Test des membres recombinants du poulet pour comprendre la morphogenèse, la modelation et les premières étapes de la différenciation cellulaire

Résumé

Les membres recombinants sont un modèle expérimental puissant qui permet d’étudier le processus de différenciation cellulaire et la génération de motifs sous l’influence de signaux embryonnaires. Ce protocole présente une méthode détaillée pour générer des membres recombinants avec des cellules mésodermiques de membres de poulet, adaptables à d’autres types de cellules obtenues à partir de différents organismes.

Résumé

La différenciation cellulaire est le processus affiné de l’engagement cellulaire conduisant à la formation de différents types de cellules spécialisées lors de l’établissement de tissus et d’organes en développement. Ce processus est activement maintenu à l’âge adulte. La différenciation cellulaire est un processus continu au cours du développement et de l’homéostasie des organes. Comprendre les premières étapes de la différenciation cellulaire est essentiel pour connaître d’autres processus complexes tels que la morphogenèse. Ainsi, les membres de poulet recombinants sont un modèle expérimental qui permet d’étudier la différenciation cellulaire et la génération de motifs sous des signaux de motifs embryonnaires. Ce modèle expérimental imite un environnement in vivo ; il assemble des cellules réagrégées en une couverture ectodermique obtenue à partir d’un bourgeon de membre précoce. Plus tard, les ectodermes sont transférés et implantés dans un récepteur embryonnaire de poussin pour permettre son développement. Ce test a été principalement utilisé pour évaluer les cellules des bourgeons des membres mésodermiques; cependant, il peut être appliqué à d’autres cellules souches ou progénitrices d’autres organismes.

Introduction

Le membre vertébré est un formidable modèle pour étudier la différenciation cellulaire, la prolifération cellulaire, la mort cellulaire, la formation de motifs et la morphogenèse ^1,2. Au cours du développement, les membres émergent sous forme de renflements des cellules dérivées du mésoderme à plaque latérale¹. Les bourgeons des membres sont constitués d’un noyau central de cellules mésodermiques recouvertes d’un ectoderme. De cette structure précoce, un membre entier et bien formé émerge. Après l’apparition du bourgeon du membre, trois axes sont reconnus: (1) l’axe proximo-distal ([] épaule aux doigts), (2) l’axe dorso-ventral ([DV] de l’arrière de la main à la paume), et (3) l’avant-postérieur ([AP] pouce à doigt). L’axe proximal-distal dépend de la crête ectodermique apicale (AER), ectoderme spécialisé situé à l’extrémité distale du bourgeon du membre. L’AER est nécessaire pour l’excroissance, le maintien de la survie, la prolifération et l’état indifférencié des cellules recevant des signaux ^2,3. D’autre part, la zone d’activité polarisante (ZPA) contrôle le motif antéropostérieur⁴, tandis que le motif dorsal et ectoderme contrôle le motif dorsoventral ^7,8. L’intégration de motifs tridimensionnels implique une diaphonie complexe entre ces trois axes⁵. Malgré la compréhension de la voie moléculaire au cours du développement des membres, les questions ouvertes sur les mécanismes qui contrôlent la structure et l’excroissance appropriée pour former un membre entier restent sans réponse.

Edgar Zwilling a développé le système des membres recombinants (RL) en 1964 pour étudier les interactions entre les cellules mésenchymateuses des membres et l’ectoderme dans les membres en développement⁶. Le système RL assemble le mésoderme dissocié-réagrégé du bourgeon du membre dans l’ectoderme embryonnaire du membre pour le greffer dans la partie dorsale d’un embryon de poussin donneur. Les signaux fournis par l’ectoderme induisent l’expression de gènes de différenciation et de gènes de modelage de manière spatio-temporelle, induisant ainsi la formation d’une structure semblable à un membre qui peut récapituler les programmes cellulaires qui se produisent pendant le développement du membre ^7,8,9.

Le modèle RL est précieux pour comprendre les propriétés des composants des membres et l’interaction entre les cellules mésodermiques et ectodermiques⁶. Un RL peut être défini comme une structure semblable à un membre créée par l’assemblage ou la recombinaison expérimentale de cellules mésodermiques de bourgeons de membres à l’intérieur d’une couverture ectodermique⁶. La morphogenèse du RL dépend des caractéristiques des cellules mésodermiques (ou d’autres types) qui répondront aux signaux de modelage ectodermique. L’un des avantages de ce système expérimental est sa polyvalence. Cette caractéristique permet la création de multiples combinaisons en faisant varier la source des cellules mésodermiques, telles que des cellules de différents stades de développement, de différentes positions le long du membre, ou des cellules entières (non dissociées) ou réagrégées 7,8,9,10. Un autre exemple est la capacité d’obtenir l’ectoderme embryonnaire d’espèces autres que le poulet, par exemple, la tortue¹¹, la caille ou la souris¹².

