Chicken Recombinant Limbs Assay, um Morphogenese, Musterung und frühe Schritte in der Zelldifferenzierung zu verstehen

Zusammenfassung

Rekombinante Gliedmaßen sind ein leistungsfähiges experimentelles Modell, das es ermöglicht, den Prozess der Zelldifferenzierung und die Erzeugung von Mustern unter dem Einfluss embryonaler Signale zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung rekombinanter Gliedmaßen mit Mesodermalzellen von Hühnergliedmaßen vor, die an andere Zelltypen angepasst werden können, die aus verschiedenen Organismen gewonnen werden.

Zusammenfassung

Zelldifferenzierung ist der fein abgestimmte Prozess der Zellbindung, der zur Bildung verschiedener spezialisierter Zelltypen während der Etablierung von sich entwickelnden Geweben und Organen führt. Dieser Prozess wird im Erwachsenenalter aktiv aufrechterhalten. Die Zelldifferenzierung ist ein fortlaufender Prozess während der Entwicklung und Homöostase von Organen. Das Verständnis der frühen Schritte der Zelldifferenzierung ist unerlässlich, um andere komplexe Prozesse wie die Morphogenese zu kennen. Somit sind rekombinante Hühnergliedmaßen ein experimentelles Modell, das die Untersuchung der Zelldifferenzierung und Mustergenerierung unter embryonalen Mustersignalen ermöglicht. Dieses experimentelle Modell imitiert eine In-vivo-Umgebung ; Es setzt reaggregierte Zellen zu einer ektodermalen Hülle zusammen, die aus einer frühen Gliedmaßenknospe gewonnen wird. Später werden Ektoderme übertragen und in einen Kükenembryorezeptor implantiert, um seine Entwicklung zu ermöglichen. Dieser Assay wurde hauptsächlich verwendet, um mesodermale Gliedmaßenknospenzellen zu bewerten; Es kann jedoch auf andere Stamm- oder Vorläuferzellen aus anderen Organismen angewendet werden.

Einleitung

Die Wirbeltierextremität ist ein beeindruckendes Modell zur Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation, des Zelltods, der Musterbildung und der Morphogenese ^1,2. Während der Entwicklung treten Gliedmaßen als Ausbuchtungen aus den Zellen aus, die aus dem lateralen Plattenmesoderm¹ stammen. Gliedmaßenknospen bestehen aus einem zentralen Kern mesodermaler Zellen, die von einem Ektoderm bedeckt sind. Aus dieser frühen Struktur entsteht ein ganzes und wohlgeformtes Gliedmaß. Nachdem die Gliedmaßenknospe entstanden ist, werden drei Achsen erkannt: (1) die proximo-distale Achse ([PD] Schulter zu den Fingern), (2) die dorso-ventrale Achse ([DV] vom Handrücken bis zur Handfläche) und (3) die vorder-hintere ([AP] Daumen zu Finger). Die proximale-distale Achse hängt vom apikalen ektodermalen Kamm (AER) ab, einem spezialisierten Ektoderm an der distalen Spitze der Gliedmaßenknospe. Die AER wird für das Auswachsen, die Überlebenserhaltung, die Proliferation und den undifferenzierten Zustand der Zellen, die Signale empfangen, benötigt ^2,3. Auf der anderen Seite steuert die Zone der Polarisationsaktivität (ZPA) die anteroposteriore Strukturierung⁴, während das dorsale und das Ektoderm die dorsoventrale Strukturierung^{steuern 7,8}. Die Integration dreidimensionaler Muster impliziert ein komplexes Übersprechen zwischen diesen drei Achsen⁵. Trotz des Verständnisses des molekularen Weges während der Gliedmaßenentwicklung bleiben offene Fragen über die Mechanismen, die die Musterung und das richtige Auswachsen steuern, um eine ganze Extremität zu bilden, unbeantwortet.

Edgar Zwilling entwickelte 1964 das System der rekombinanten Gliedmaßen (RL), um die Wechselwirkungen zwischen mesenchymalen Zellen der Gliedmaßen und dem Ektoderm bei der Entwicklung von Gliedmaßen^{zu untersuchen 6}. Das RL-System setzt das dissoziiert-reaggregierte Gliedmaßenknospen-Mesoderm in das embryonale Gliedmaßen-Ektoderm zusammen, um es in den dorsalen Teil eines Spender-Küken-Embryos zu transplantieren. Die vom Ektoderm bereitgestellten Signale induzieren die Expression von Differenzierungsgenen und Mustergenen auf räumlich-zeitliche Weise und induzieren so die Bildung einer gliedmaßenartigen Struktur, die die Zellprogramme, die während der Gliedmaßenentwicklung auftreten, rekapitulieren kann ^7,8,9.

