss nicht gestoppt werden, ohne dass sich die Agarose in der Spritze und in der Bauchspeicheldrüse verhärtet.
   HINWEIS: Das verwendete Volumen hängt vom Gewicht der Maus ab. Aufgrund der Erfahrung wird empfohlen, 1 ml Agaroselösung pro 10 g Körpergewicht der Maus mit einem maximalen Volumen von 2 ml zu verwenden. Die Bauchspeicheldrüse sollte leicht aufgeblasen mit einer definitiveren Struktur aussehen, aber nicht überdehnt. Eine Überinjektion führt zu Inseln, die vom exokrinen Gewebe getrennt werden und in den Scheiben ein "ausgeblasenes" Aussehen haben.
7. Schneiden Sie die mit Agarose gefüllte Bauchspeicheldrüse aus der Maus aus. Schneiden Sie mit einer Pinzette und einer Schere die Bauchspeicheldrüse weg, beginnend am Magen, bewegen Sie sich in den Darm und enden Sie an der Milz. Nach dem Abschneiden die injizierte Bauchspeicheldrüse vorsichtig mit einer Pinzette entfernen und in eine 10 cm lange Petrischale geben, die mit gekühltem ECS gefüllt ist.
8. Verwenden Sie eine Schere, um das Fettgewebe, das Bindegewebe, das fibrotische Gewebe und Teile der Bauchspeicheldrüse zu entfernen, die nicht mit Agarose injiziert werden.
   HINWEIS: Teile des Gewebes, die entfernt werden sollten, haben keine stark etablierten Strukturen und erscheinen etwas gallertartig.
9. Nachdem Sie das Gewebe zugeschnitten haben, schneiden Sie es mit einer Schere in kleinere Abschnitte mit einem Durchmesser von etwa 5 mm, während Sie es unter ECS tauchen lassen. Schneiden Sie das Gewebe vorsichtig ab und achten Sie darauf, die Agarose nicht aus dem Gewebe zu drücken.
10. Entfernen Sie die Gewebestücke aus dem ECS und legen Sie sie auf einen zweilagigen Scheibenwischer (siehe Materialtabelle). Rollen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette auf dem Wischer, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
11. Legen Sie die Gewebestücke mit einer Pinzette vorsichtig in eine 35-mm-Petrischale mit nicht mehr als 4 Stück pro Platte. Legen Sie die flachste Seite des Gewebeblocks nach unten. Drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf das Gewebe.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass zwischen den Gewebestücken Platz ist, mindestens ein paar Millimeter, und dass sie den Rand der Platte nicht berühren.
12. Gießen Sie die 37 °C Agarose langsam in die Schale und achten Sie darauf, sie nicht direkt auf das Gewebe zu gießen. Gießen Sie genug, so dass die Gewebestücke vollständig bedeckt sind. Stellen Sie sicher, dass sich über den Gewebestücken eine Agaroseschicht befindet, da dieser Teil auf den Probenhalter geklebt wird.
13. Die Schale mit den Taschentüchern vorsichtig in einen Kühlschrank geben, damit die Agarose aushärten kann. Stellen Sie sicher, dass sich die Gewebestücke nicht verschieben oder zu schweben beginnen. Wenn dies der Fall ist, stellen Sie sie schnell mit einer Pinzette nach.
    HINWEIS: Das Absetzen der Agarose sollte nur wenige Minuten dauern.
14. Sobald die Agarose ausgehärtet ist, verwenden Sie ein Skalpell, um das Gewebe in geraden Linien zu schneiden, um Agaroseblöcke zu bilden, als ob sie ein Gitter zwischen den Gewebestücken bilden würden. Achten Sie darauf, ein paar Millimeter Agarose zu lassen, die alle Seiten des Gewebes umgeben.
    HINWEIS: Es sollte kein Gewebe aus der Agarose herausragen. Jeder Block sollte ein Würfel von ca. 5 mm x 5 mm x 5 mm Volumen sein.
15. Verwenden Sie das Skalpell, um die leeren Abschnitte von Agarose auszuklappen, die an den Rändern der Platte geschnitten wurden. Entfernen Sie die Blöcke mit dem Gewebe aus der Schale, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette anheben.

