치킨 재조합 사지 분석은 모르포겐, 패터닝 및 세포 분화의 초기 단계를 이해하기 위한

요약

재조합 팔다리는 배아 신호의 영향으로 세포 분화 과정과 패턴 생성을 연구 할 수있는 강력한 실험 모델입니다. 이 프로토콜은 상이한 유기체로부터 수득된 다른 세포 유형에 적응할 수 있는 닭 사지-중배엽 세포로 재조합 사지를 생성하는 상세한 방법을 제시한다.

초록

세포 분화는 조직 및 장기 발달 동안 다양한 특수 세포 유형의 형성으로 이어지는 세포 투입의 미세 조정 과정입니다. 이 과정은 성인기에 적극적으로 유지됩니다. 세포 분화는 장기의 발달 및 항상성 동안 진행중인 과정입니다. 세포 분화의 초기 단계를 이해하는 것은 형태 형성과 같은 다른 복잡한 과정을 아는 데 필수적입니다. 따라서, 재조합 닭 팔다리는 배아 패터닝 신호 하에서 세포 분화 및 패턴 생성의 연구를 허용하는 실험 모델이다. 이 실험 모델은 생체내 환경을 모방하고; 그것은 초기 사지 새싹에서 얻은 외배엽 덮개로 재결합 된 세포를 조립합니다. 나중에, 외배엽은 병아리 배아 수용체에 옮겨지고 이식되어 발달을 허용합니다. 이 분석은 주로 중배엽 사지 새싹 세포를 평가하기 위해 사용되었다; 그러나, 다른 줄기 또는 다른 유기체로부터의 전구 세포에 적용될 수 있다.

서문

척추동물 사지는 세포 분화, 세포 증식, 세포 사멸, 패턴 형성 및 형태형성 ^1,2를 연구하기 위한 강력한 모델이다. 발달 동안, 팔다리는 측방 플레이트 중배엽¹에서 유래 된 세포로부터 팽창으로 나타난다. 사지 새싹은 외배엽으로 덮인 중배엽 세포의 중심 코어로 구성됩니다. 이 초기 구조에서 전체적으로 잘 형성된 팔다리가 나타납니다. 사지 새싹이 발생한 후, (1) 근위 원위 축 ([PD] 어깨에서 손가락까지), (2) 등 - 복부 축 ([DV]손등에서 손바닥까지), (3) 전방 - 후부 ([AP] 엄지 손가락에서 손가락까지)의 세 축이 인식됩니다. 근위 - 원위 축은 사지 새싹의 원위 끝에 위치한 정점 외배엽 능선 (AER)에 달려 있습니다. AER은 신호^2,3을 수신하는 세포의 성장, 생존 유지^, 증식 및 미분화 상태에 요구된다. 한편, 편광 활동 영역(ZPA)은 전후 패터닝(⁴)을 제어하고, 등쪽 및 외배엽은 등쪽 패터닝^(7,8)을 제어한다. 입체 패터닝의 통합은 이 세 축 사이의 복잡한 누화를 의미한다⁵. 사지 발달 중 분자 경로를 이해했음에도 불구하고, 전체 사지를 형성하기 위해 패턴화와 적절한 성장을 조절하는 메커니즘에 대한 열린 질문은 여전히 답이 없습니다.

Edgar Zwilling 는 1964 년에 재조합 사지 (RL) 시스템을 개발하여 사지 중간엽 세포와 외배엽 사이의 상호 작용을 연구했습니다⁶. RL 시스템은 해리된 재응집된 사지 새싹 중배엽을 배아 사지 외배엽으로 조립하여 공여체 병아리 배아의 등쪽 부분으로 이식한다. 외배엽에 의해 제공되는 신호는 시공간 방식으로 분화 유전자 및 패터닝 유전자의 발현을 유도하고, 따라서 사지 발달 동안 발생하는 세포 프로그램을 재편성할 수 있는 사지 유사 구조의 형성을 유도한다 ^7,8,9.