En ce sens, la technique RL aide à étudier le développement des membres et les interactions entre les cellules mésenchymateuses et ectodermiques des membres d’un point de vue évolutif. Cette technique a également un grand potentiel pour analyser la capacité de différentes sources de cellules progénitrices à se différencier en une structure semblable à un membre en tirant parti des signaux fournis par l’ectoderme embryonnaire 12,13,14. Contrairement aux cultures in vitro, le RL permet d’évaluer la différenciation et le potentiel morphogénétique d’une population cellulaire en interprétant les signaux embryonnaires d’un membre en développement ^9,15.

Dans ce protocole, un guide étape par étape pour effectuer une RL réussie avec des cellules de bourgeons de membres mésodermiques réagrégés est fourni, ouvrant ainsi la possibilité d’adapter ce protocole avec différentes sources de cellules réagrégées ou même différentes sources d’ectodermes.

Protocole

Cette recherche a été examinée et approuvée par le Comité d’examen institutionnel pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico, Mexique). Un organigramme schématique des étapes générales de ce protocole est illustré à la figure 1A.

1. Incubation embryonnaire et détermination de la viabilité

1. Incuber des œufs de poule fécondés à 38 °C et 60 % d’humidité relative pendant environ trois jours et demi jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de 22 HH (selon Hamilton et Hamburger, 1951)¹⁶.
   REMARQUE: Les œufs de poule fraîchement fécondés peuvent être conservés à 15 ° C jusqu’à une semaine.
   1. Pour incuber les œufs fécondés, placez les œufs verticalement avec le côté pointu vers le bas dans l’incubateur humidifié. Faites pivoter les œufs pendant l’incubation car il est nécessaire d’empêcher l’embryon en développement d’adhérer à la membrane de la coquille.
      REMARQUE: Les œufs de poule fécondés peuvent être obtenus dans les fermes locales. Les œufs de poule fertilisés à Livourne blanche sont généralement utilisés pour éviter la pigmentation des plumes chez les embryons tardifs. Envisagez d’incuber suffisamment d’ovules séparément pour obtenir trois structures: (1) les cellules mésodermiques des membres, (2) les ectodermes des membres et (3) les embryons de donneurs pour greffer le RL.
2. Après trois jours et demi d’incubation, retirez les œufs de l’incubateur, écouvillonnez avec 70% d’éthanol et laissez sécher à l’air.
3. Identifier les embryons en développement qui candent l’œuf pour observer les vaisseaux sanguins et localiser l’embryon. Jetez les œufs qui n’ont pas d’embryon.
   REMARQUE: À ce stade, distribuez les œufs pour obtenir des cellules mésodermiques, des ectodermes et les hôtes du RL.

2. Obtention de cellules mésodermiques des membres pour remplir les ectodermes

REMARQUE: Avant d’initier les manipulations, il est fortement recommandé de désinfecter la zone de travail, les microscopes et tous les instrumentaux en écouvillonnant avec une solution d’éthanol à 70%.