3. Generierung von Pankreasscheiben bei der Maus

1. Ordnen Sie die Blöcke mit einer Pinzette auf dem Probenhalter an; Legen Sie sie seitlich und denken Sie daran, dass sie auf den Sekundenkleber gekippt werden. Ordnen Sie die Blöcke so an, dass sie nicht über die Blattbreite hinausragen. Wenn sich das Vibratom langsam bewegt, ordnen Sie die Blöcke so an, dass sich die Klinge so weit wie möglich vorwärts bewegen muss.
   HINWEIS: Zwei Reihen von drei oder vier Blöcken mit jeweils einigen Millimetern zwischen den Zeilen funktionieren gut. Die Blöcke innerhalb derselben Reihe können sich berühren, aber wenn sich beide Zeilen berühren, kann es schwierig sein, Slices abzurufen, wenn sie von den Blöcken kommen.
2. Tragen Sie eine Linie Sekundenkleber auf den Probenhalter auf und verwenden Sie das Ende des Leimspenders, um den Kleber in einer dünnen Schicht zu verteilen. Drehen Sie die Gewebeblöcke auf den Kleber, so dass die Dem Gewebe am nächsten gelegene Seite nach oben zeigt. Drücken Sie vorsichtig auf die Blöcke und lassen Sie den Kleber drei Minuten trocknen.
3. Befestigen Sie den Klingenhalter und die Platte am Vibratom, typischerweise mit einer Schraube oder einem Magneten, abhängig vom Vibratommodell. Stellen Sie die Klingenhöhe und den zurückgelegten Weg so ein, dass sich die Klinge über die Länge der Blöcke und knapp darüber bewegt.
   HINWEIS: Eine Pinzette kann beim Einstellen der Klingenhöhe hilfreich sein. Sie können auf dem Gewebeblock platziert werden, um die Klinge so nah wie möglich an der Oberseite des Blocks zu platzieren, ohne den Block zu berühren.
4. Stellen Sie sicher, dass der Kleber getrocknet ist, indem Sie die Blöcke vorsichtig mit einer Pinzette anstupsen, und füllen Sie die Vibrationsschale mit gekühltem ECS, bis die Klinge bedeckt ist. Stellen Sie das Vibratom so ein, dass es Scheiben mit einer Dicke von 120 μm mit einer Geschwindigkeit von 0,175 mm/s, einer Frequenz von 70 Hz und einer Amplitude von 1 mm herstellt.
   HINWEIS: Die Vibrationsgeschwindigkeit kann abhängig von der Leichtigkeit des Schneidens des Gewebes eingestellt werden.
5. Starten Sie das Vibratom und achten Sie darauf, wann sich die Scheiben von den Gewebeblöcken lösen. Verwenden Sie eine 10 cm Graefe-Pinzette oder einen kleinen Pinsel Nr. 4, um die Scheiben vorsichtig zu entfernen, sobald sie vom Block schwimmen, und legen Sie sie in 10 cm große Platten mit KRBH, die 3 mM D-Glucose und Trypsin-Inhibitor enthalten. Heben Sie die Scheiben auf, indem Sie einen Pinsel oder eine Pinzette darunter legen und die Scheiben vorsichtig anheben. Inkubieren Sie nicht mehr als 15 Scheiben zusammen in einem einzigen Teller.
   HINWEIS: Es ist normal, dass das Vibratom einige Durchgänge über die Blöcke hat, in denen keine Scheiben gemacht werden, aber diese sollten für die Zeit minimiert werden. Halten Sie eine Schere bereit, falls sich die Scheiben nicht vollständig von den Gewebeblöcken trennen. In diesem Fall wird eine Ecke oder Kante der Scheibe an den Block geklebt, nachdem die Vibrationsklinge passiert ist. Ziehen Sie die Scheibe oder den Block nicht ab, wenn Sie die verklebte Scheibe entfernen.
6. Legen Sie die Platten mit den Scheiben bei Raumtemperatur und bei 25 U / min auf eine Wippe. Lassen Sie die Scheiben eine Stunde bei Raumtemperatur ruhen. Wenn sie länger belassen werden sollen, legen Sie die Scheiben in 15 ml Scheibenkulturmedium (siehe Ergänzende Tabelle 1) in einen Inkubator. Inkubieren Sie Scheiben, die für Untersuchungen am selben Tag bei 37 °C vorbereitet wurden, und Kulturscheiben, die über Nacht bei 24 °C kultiviert werden, und übertragen Sie sie mindestens 1 h vor den Versuchen auf 37 °C.
   HINWEIS: Auf lange Sicht haben die Scheiben eine bessere Lebensfähigkeit, wenn sie bei 24 ° C kultiviert werden, obwohl 37 ° C näher an ihrer nativen physiologischen Umgebung liegt, wahrscheinlich aufgrund der geringeren Aktivität der sezernierten Proteaseenzyme bei niedrigerer Temperatur. Maus- und menschliche Pankreasgewebescheiben werden beide bei gleicher Temperatur und mit maximal 15 Scheiben pro Schale kultiviert. Die Medienrezepte unterscheiden sich jedoch für Mensch- und Mausscheiben. Beide Formulierungen sind in der Ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. Darüber hinaus ist das Verfahren das gleiche für die Erzeugung von Maus- und Menschenscheiben mit Ausnahme der Bauchspeicheldrüse der Maus, die zur Stabilisierung eine Injektion mit Agarose erfordert. Menschliche Scheiben werden durch das nPOD Pancreas Slice Program erworben. Sowohl Maus- als auch Menschliche Schnitte sind 120 μm dick. Eine Vielzahl von Experimenten kann an den Scheiben durchgeführt werden; Wählen Sie Färbeplatten, die für geplante Experimente am besten geeignet sind.