Das RL-Modell ist wertvoll für das Verständnis der Eigenschaften von Gliedmaßenkomponenten und der Wechselwirkung zwischen mesodermalen und ektodermalen Zellen⁶. Eine RL kann als eine gliedmaßenartige Struktur definiert werden, die durch die experimentelle Zusammenstellung oder Rekombination von Mesodermalzellen der Gliedmaßenknospen innerhalb einer ektodermalen Hülle^{entsteht 6}. Die Morphogenese des RL hängt von den Eigenschaften der mesodermalen Zellen (oder anderer Typen) ab, die auf die ektodermalen Mustersignale reagieren. Einer der Vorteile dieses experimentellen Systems ist seine Vielseitigkeit. Diese Eigenschaft ermöglicht die Bildung von Mehrfachkombinationen durch Variation der Quelle von mesodermalen Zellen, wie Zellen aus verschiedenen Entwicklungsstadien, aus verschiedenen Positionen entlang der Extremität oder ganzen (undissoziierten) oder reaggregierten Zellen 7,8,9,10. Ein weiteres Beispiel ist die Fähigkeit, das embryonale Ektoderm von anderen Arten als Hühnern zu erhalten, zum Beispiel Schildkröte¹¹, Wachtel oder Maus¹².

In diesem Sinne hilft die RL-Technik, die Entwicklung der Gliedmaßen und die Wechselwirkungen zwischen mesenchymalen und ektodermalen Zellen der Gliedmaßen aus evolutionärer Sicht zu untersuchen. Diese Technik hat auch ein großes Potenzial für die Analyse der Fähigkeit verschiedener Quellen von Vorläuferzellen, sich in eine gliedmaßenartige Struktur zu differenzieren, indem die Signale des embryonalen Ektoderms^12,13,14 genutzt werden. Im Gegensatz zu In-vitro-Kulturen erlaubt die RL die Bewertung der Differenzierung und des morphogenetischen Potenzials einer Zellpopulation durch Interpretation embryonaler Signale von einem sich entwickelnden Glied ^9,15.

In diesem Protokoll wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung einer erfolgreichen RL mit reaggregierten mesodermalen Gliedmaßenknospenzellen bereitgestellt, wodurch die Möglichkeit eröffnet wird, dieses Protokoll mit verschiedenen Quellen von reaggregierten Zellen oder sogar verschiedenen Ektodermquellen anzupassen.

Protokoll

Diese Forschung wurde vom Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals des Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexiko-Stadt, Mexiko) überprüft und genehmigt. Ein schematisches Flussdiagramm der allgemeinen Schritte dieses Protokolls ist in Abbildung 1A dargestellt.

1. Inkubation von Embryonen und Bestimmung der Lebensfähigkeit

1. Befruchtete Hühnereier bei 38 °C und 60% relativer Luftfeuchtigkeit etwa dreieinhalb Tage lang bebrüten, bis sie das Stadium 22 HH erreichen (nach Hamilton und Hamburger, ^1951)16.
   HINWEIS: Frisch befruchtete Hühnereier können bis zu einer Woche bei 15 °C gelagert werden.
   1. Um die befruchteten Eier zu bebrüten, legen Sie die Eier senkrecht mit der spitzen Seite nach unten in den befeuchteten Inkubator. Drehen Sie die Eier während der Inkubation, da dies notwendig ist, um zu verhindern, dass der sich entwickelnde Embryo an der Schalenmembran haftet.
      HINWEIS: Befruchtete Hühnereier können von lokalen Bauernhöfen bezogen werden. Befruchtete Hühnereier aus Weißem Livorhorn werden im Allgemeinen verwendet, um eine Pigmentierung der Federn in späten Embryonen zu vermeiden. Erwägen Sie, genügend Eier separat zu inkubieren, um drei Strukturen zu erhalten: (1) Mesotermzellen der Gliedmaßen, (2) Ektoderme der Gliedmaßen und (3) Spenderembryonen, um die RL zu transplantieren.
2. Nach dreieinhalb Tagen Inkubation Eier aus dem Inkubator nehmen, mit 70% Ethanol abtupfen und an der Luft trocknen lassen.
3. Identifizieren Sie sich entwickelnde Embryonen, die das Ei verkleben, um die Blutgefäße zu beobachten und den Embryo zu lokalisieren. Verwerfen Sie Eier, die keinen Embryo haben.
   HINWEIS: Verteilen Sie an dieser Stelle die Eier, um mesodermale Zellen, Ektoderme und die Wirte für die RL zu erhalten.