RL 모델은 사지 성분의 특성과 중배엽 및 외배엽 세포 사이의 상호작용을 이해하는데^{가치가 있다6}. RL은 외배엽 커버⁽⁶) 내부의 사지 새싹 중배엽 세포를 실험적으로 조립 또는 재결합함으로써 생성된 사지 유사 구조로서 정의될 수 있다. RL의 형태형성은 외배엽 패터닝 신호에 반응할 중배엽 세포(또는 다른 유형)의 특성에 의존한다. 이 실험 시스템의 장점 중 하나는 다재다능하다는 것입니다. 이 특성은 중배엽 세포의 공급원, 예를 들어 다른 발달 단계의 세포, 사지를 따라 다른 위치에서, 또는 전체 (해리되지 않은) 또는 재응집 된 세포 ^7,8,9,10을 변화시킴으로써 다중 조합의 생성을 허용한다. 또 다른 예는 닭 이외의 종, 예를 들어, 거북이¹¹, 메추라기, 또는 마우스¹²로부터 배아 외배엽을 수득하는 능력이다.

이러한 의미에서, RL 기술은 진화론적 관점에서 사지 발달과 사지 중간엽과 외배엽 세포 사이의 상호작용을 연구하는 데 도움이 된다. 이 기술은 또한 배아 외배엽^12,13,14에 의해 제공된 신호를 이용함으로써 사지 유사 구조로 분화하는 선조 세포의 상이한 공급원의 능력을 분석하는 데 큰 잠재력을 갖는다. 시험관내 배양과는 달리, RL은 발달하는 사지(^9,15)로부터의 배아 신호를 해석함으로써 세포 집단의 분화 및 형태형성 잠재력을 평가할 수 있게 한다.

이 프로토콜에서, 재응집된 중배엽 사지 새싹 세포와 함께 성공적인 RL을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제공되고, 따라서 재응집된 세포의 상이한 공급원 또는 심지어 상이한 외배엽 공급원과 함께 이 프로토콜을 적응시킬 수 있는 가능성을 열어준다.

프로토콜

이 연구는 Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico)의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 기관 검토위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 이 프로토콜의 일반적인 단계에 대한 개략적인 순서도가 그림 1A에 나와 있습니다.

1. 배아 배양 및 생존력 결정

1. 수정 된 닭 알을 22 HH 단계에 도달 할 때까지 약 38 ° C 및 60 % 상대 습도에서 약 3 일 반 동안 배양하십시오 (Hamilton and Hamburger, 1951에 따르면)¹⁶.
   참고 : 갓 수정 된 닭고기 달걀은 최대 일주일 동안 15 ° C에서 보관할 수 있습니다.
   1. 수정 된 난자를 배양하려면 뾰족한면을 가습 인큐베이터에 수직으로 놓습니다. 발달하는 배아가 껍질 막에 달라 붙는 것을 막을 필요가 있으므로 배양 중에 알을 회전시킵니다.
      참고 : 수정 된 암탉 알은 지역 농장에서 얻을 수 있습니다. 수정 된 화이트 레그혼 닭 알은 일반적으로 후기 배아에서 깃털의 색소 침착을 피하기 위해 사용됩니다. (1) 사지 중배엽 세포, (2) 사지 외배엽 및 (3) RL을 이식하기 위해 공여체 배아의 세 가지 구조를 얻기 위해 충분한 난자를 별도로 배양하는 것을 고려하십시오.
2. 배양 후 삼 일 반 후에 인큐베이터에서 알을 제거하고 70 % 에탄올로 면봉하고 공기 건조시킵니다.
3. 발달중인 배아가 난자를 움켜쥐고 혈관을 관찰하고 배아를 찾습니다. 배아가없는 난자는 버리십시오.
   참고 :이 시점에서 알을 분배하여 중배엽 세포, 외배엽 및 RL에 대한 숙주를 얻습니다.