4. Scheibenvorbereitung für Färbevorgänge

1. Die Scheiben bei 37 °C für mindestens 1 h vor den geplanten Versuchen kultivieren. Warmes KRBH mit 3 mM D-Glucose in einem 37 °C warmen Wasserbad. Geben Sie 2 ml KRBH mit 3 mM D-Glucose in eine 35-mm-Schale und legen Sie die Scheibe vorsichtig in die Schüssel.
2. Wenn die Scheibe von Medium übertragen wird, waschen Sie sie zweimal mit KRBH, das 3 mM D-Glucose enthält. Aspirieren Sie den KRBH vorsichtig mit 3 mM D-Glucose mit einer Transferpipette oder Pasteurpipette und achten Sie darauf, die Scheibe nicht zu stören. Bewahren Sie die Scheibe in der Platte mit KRBH auf, die 3 mM D-Glucose enthält, während die Färbeplatten vorbereitet werden.

5. Dithizon-Färbung

HINWEIS: Obwohl Dithizon verwendet werden kann, um die Inseln rot zu färben, tötet es die Scheibe ab, da festgestellt wurde, dass es für Inseln zytotoxisch ^ist17.

1. 12,5 mg Dithizon werden gemessen, zu 1,25 ml Dimethylsulfoxid gegeben und dieses Gemisch in einer 50-ml-Spritze aufgenommen. Füllen Sie die Spritze mit Hanks Balanced Salt Solution auf ein Volumen von 25 ml und befestigen Sie einen Filter am Ende der Spritze. Aliquot 2 mL KRBH mit 3 mM D-Glucose und 2 Tropfen der filtrierten Dithizonlösung aus der 50 ml Spritze in eine 35 mm Schale geben.
2. Legen Sie mit einem Pinsel vorsichtig eine Scheibe in eine 35-mm-Petrischale. Stellen Sie sich die Scheibe mit den Inseln vor, die durch rote Dithizonfärbung mit einem Stereomikroskop gekennzeichnet sind.

6. Färbung der Lebensfähigkeit

HINWEIS: In diesem Abschnitt des Protokolls wird beschrieben, wie die Lebensfähigkeit von Scheiben mit Calcein-AM und blau fluoreszierendem SYTOX Blue bewertet wird (siehe Materialtabelle). Calcein-AM sollte in einer Konzentration von 4 μM und SYTOX Blue in einer Konzentration von 1 μM angewendet werden.

1. Aliquot 2 ml KRBH mit 3 mM D-Glucose und 2 μL Calcein-AM-Farbstoff und SYTOX Blue zur Trennung der Aliquots. Wirbeln Sie die Mischungen für 5 s.
2. Geben Sie 200 μL KRBH mit 3 mM D-Glucose und Calcein-AM-Farbstoff in jede Vertiefung eines 8-Well-Kammer-Deckglases.
   HINWEIS: Es können alternative Platten und/oder Bildgebungskammern verwendet werden, die keine 8-Well-Kammer-Deckgläser sind.
3. Legen Sie mit einem Pinsel vorsichtig eine Scheibe in jede Vertiefung der Platte und geben Sie die Platte mit den Scheiben für 20 Minuten in einen 37 ° C-Inkubator. Waschen Sie die Scheiben zweimal mit KRBH, das 3 mM D-Glucose enthält. Aspirieren Sie den KRBH vorsichtig mit einer Transfer- oder Pasteurpipette und achten Sie darauf, die Scheibe nicht zu stören.
4. Legen Sie die Scheibe in eine 35 mm große Petrischale mit Glasboden, die 2 ml KRBH mit 3 mM D-Glucose und 2 μL SYTOX Blue in einer Konzentration von 1 μL pro 1 ml Lösung enthält. Decken Sie die Scheibe mit einem Scheibenanker ab und stellen Sie sicher, dass die Seite mit der Harfe nach unten zeigt. Nehmen Sie Bilder des Segments auf.
   HINWEIS: Wenn der Scheibenanker weiter schwimmt, befeuchten Sie ihn auf beiden Seiten mit KRBH, der 3 mM D-Glucose enthält, um ihn in die Lösung einzutauchen. Es ist wichtig, die Scheiben immer in Lösungen zu halten, die Proteaseinhibitor enthalten, auch während der Farbstoffbeladung. Die verwendeten Lebensfähigkeitsflecken können für das spezifische Experiment oder den Mikroskopaufbau angepasst werden.