2. Gewinnung von Mesodermalzellen der Gliedmaßen zur Füllung von Ektodermen

HINWEIS: Bevor Sie mit den Manipulationen beginnen, wird dringend empfohlen, den Arbeitsbereich, die Mikroskope und alle Instrumente durch Abtupfen mit 70% iger Ethanollösung zu desinfizieren.

1. Tippen Sie auf das stumpfe Ende der Eierschale mit dem Ende einer stumpfen Pinzette, um ein Fenster zu öffnen, und entfernen Sie etwa 1 cm x 1 cm der Schale mit der Pinzette.
2. Eier in einen Plastik- oder Kartonhalter geben und nacheinander unter das Stereomikroskop legen. Identifizieren Sie die Luftmembran und entfernen Sie sie dann, indem Sie ein kleines Loch auswählen, in dem keine Gefäße gefunden werden. Ziehen Sie diesen Bereich mit Hilfe einer feinen chirurgischen Pinzette.
   HINWEIS: Die Luftmembran kann als die weiße und undurchsichtige Membran identifiziert werden, die unmittelbar nach dem Fenstern des Eies beobachtet wurde.
   1. Entfernen Sie jedes kleine Stück Eierschale, das mit dem Embryo in Berührung kommen könnte.
      HINWEIS: Überprüfen Sie, ob sich die Embryonen im Stadium 22 HH befinden, bevor Sie das Protokoll einleiten. Embryonen in früheren Stadien können in den Inkubator zurückgebracht werden, nachdem das Eierschalenfenster mit Klebeband versiegelt wurde.
3. Öffnen Sie den Fruchtsack vollständig, indem Sie das Fruchtfleisch mit der feinen chirurgischen Pinzette aufreißen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Amnion kann als transparente Membran identifiziert werden, die den Embryo eng bedeckt und mit Fruchtwasser gefüllt ist.
4. Entfernen Sie den Embryo vorsichtig aus dem Ei mit einer stumpfen Pinzette und geben Sie ihn dann in eine sterile Petrischale mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) ab. Wiederholen Sie diesen Schritt für die verbleibenden Eier. Bedenken Sie, dass nur ~ 8-10 Embryonen ausreichen, um die mesodermalen Zellen zu erhalten.
5. Waschen Sie die Embryonen einmal in eiskaltem 1x PBS und ziehen Sie mit Hilfe eines Stereomikroskops (siehe Materialtabelle) alle verbleibenden Membranen zurück. Suchen Sie die Hinterbeinknospen.
   HINWEIS: Gliedmaßenknospen sind abgerundete Strukturen, die sich entlang der vorder-hinteren Achse des Embryos als Vorsprünge aus der Flanke befinden. Die Hinterbeine befinden sich mehr posterior als die Vorderbeine.
6. Pflegen Sie die Embryonen in sauberem 1x PBS und schneiden Sie mit einem Paar feiner chirurgischer Pinzetten jede Hinterbeinknospen in Längsrichtung ab. Schneiden Sie die Knospe sehr nahe an der Flanke des Embryos ab, um die gesamten Hinterbeinknospen zu sezieren. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den verbleibenden Embryonen.
7. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um die Gliedmaßenknospen in ein leeres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.
8. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um überschüssiges 1x PBS zu entfernen, und ersetzen Sie PBS durch 500 μL 0,5% ige Trypsinlösung (siehe Materialtabelle). Gliedmaßenknospen in einem Thermoblock für 7 min bei 37 °C inkubieren.
9. Entfernen Sie die Trypsinlösung und ersetzen Sie sie durch 500 μL Kollagenase Typ IV bei 2 mg/ml in Hanks Balanced Salt Solution (siehe Materialtabelle), dann inkubieren Sie sie in einem Thermoblock bei 37 °C für 8 min.
   HINWEIS: Die Trypsinkubation löst die Ektoderme leicht, während Kollagenase mesodermale Zellen disagregiert.
10. Entfernen Sie nach der Inkubation so viel Kollagenase wie möglich und ersetzen Sie sie durch 1 ml kaltes Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG) Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), um die Enzyme zu inaktivieren. Die Mischung vorsichtig ~10 mal pipettieren.
11. Filtern Sie die Suspension, die die Zellen enthält, mit einem Zellsieb von 70 μm, um die Ektoderme hinter sich zu lassen.
    HINWEIS: Die Filtration entfernt auch alle unverdauten Gliedmaßenknospen und hinterlässt eine Suspension einzelner Zellen.
12. Nach dem Filtern die Suspension erneut 5-10 Mal pipettieren und bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, dann den Überstand entsorgen.
13. Verwenden Sie 1 ml DMEM-HG, ergänzt mit 10% FBS, um die überschüssige Kollagenase zu waschen. Die Suspension bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
14. Entsorgen Sie das Medium vorsichtig durch Pipettieren und ersetzen Sie es dann durch 1 ml frisches DMEM-HG, ergänzt mit 10% FBS, ohne die Zellen im Boden des Schlauches zu stören.
15. Lassen Sie die Zellen ein kompaktes Pellet (Reaggregieren) bilden, nachdem sie für 1-1,5 h bei 37 ° C in einem Thermoblock inkubiert wurden.
    HINWEIS: Während mesodermale Zellen das Pellet bilden, ist es bequem, die Ektoderme der Gliedmaßen zu erhalten.