1. Tapotez l’extrémité émoussée de la coquille d’œuf avec l’extrémité d’une pince émoussée pour ouvrir une fenêtre et retirez environ 1 cm x 1 cm de la coquille à l’aide de la pince.
2. Transférez les œufs dans un support en plastique ou en carton et placez-les un par un sous le stéréomicroscope. Identifiez la membrane d’air, puis retirez-la en choisissant un petit trou où aucun vaisseau n’est trouvé. Tirez cette zone à l’aide de pinces chirurgicales fines.
   REMARQUE: La membrane d’air peut être identifiée comme la membrane blanche et opaque observée immédiatement après le fenêtrage de l’œuf.
   1. Retirez tout petit morceau de coquille d’œuf qui pourrait entrer en contact avec l’embryon.
      REMARQUE: Vérifiez que les embryons sont au stade 22 HH avant d’initier le protocole. Les embryons à un stade précoce peuvent être renvoyés à l’incubateur après avoir scellé la fenêtre de la coquille d’œuf avec du ruban adhésif.
3. Ouvrez complètement le sac amniotique en déchirant l’amnion à l’aide de la pince chirurgicale fine (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE: L’amnion peut être identifié comme une membrane transparente qui recouvre étroitement l’embryon et est remplie de liquide amniotique.
4. Retirez soigneusement l’embryon de l’œuf à l’aide d’une paire de pinces contondantes, puis transférez-le dans une boîte de Petri stérile contenant une solution saline tamponnée au phosphate glacée (1x PBS). Répétez cette étape pour les œufs restants. Considérez que seulement ~ 8-10 embryons sont suffisants pour obtenir les cellules mésodermiques.
5. Lavez les embryons une fois dans 1x PBS glacé et, à l’aide d’un stéréomicroscope (voir tableau des matériaux), retirez toutes les membranes restantes. Localisez les bourgeons des membres postérieurs.
   REMARQUE: Les bourgeons des membres sont des structures arrondies situées le long de l’axe antérieur-postérieur de l’embryon sous forme de protubérances du flanc. Les membres postérieurs sont situés plus postérieurement que les membres antérieurs.
6. Maintenez les embryons dans un PBS propre 1x et, à l’aide d’une paire de pinces chirurgicales fines, coupez chaque bourgeon des membres postérieurs longitudinalement. Coupez le bourgeon très près du flanc de l’embryon pour disséquer tous les bourgeons des membres postérieurs. Répétez cette étape avec les embryons restants.
7. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour transférer les bourgeons des membres dans un tube de microcentrifugation vide de 1,5 mL.
8. Utilisez une pointe de pipette pour éliminer tout excès de 1x PBS et remplacez PBS par 500 μL de solution de trypsine à 0,5% (voir tableau des matériaux). Incuber les bourgeons des membres dans un thermobloc pendant 7 min à 37 °C.
9. Retirer la solution de trypsine et la remplacer par 500 μL de collagénase de type IV à 2 mg/mL dans la solution saline équilibrée de Hanks (voir tableau des matériaux), puis l’incuber dans un thermobloc à 37 °C pendant 8 min.
   REMARQUE: L’incubation de la trypsine détache légèrement les ectodermes, tandis que la collagénase désagrége les cellules mésodermiques.
10. Après l’incubation, retirez autant de collagénase que possible et remplacez-la par 1 mL de milieu froid Delbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG) complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) pour inactiver les enzymes. Pipettez le mélange doucement ~ 10 fois.
11. Filtrer la suspension contenant les cellules avec une passoire cellulaire de 70 μm pour laisser derrière elle les ectodermes.
    REMARQUE: La filtration enlèvera également tous les bourgeons de membres non digérés, laissant derrière eux une suspension de cellules uniques.
12. Après filtrage, pipettez à nouveau la suspension 5 à 10 fois et centrifugez à 200 x g pendant 5 minutes à température ambiante, puis jetez le surnageant.
13. Utilisez 1 ml de DMEM-HG complété par 10% de FBS pour laver l’excès de collagénase. Centrifuger la suspension à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
14. Jeter soigneusement le milieu par pipetage puis le remplacer par 1 mL de DMEM-HG frais complété par 10% de FBS sans perturber les cellules dans le fond du tube.
15. Permettre aux cellules de former une pastille compacte (réagréger) après les avoir incubées pendant 1-1,5 h à 37 °C dans un thermobloc.
    REMARQUE: Pendant que les cellules mésodermiques forment la pastille, il est pratique d’obtenir les ectodermes des membres.

3. Obtention des ectodermes des membres

1. Répétez les étapes 1 à 6 de la rubrique 2 séparément avec les 22 autres embryons de poulet HH choisis pour obtenir les ectodermes.
   NOTE: Le nombre d’embryons à cet effet est proportionnel au nombre final du RL souhaité. Un rapport de 2:1 ectodermes-RL est approprié.
2. Après avoir obtenu les bourgeons des membres postérieurs, utilisez une pipette en plastique pour les transférer dans un tube de microcentrifugation vide. Retirez tout excès de 1x PBS et remplacez-le par 500 μL de trypsine à 0,5% dans du PBS stérile 1x. Incuber le mélange pendant 30 min à 37 °C dans un thermobloc.
3. Après la digestion enzymatique, transférer la solution de trypsine contenant les bourgeons des membres dans une boîte de Petri stérile.
4. Enlevez l’excès de trypsine autant que possible à l’aide d’une micropipette; inonder la boîte de Petri avec 1x PBS glacé complété par 10% de FBS jusqu’à ce que tous les bourgeons des membres soient couverts.
   REMARQUE: FBS peut être substitué au sérum de cheval.
5. Identifier les bourgeons des membres sous le stéréomicroscope; identifier l’ectoderme comme une membrane transparente légèrement détachée des cellules mésodermiques des membres (figure 1B).
6. Tenez l’extrémité la plus proximale du bourgeon du membre à l’aide d’une pince chirurgicale fine tout en détachant soigneusement et en séparant la couche d’ectoderme à l’aide des autres pinces.
   REMARQUE: L’obtention des ectodermes pourrait être difficile en raison de l’agglutination des cellules mésodermiques et de leur fixation aux ectodermes, les rendant ainsi collants. Il est recommandé de jeter constamment les cellules mésodermiques pour ne maintenir que les ectodermes dans la boîte de Pétri.
7. Maintenir les ectodermes dans une solution glacée de 1x PBS-10% FBS.
   REMARQUE: Les ectodermes peuvent être conservés à 4 ° C au cas où le mésoderme réagrégé n’est pas prêt. Cependant, il est préférable de coordonner le temps d’incubation de la pastille avec l’obtention ectodermique.