7. ^Ca2+ Indikatorfärbung in Scheiben schneiden

HINWEIS: In diesem Abschnitt des Protokolls wird beschrieben, wie Scheiben für ^Ca2+ -Aufnahmen mit Oregon Green 488 BAPTA-1, AM und SYTOX Blue in Mausscheiben gebeizt werden (siehe Materialtabelle). Das Oregon Green 488 BAPTA-1, AM sollte in einer Konzentration von 5,6 μM und das SYTOX Blue in 1 μM eingesetzt werden. In menschlichen Scheiben sollte Fluo-4-AM in einer Konzentration von 6,4 μM verwendet werden.

1. Aliquot 2 mL KRBH enthaltend 3 mM D-Glucose, 7 μL des Oregon Green 488 BAPTA-1, AM zugegeben und die Mischung für 5 s vorgewirbelt.
   HINWEIS: Verwenden Sie für menschliche Gewebeschnitte Fluo-4-AM anstelle des Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Die Fluo-4-AM ist vorzuziehen, weil sie heller ist, wenn die intrazelluläre ^Ca2+- Konzentration ansteigt; Es lädt jedoch nicht gut im Pankreasgewebe der Maus. Das Protokoll ist das gleiche wie oben für Fluo-4-AM beschrieben, mit der Ausnahme, dass Fluo-4-AM nur für 30 minuten inkubiert werden muss.
2. Fügen Sie 200 μL KRBH mit 3 mM D-Glucose und den Farbstoff in jede Vertiefung eines 8-Well-Kammerdeckglases hinzu. Legen Sie mit einem Pinsel vorsichtig eine Scheibe in jede Vertiefung des Kammerdeckglases. Das Kammerdeckglas mit den Scheiben für 45 min in einen 37 °C Inkubator geben.
3. Waschen Sie die Scheiben zweimal mit KRBH, das 3 mM D-Glucose enthält. Aspirieren Sie den KRBH vorsichtig mit 3 mM D-Glucose mit einer Transfer- oder Pasteurpipette und achten Sie darauf, die Scheibe nicht zu stören.
4. Legen Sie eine Scheibe in eine bildgebende Platte oder Kammer mit KRBH, die 3 mM D-Glucose und SYTOX Blue in einer Konzentration von 1 μL pro 1 mL enthält, und bedecken Sie sie mit einem Scheibenanker, um sicherzustellen, dass die Harfe nach unten zeigt. Nehmen Sie Bilder des Segments auf.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurde eine 35-mm-Schale verwendet, die mit 2 ml KRBH gefüllt war und 3 mM D-Glucose und 2 μL SYTOX Blue enthielt. Wenn der Scheibenanker weiter schwimmt, befeuchten Sie ihn auf beiden Seiten mit KRBH, der 3 mM D-Glucose enthält, um ihn in Lösung zu tauchen.

8. Mouse Slice ^Ca2+ Aufnahmen

HINWEISE: Im folgenden Abschnitt wird beschrieben, wie ^Ca2+ -Aufnahmen auf Pankreasgewebeschnitten der Maus mit dem Oregon Green 488 BAPTA-1, AM und SYTOX Blue durchgeführt werden. Die Bildgebung wurde auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien für Details). Die verwendeten Laser waren 405 nm für die SYTOX Blue, 488 nm für die Oregon Green 488 BAPTA-1, AM und 638 nm für die Reflexion. Ein HyD-Detektor wurde für den Oregon Green 488 BAPTA-1, AM verwendet. Photomultiplierröhren (PMT) Detektoren wurden für reflexion und den SYTOX Blue verwendet. Das ^{Ca2 +} -Bildgebungsprotokoll ist für menschliche Pankreasgewebeschnitte gleich, mit der Ausnahme, dass Fluo-4-AM als Indikator verwendet wurde. Laserleistungspegel, Verstärkung und Lochgröße sollten basierend auf der Probe und der jeweiligen abgebildeten Insel angepasst werden. Typischerweise sind ein Loch von 1,5 luftigen Einheiten und eine Laserleistung von 1% gute Ausgangspunkte.