3. Erhalt der Ektoderme der Gliedmaßen

1. Wiederholen Sie die Schritte 1-6 aus Abschnitt 2 separat mit den anderen 22 HH-Hühnerembryonen, die ausgewählt wurden, um die Ektoderme zu erhalten.
   HINWEIS: Die Anzahl der Embryonen für diesen Zweck ist proportional zur endgültigen Anzahl der gewünschten RL. Ein Verhältnis von 2:1 Ektodermen-RL ist angemessen.
2. Nachdem Sie die Hinterbeinknospen erhalten haben, verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um sie in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Entfernen Sie überschüssiges 1x PBS und ersetzen Sie es durch 500 μL 0,5% Trypsin in sterilem 1x PBS. Die Mischung für 30 min bei 37 °C in einem Thermoblock inkubieren.
3. Nach der enzymatischen Verdauung die Trypsinlösung, die die Gliedmaßenknospen enthält, in eine sterile Petrischale überführen.
4. Entfernen Sie das überschüssige Trypsin so weit wie möglich mit einer Mikropipette; Überfluten Sie die Petrischale mit eiskalten 1x PBS, ergänzt mit 10% FBS, bis alle Gliedmaßenknospen bedeckt sind.
   HINWEIS: FBS kann durch Pferdeserum ersetzt werden.
5. Identifizieren Sie die Gliedmaßenknospen unter dem Stereomikroskop; Identifizieren Sie das Ektoderm als eine leicht abgelöste transparente Membran von den mesodermalen Zellen der Gliedmaßen (Abbildung 1B).
6. Halten Sie das proximale Ende der Gliedmaßenknospe mit Hilfe einer feinen chirurgischen Pinzette fest, während Sie die Ektodermschicht vorsichtig mit der anderen Pinzette ablösen und trennen.
   HINWEIS: Die Gewinnung der Ektoderme könnte schwierig sein, da mesodermale Zellen verklumpen und an Ektodermen anheften, wodurch sie klebrig werden. Es wird empfohlen, die mesodermalen Zellen ständig zu verwerfen, um nur die Ektoderme in der Petrischale zu erhalten.
7. Pflegen Sie die Ektoderme in eiskalter 1x PBS-10% FBS-Lösung.
   HINWEIS: Ektoderme können bei 4 °C gelagert werden, falls das reaggregierte Mesoderm nicht bereit ist. Es ist jedoch vorzuziehen, die Inkubationszeit des Pellets mit der ektodermalen Gewinnung zu koordinieren.

4. Zusammenstellung mesodermaler Zellen innerhalb der ektodermalen Abdeckung

HINWEIS: Dazu ist es notwendig, die leeren Ektoderme in einer Petrischale mit steriler 1x PBS-10% FBS-Lösung zu haben, die ein gebildetes Pellet aus mesodermalen Zellen enthält.