4. Assemblage des cellules mésodermiques à l’intérieur de la couverture ectodermique

REMARQUE: Pour cela, il est nécessaire d’avoir les ectodermes vides dans une boîte de Petri avec une solution stérile de 1x PBS-10% FBS contenant une pastille formée de cellules mésodermiques.

1. Une fois la pastille formée (voir rubrique 2), jeter ~600 μL du milieu du tube par pipetage.
2. Détachez soigneusement la pastille du fond à l’aide d’une pointe de pipette et sans la briser ou la détruire.
3. Lorsque la pastille est complètement détachée du fond du tube, tournez le tube à l’envers pour transférer la pastille dans la boîte de Pétri contenant les ectodermes vides (Figure 1C).
4. Coupez un petit morceau de la pastille à l’aide d’une paire de pinces chirurgicales fines et placez-le aussi près que possible de l’ectoderme.
5. Comme s’il s’agissait d’un sac, ouvrez l’ectoderme avec la pince chirurgicale et placez le morceau de granulé aussi étroitement que possible dans la couverture ectodermique. Répétez cette étape pour autant de RI que souhaité (Figure 1D).
   REMARQUE: Coupez les morceaux de la pastille un par un et remplissez les ectodermes pour maintenir propre la solution 1x PBS-10% FBS. La taille de la pastille doit correspondre à chaque ectoderme.
6. Laissez l’ectoderme et le mésoderme guérir ensemble pendant environ 30 minutes à température ambiante, puis greffez-les dans l’hôte embryonnaire. Jetez l’ectoderme et le mésoderme inutilisés.

5. Transplantation de l’ectoderme rempli dans un embryon hôte
 

REMARQUE: Avant de transplanter les ectodermes, disposez deux stéréomicroscopes l’un à côté de l’autre sur une paillasse, l’un pour la manipulation d’embryons et la greffe de LR. L’autre est pour maintenir les ectodermes remplis prêts à être transférés dans l’embryon.

1. Sélectionnez le nombre d’ovules souhaités pour greffer les ectodermes remplis.
2. À l’aide de l’extrémité d’une pince émoussée, tapotez la coquille d’œuf des 22 embryons hôtes HH pour ouvrir une fenêtre. Identifiez la membrane d’air et, à l’aide d’une paire de pinces chirurgicales fines, retirez-la complètement.
3. Ouvrez le sac amniotique près du membre antérieur pour exposer le flanc droit de l’embryon. Ouvrez uniquement la quantité nécessaire pour accomplir la procédure.
4. Guidé par la position du membre antérieur, effectuez le grattage de la plaie avec une aiguille en tungstène (voir tableau des matériaux) à la longueur de 2-3 somites, endommageant légèrement le mésoderme jusqu’à ce qu’il saigne.
5. Transférer individuellement un ectoderme rempli (RL) dans l’embryon de poussin et placer la base du membre recombinant sur la plaie de somite.
   REMARQUE: Le transfert RL peut être effectué avec une pipette en plastique ou avec un couteau à fente inclinée.
6. Fixez correctement le RL avec deux morceaux de fil de palladium de 0,025 mm de diamètre et de 0,5 à 1 mm de longueur (voir tableau des matériaux). Aligner la base du LR avec la plaie pour s’assurer qu’elle sera attachée au flanc de l’embryon hôte et vascularisée (Figure 1E).
7. Scellez la fenêtre avec du ruban adhésif et retournez l’œuf à l’incubateur. Recueillir les embryons aux moments souhaités pour l’analyse.

Résultats

Reconnaître un membre recombinant bien performant
Après la greffe, les embryons manipulés ont été renvoyés dans l’incubateur pour permettre au RL de se développer. Le temps d’incubation était en corrélation avec les exigences de l’expérience. Néanmoins, le RL peut être facilement distingué après 12 h d’implantation. Pour déterminer si l’implantation était adéquate, le LR a été observé comme une protubérance solidement fixée à la paroi mésodermique de l’embryon donne...

Discussion

En général, le protocole RL peut être divisé en cinq étapes: (1) l’incubation d’embryons, (2) l’obtention de cellules mésodermiques de membres pour remplir les ectodermes, (3) l’obtention des ectodermes, (4) l’assemblage de cellules mésodermiques à l’intérieur des couvertures ectodermiques, et (5) la transplantation des ectodermes remplis dans les embryons hôtes. La principale limite de la technique RL est le protocole long et détaillé, qui comporte de nombreux points critiques qui nécessitent de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01