1. Schalten Sie mindestens 1 h vor der Aufnahme das Mikroskop ein und balancieren Sie den Stage-Top- oder Käfig-Inkubator auf 37 °C. Legen Sie die 35 mm Deckglasboden-Petrischale mit der Scheibe nach dem Entfernen des Deckels auf die Bühne. Fokussieren Sie, indem Sie das Mikroskop auf den 10-fachen Objektiv- und Hellfeldmodus einstellen. Lokalisieren Sie Inseln mit brightfield, indem Sie nach orange-braunen Ovalen in der Scheibe suchen.
2. Sobald eine wahrscheinliche Insel lokalisiert ist, schalten Sie das Mikroskop in den konfokalen Bildgebungsmodus. Um die Inseln durch Reflexion zu bestätigen, schalten Sie den 638-nm-Laser ein, stellen Sie die Laserleistung zwischen 1% und 2% ein und schalten Sie den 638-nm-Notch-Filter aus, der normalerweise rückgestreutes Licht entfernen würde. Stellen Sie die Nachweisgrenzen des PMT-Detektors auf eine Bandbreite von ca. 20 nm ein, zentriert um 638 nm.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, da der Betrieb des Mikroskops im Reflexionsmodus den Detektor beschädigen könnte. Aufgrund der hohen Granularität des endokrinen Gewebes kann reflektiertes Licht nun verwendet werden, um Inseln zu lokalisieren. Die Inseln erscheinen als Gruppen von hell rückstreuenden körnigen Zellen auf diesem Reflexionskanal.
3. Um den SYTOX Blue zu sehen, schalten Sie den 405 nm Laser und DEN PMT-Detektor ein und stellen Sie die Laserleistung zwischen 1% und 2% ein. Zentrieren Sie die gewünschte Insel im Sichtfeld mit den X- und Y-Reglern des Bühnenreglers. Sobald eine Insel von Interesse gefunden und durch Rückstreuung bestätigt wurde, wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv und zoomen Sie hinein, so dass die Insel den größten Teil des Bildes einnimmt.
4. Nehmen Sie einen Z-Stapel der Insel mit einer z-Schritt-Größe von 1,5 μm. Finden Sie den besten optischen Abschnitt der Insel, wo die meisten Zellen am Leben sind (negativ für das SYTOX Blue) und gut beladen mit dem Oregon Green 488 BAPTA-1, AM oder Fluo-4-AM.
   HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, Zellen zu sehen, die mit einer großen Menge an Farbstoff überladen sind und die sehr hell sind. Dabei kann es sich um absterbende Pankreaszellen handeln, in denen eine ^Ca2+ -Speicherung im endoplasmatischen Retikulum freigesetzt werden kann, was zu einer hohen Belastung führt; Dies sind keine idealen Zellen zum Aufzeichnen. Suchen Sie nach Zellen, die den Farbstoff deutlich belastet haben, aber den Detektor nicht übersättigen, so dass eine Helligkeitszunahme sichtbar ist, die auftritt, wenn der zytosolische ^Ca2+- Spiegel schwankt. Die Farbstoffbeladung von Inseln in Scheiben ist variabel; Der Farbstoff lädt jedoch typischerweise gut durch ~ 10-15 μm der Insel. Die Farbstoffbelastung kann jedoch schwierig zu visualisieren sein, wenn sich die Zellen tief im Gewebe befinden.
5. Um ein Ausbleichen des Farbstoffs während der Aufnahme zu verhindern, stellen Sie sicher, dass die Laserleistung auf dem 488-nm-Kanal 2% nicht überschreitet. Erhöhen Sie das Loch auf 2 luftige Einheiten, um mehr Signal mit geringerer Erregerleistung zu sammeln.
6. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es im XYZT-Modus aufzeichnet. Optimieren Sie die Einstellungen, um die Bildrate auf 2 s oder weniger pro Frame zu reduzieren.
   HINWEIS: Zu den Einstellungen, die vorgenommen werden können, um die Bildrate zu verringern, gehören das Aktivieren des bidirektionalen Scannens, das Verringern oder Deaktivieren der Zeilenmittelung und das Erhöhen der Scangeschwindigkeit.
7. Sobald die Einstellungen optimiert wurden, zeichnen Sie mehrere Minuten basaler Aktivität auf.
   HINWEIS: Ein weiterer guter Indikator für die Lebensfähigkeit des Gewebes ist, wenn die Zellen während dieser Aufzeichnung der basalen Aktivität aktiv erscheinen und sichtbar blinken.
8. 100 μL 20x konzentrierte Glucose und KCl in KRBH unter Verwendung einer 200 μL Mikropipette zu den angegebenen Zeitpunkten auf die Platte geben, um eine Endkonzentration von 16,7 mM Glucose oder 30 mM KCl zu erreichen.
   HINWEISE: Fügen Sie die Lösungen vorsichtig hinzu und achten Sie darauf, dass der Slice während der Aufnahme nicht gestört wird. Achten Sie darauf, die Platte nicht mit der Mikropipette zu stoßen. Es ist typisch zu sehen, wie sich das Gewebe als Reaktion auf diese Stimulationen zusammenzieht. Die ^Ca2+ Flussaufzeichnungen wurden in ^ImageJ18 verarbeitet und quantifiziert. Mit der ImageJ-Software wurde die Färbeintensität des Oregon Green 488 BAPTA-1, AM in den Zellen durch manuelle Auswahl von Regions of Interest (ROIs) gemessen. Die Fluoreszenzintensität aus diesen ROIs wurde berechnet, indem die Fluoreszenzwerte zu späteren Zeitpunkten durch die anfänglichen Fluoreszenzwerte der Zellen (F/_F0) dividiert wurden. Ein Perfusionssystem kann zusammen mit einer speziellen Bildgebungskammer verwendet werden, um die Lösungen dynamisch auf Scheiben zu verabreichen, anstatt sie manuell hinzuzufügen. Empfehlungen für Perfusionssysteme und Bildgebungskammern finden Sie in der Materialtabelle.