1. Nachdem das Pellet gebildet wurde (siehe Abschnitt 2), entsorgen Sie ~600 μL des Mediums durch Pipettieren aus dem Rohr.
2. Lösen Sie das Pellet vorsichtig vom Boden mit einer Pipettenspitze und ohne es zu zerschlagen oder zu zerstören.
3. Wenn sich das Pellet vollständig vom Boden des Rohres gelöst hat, drehen Sie das Rohr auf den Kopf, um das Pellet in die Petrischale mit den leeren Ektodermen zu übertragen (Abbildung 1C).
4. Schneiden Sie ein kleines Stück des Pellets mit Hilfe einer feinen chirurgischen Pinzette ab und platzieren Sie es so nah wie möglich am Ektoderm.
5. Als wäre es ein Beutel, öffnen Sie das Ektoderm mit der chirurgischen Pinzette und legen Sie das Stück Pellet so fest wie möglich in die ektodermale Abdeckung. Wiederholen Sie diesen Schritt für beliebig viele RLs (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Schneiden Sie die Stücke des Pellets nacheinander und füllen Sie die Ektoderme, um die 1x PBS-10% FBS-Lösung sauber zu halten. Die Größe des Pellets muss jedem Ektoderm entsprechen.
6. Lassen Sie das Ektoderm und das Mesoderm bei Raumtemperatur zusammen für ~ 30 Minuten heilen und transplantieren Sie sie dann in den Gedächtniswirt. Verwerfen Sie das nicht verwendete Ektoderm und Mesoderm.

5. Transplantation des gefüllten Ektoderms in einen Wirtsembryo
 

HINWEIS: Bevor Sie die Ektoderme transplantieren, ordnen Sie zwei Stereomikroskope nebeneinander auf einer Tischplatte an, eines für die Embryonenmanipulation und RL-Transplantation. Die andere ist für die Aufrechterhaltung der gefüllten Ektoderme bereit, in den Embryo zu übertragen.

1. Wählen Sie die Anzahl der gewünschten Eier, um die gefüllten Ektoderme zu transplantieren.
2. Tippen Sie mit dem Ende einer stumpfen Pinzette auf die Eierschale der 22 HH-Wirtsembryonen, um ein Fenster zu öffnen. Identifizieren Sie die Luftmembran und entfernen Sie sie mit einer feinen chirurgischen Pinzette vollständig.
3. Öffnen Sie die Fruchtblase in der Nähe der Vorderbeine, um die rechte Flanke des Embryos freizulegen. Öffnen Sie nur den Betrag, der zum Ausführen des Vorgangs erforderlich ist.
4. Führen Sie durch die Position der Vordergliedmaßen ein Wundkratzen mit einer Wolframnadel (siehe Materialtabelle) bis zur Länge von 2-3 Somiten durch und beschädigen Sie das Mesoderm leicht, bis es blutet.
5. Übertragen Sie einzeln ein gefülltes Ektoderm (RL) in den Kükenembryo und legen Sie die Basis der rekombinanten Extremität über die Somitwunde.
   HINWEIS: Der RL-Transfer kann mit einer Kunststoffpipette oder mit einem abgewinkelten Schlitzmesser erfolgen.
6. Befestigen Sie die RL korrekt mit zwei Stück Palladiumdraht mit einem Durchmesser von 0,025 mm und einer Länge von 0,5-1 mm (siehe Materialtabelle). Richten Sie die Basis des RL mit der Wunde aus, um sicherzustellen, dass sie an der Flanke des Wirtsembryos befestigt und vaskularisiert wird (Abbildung 1E).
7. Versiegeln Sie das Fenster mit Klebeband und bringen Sie das Ei in den Inkubator zurück. Sammeln Sie die Embryonen zu den gewünschten Zeitpunkten für die Analyse.

Ergebnisse

Erkennen einer gut funktionierenden rekombinanten Extremität
Nach der Transplantation wurden die manipulierten Embryonen in den Inkubator zurückgebracht, damit sich die RL entwickeln konnte. Die Inkubationszeit korrelierte mit den Anforderungen des Experiments. Dennoch kann die RL nach 12 h Implantation leicht unterschieden werden. Um festzustellen, ob die Implantation ausreichend war, wurde die RL als Protuberanzung beobachtet, die sicher an der mesodermalen Wand des Spenderembryos befestigt war (<...

Diskussion

Im Allgemeinen kann das RL-Protokoll in fünf Schritte unterteilt werden: (1) Embryoneninkubation, (2) Gewinnung von Mesodermalzellen der Gliedmaßen zur Füllung der Ektoderme, (3) Gewinnung der Ektoderme, (4) Zusammenstellung mesodermaler Zellen in den ektodermalen Hüllen und (5) Transplantation der gefüllten Ektoderme in die Wirtsembryonen. Die Haupteinschränkung der RL-Technik ist das lange, detaillierte Protokoll, das viele kritische Punkte enthält, die Geduld erfordern, um angemessen zu funktionieren. Um das Pr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01