9. Färbung von Maus-T-Zellen in lebenden Pankreasscheiben

HINWEIS: In diesem Abschnitt des Protokolls wird beschrieben, wie Immunzellen in Mausscheiben angefärbt werden. Der verwendete Mausstamm ist der NOD. Rag1^-/-. AI4 ^α/β, da dieses Modell konsequent Eine Erkrankung mit signifikanter Insulitis entwickelt. Die CD8⁺ T-Zellen in dieser Maus zielen alle auf ein Epitop von Insulin ab, was die Verwendung eines Phycoerythrin (PE)-markierten Insulin-Db-Tetramers15 ermöglicht. Der CD8-Antikörper sollte in einer Konzentration von 1:20 und das Insulintetramer in einer Konzentration von 1:50 verwendet werden.

1. Aliquot 100 μL KRBH enthaltend 3 mM D-Glucose, 2 μL PE Insulin Tetramer und 5 μL Allophycocyanin (APC) CD8 Antikörper hinzufügen und die Mischung für 5 s wirbeln.
2. 100 μL KRBH enthaltend 3 mM D-Glucose und das Tetramer und den Antikörper in eine Vertiefung eines 8-Well-Kammer-Deckglases geben. Legen Sie mit einem Pinsel vorsichtig eine Scheibe in den Brunnen des Kammerdeckglases. Das Kammerdeckglas mit der Scheibe für 30 min in einen 37 °C Inkubator überführen.
3. Waschen Sie die Scheibe zweimal mit 2 ml KRBH, die 3 mM D-Glucose enthalten. Aspirieren Sie den KRBH vorsichtig mit 3 mM D-Glucose mit einer Transfer- oder Pasteurpipette und achten Sie darauf, die Scheibe nicht zu stören.
4. Legen Sie die Scheibe in eine 35-mm-Deckglasboden-Petrischale, die KRBH mit 3 mM D-Glucose und dem SYTOX Blue in einer Konzentration von 1 μL pro 1 ml enthält, und bedecken Sie sie mit einem Scheibenanker, wobei Sie die Seite mit der Harfe nach unten legen. Nehmen Sie Bilder des Segments auf.
   HINWEIS: Wenn der Scheibenanker weiter schwimmt, befeuchten Sie ihn auf beiden Seiten mit KRBH, der 3 mM D-Glucose enthält, um ihn in die Lösung einzutauchen. Der verdünnte Antikörper und das Tetramer können einmal wiederverwendet werden. Nach dem Färben von zwei Scheiben sollte eine frische Antikörpermischung hergestellt werden.

10. Aufzeichnung von Immunzellen der Maus

HINWEIS: Im folgenden Abschnitt wird beschrieben, wie Immunzellaufnahmen an Pankreasgewebeschnitten der Maus mit CD8-Antikörpern, PE-Insulintetramer und SYTOX Blue durchgeführt werden. Der Imaging-Aufbau ist wie in Abschnitt 8 beschrieben. Die Aufnahmen wurden mit 800 × 800 Pixel Auflösung gemacht. Die verwendeten Laser waren 405 nm für das SYTOX Blue, 488 nm für das Insulintetramer und 638 nm für CD8-Antikörper und Reflexion. HyD-Detektoren wurden für CD8-Antikörper und PE-Insulintetramer verwendet. PMT-Detektoren wurden für die Reflexion und das SYTOX Blue verwendet. Das Immunzellbildgebungsprotokoll ist für menschliche Pankreasgewebeschnitte gleich, mit Ausnahme der Verwendung verschiedener Antikörper und Antigen-komplexierter HLA-Multimere für menschliches Gewebe. Sowohl für die Insulintetramerfärbung im Mausgewebe als auch für die HLA-Multimerfärbung im menschlichen Gewebe sollte eine Immunzell-Co-Färbung verwendet werden, um das Vorhandensein der spezifischen Antigen-reaktiven T-Zellen zu überprüfen. Hier kam ein Anti-CD8-Antikörper zum Einsatz. Antikörper wie Anti-CD3 oder Anti-CD4 können je nach Zielzellpopulation ebenfalls eingesetzt werden.

1. Schalten Sie mindestens 1 h vor der Aufnahme das Mikroskop ein und balancieren Sie den Stage-Top-Inkubator auf 37 °C. Befestigen Sie die 35-mm-Petrischale mit Der Scheibe auf der Bühne. Fokussieren Sie das Mikroskop, indem Sie das 10-fache Objektiv in den Hellfeldmodus stellen. Suchen Sie die Inseln im Hellfeldmodus, indem Sie nach orange-braunen Ovalen innerhalb des Segments suchen.
2. Schalten Sie das Mikroskop auf konfokale Bildgebung um, indem Sie die CS-Taste auf dem Touchscreen-Controller des Mikroskops drücken. Um die Inseln nach Reflexion zu betrachten, schalten Sie den 638-Laser- und PMT-Detektor ein, stellen Sie die Laserleistung zwischen 1% und 2% ein und schalten Sie die Kerbfilter aus.
   HINWEIS: Aufgrund der erhöhten Granularität des endokrinen Gewebes kann reflektiertes Licht jetzt verwendet werden, um Inseln zu lokalisieren. Die Inseln erscheinen als Gruppen von hellen körnigen Zellen auf diesem Kanal.
3. Um das SYTOX Blue, den CD8-Antikörper und das Insulintetramer zu sehen, überprüfen Sie, ob die Laserleistung zwischen 1% und 2% liegt. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen, um jede der drei anzuzeigen: Schalten Sie für den SYTOX Blue den 405-nm-Laser und den PMT-Detektor ein; Schalten Sie für den CD8-Antikörper den HyD-Detektor ein. und um das Insulintetramer zu sehen, schalten Sie den 488 nm Laser und den HyD-Detektor ein.
4. Zentrieren Sie die gewünschte Insel im Sichtfeld mit den X- und Y-Reglern des Bühnenreglers. Sobald eine Insel von Interesse gefunden ist, wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv und zoomen Sie hinein, so dass die Insel den größten Teil des Bildes einnimmt. Nehmen Sie einen Z-Stapel der Insel mit einer z-Schritt-Größe von 1,5 μm. Finden Sie die besten optischen Abschnitte (eine Reihe von zwischen 5 und 10 Abschnitten) der Insel, wo die meisten Zellen am Leben sind (negativ für das SYTOX Blue) und alle umgebenden Immunzellen im Fokus sind.
   HINWEIS: Versuchen Sie, Rahmen zu finden, in denen sich mehrere CD8-positive und Insulin-Tetramer-positive Zellen befinden, die die Insel umgeben oder infiltrieren.
5. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es im XYZT-Modus aufzeichnet. Optimieren Sie die Einstellungen, um alle 20 Minuten über einen Zeitraum von mehreren Stunden einen Z-Stack der ausgewählten Schritte aufzuzeichnen.
   HINWEIS: Wenn möglich, ist es am besten, diese Aufzeichnungen in einer Bildgebungskammer zu machen, in der Temperatur und _CO2-Gehalt kontrolliert werden können, insbesondere wenn sie länger als vier Stunden aufgezeichnet werden. Im Falle der Aufzeichnung über Nacht können überschüssige Antikörper zu den Medien hinzugefügt werden, um den T-Zell-Rezeptorzyklus und das Ausbleichen von Farbstoffen zu kompensieren. Zusätzlich können verschiedene Fluorophore für die T-Zell-Antikörper verwendet werden. Erfahrungsgemäß funktionieren Antikörper im fernroten Bereich am besten für T-Zellen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll liefert lebende Pankreasgewebeschnitte, die sowohl für Funktionsstudien als auch für Immunzellaufnahmen geeignet sind. Das Erscheinungsbild der Scheiben sowohl im Hellfeld als auch unter reflektiertem Licht ist in Abbildung 1A,B dargestellt. Wie bereits erwähnt, können Inseln in Scheiben gefunden werden, die reflektiertes Licht aufgrund ihrer erhöhten Granularität verwenden, die aufgrund ihres Insulingehalts auftritt (Abbildung 1C<...

Diskussion

Ziel dieses Protokolls ist es, die Erzeugung von Pankreasscheiben und die Verfahren, die für die Verwendung der Scheiben in funktionellen und immunologischen Studien erforderlich sind, zu erläutern. Es gibt viele Vorteile bei der Verwendung von lebenden Pankreasscheiben. Es gibt jedoch mehrere kritische Schritte, die wesentlich sind, damit das Gewebe während der beschriebenen Experimentprotokolle lebensfähig und nützlich bleibt. Es ist unerlässlich, schnell zu arbeiten. Die Zeitspanne zwischen der Injektion der Bau...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Style Scalpel Handle	Fisherbrand	12-000-163
1 M HEPES	Fisher Scientific	BP299-100	HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Untreated Culture Dish	Corning	430591
10 mL Luer-Lok Syringe	BD	301029	BD Syringe with Luer-Lok Tips
27 G Needle	BD	BD 305109	BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles
35 mm coverglass-bottom Petri dish	Ibidi	81156	µ-Dish 35 mm, high
50 mL syringe	BD	309653
8-well chambered coverglass	Ibidi	80826	µ-Slide 8 Well
APC anti-mouse CD8a antibody	Biolegend	100712
BSA	Fisher Scientific	199898
Calcium chloride	Sigma	C5670	CaCl2
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	CaCl2 (dihydrate)
Compact Digital Rocker	Thermo Fisher Scientific	88880020
Confocal laser-scanning microscope	Leica	SP8	Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	C6H12O6
ddiH2O
Dithizone	Sigma-Aldrich	D5130-10G
DMSO	Invitrogen	D12345	Dimethyl sulfoxide
Ethanol	Decon Laboratories	2805
Falcon 35 mm tissue culture dish	Corning	353001	Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes
FBS	Gibco	10082147
Feather No. 10 Surgical Blade	Electron Microscopy Sciences	7204410
fluo-4-AM	Invitrogen	F14201	cell-permeable Ca2+ indicator
Gel Control Super Glue	Loctite	45198
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-09
HBSS	Gibco	14025092	Hanks Balanced Salt Solution
HEPES	Sigma	H4034	C8H18N2O4S
Ice bucket	Fisherbrand	03-395-150
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz Surgical Store	RS-7440	Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34705	Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L3224	This kit contains the calcein-AM live cell dye.
Low glucose DMEM	Corning	10-014-CV
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	MgCl2 (hexahydrate)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M2773	MgSO4 (heptahydrate)
Magnetic Heated Platform	Warner Instruments	PM-1	Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Microwave	GE	JES1460DSWW
Nalgene Syringe Filter	Thermo Fisher Scientific	726-2520
No.4 Paintbrush	Michaels	10269140
Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26	Imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM	Invitrogen	O6807	cell-permeable Ca2+ indicator
Overnight imaging chamber	Okolab	H201-LG
PBS	Thermo Fisher Scientific	20012050	To make agarose for slice generation
PE-labeled insulin tetramer	Emory Tetramer Research Core	sequence YAIENYLEL
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Potassium chloride	Sigma	P5405	KCl
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	KH2PO4
Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	71998	For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated
RPMI 1640	Gibco	11875093
SeaPlaque low melting-point agarose	Lonza	50101	To make agarose for slice generation
Slice anchor	Warner Instruments	64-1421
Slice anchor (dynamic imaging)	Warner Instruments	640253	Slice anchor for dynamic imaging chamber
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma	S5886	NaCl
Sodium phosphate monohydrate	Sigma	S9638	NaH2PO4 (monohydrate)
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)
Stage Adapter	Warner Instruments	SA-20MW-AL	To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage
Stage-top incubator	Okolab	H201
Stereoscope	Leica	IC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Invitrogen	S34857	blue-fluorescent nucleic acid stain
Transfer Pipet	Falcon	357575	Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets
Valve Control System	Warner Instruments	VCS-8	System for dynamic stimulation recordings
Vibratome VT1000 S	Leica	VT1000 S
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD02	Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02