2. 외배엽을 채우기 위해 사지 중배엽 세포 얻기

참고 : 조작을 시작하기 전에 작업 영역, 현미경 및 모든 도구를 70 % 에탄올 용액으로 면도하여 소독하는 것이 좋습니다.

1. 무딘 포셉의 끝으로 달걀 껍질의 무딘 끝을 탭하여 창을 열고 포셉을 사용하여 약 1cm x 1cm의 껍질을 제거하십시오.
2. 계란을 플라스틱 또는 판지 홀더로 옮기고 스테레오 현미경 아래에 하나씩 놓습니다. 공기 막을 확인한 다음 혈관이 발견되지 않는 작은 구멍을 선택하여 제거하십시오. 미세한 수술 포셉의 도움으로이 부위를 당기십시오.
   참고 : 공기 막은 달걀을 창으로 만든 직후에 관찰 된 흰색과 불투명 한 막으로 식별 할 수 있습니다.
   1. 배아와 접촉 할 수있는 작은 달걀 껍질 조각을 제거하십시오.
      참고: 프로토콜을 시작하기 전에 배아가 22 HH 단계에 있는지 확인하십시오. 초기 단계의 배아는 달걀 껍질 창을 테이프로 밀봉 한 후 인큐베이터로 되돌릴 수 있습니다.
3. 미세한 수술 포셉을 사용하여 양수를 찢어서 양수 낭을 완전히 엽니 다( 자료 표 참조).
   참고 : 양수는 배아를 밀접하게 덮고 양수로 채워진 투명한 막으로 식별 될 수 있습니다.
4. 한 쌍의 무딘 포셉을 사용하여 난자로부터 배아를 조심스럽게 제거한 다음 빙냉 인산염 완충 식염수 용액 (1x PBS)이 들어있는 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 나머지 계란에 대해이 단계를 반복하십시오. ~ 8-10 개의 배아 만이 중배엽 세포를 얻기에 충분하다고 생각하십시오.
5. 배아를 빙냉 1x PBS로 한 번 세척하고, 입체 현미경 ( 표 참조)의 도움으로 남아있는 막을 철회하십시오. 뒷다리 새싹을 찾으십시오.
   참고 : 사지 새싹은 옆구리에서 돌출부로 배아의 전후 축을 따라 위치한 둥근 구조입니다. 뒷다리는 앞다리보다 뒤쪽에 더 많이 위치합니다.
6. 배아를 깨끗한 1x PBS로 유지하고, 한 쌍의 미세한 수술 포셉을 사용하여, 각 뒷다리 새싹을 세로로 저격한다. 배아의 옆구리에 매우 가깝게 새싹을 잘라 전체 뒷다리 새싹을 해부하십시오. 나머지 배아와 함께이 단계를 반복하십시오.
7. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 사지 새싹을 빈 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
8. 피펫 팁을 사용하여 1x PBS의 과량을 제거하고 PBS를 500 μL의 0.5% 트립신 용액으로 대체 한다(표 참조). 사지 새싹을 37°C에서 7분 동안 열블록으로 인큐베이션한다.
9. 트립신 용액을 제거하고 행크스 밸런스드 소금 용액 ( 재료 표 참조)에서 2 mg / mL의 콜라게나제 유형 IV 500 μL로 교체 한 다음 37 °C의 온도 블록에서 8 분 동안 배양하십시오.
   참고: 트립신 인큐베이션은 외배엽을 약간 분리하는 반면, 콜라게나제는 중배엽 세포를 분해합니다.
10. 배양 후, 가능한 한 많은 콜라게나제를 제거하고 10% 우태아 혈청(FBS)이 보충된 차가운 둘베코 변형 이글 배지(DMEM-HG) 배지 1mL로 교체하여 효소를 불활성화시킨다. 혼합물을 부드럽게 ~ 10 번 피펫하십시오.
11. 세포를 함유하는 현탁액을 70 μm의 세포 스트레이너로 여과하여 외배엽을 남긴다.
    참고 : 여과는 소화되지 않은 사지 새싹을 제거하여 단일 세포의 현탁액을 남깁니다.
12. 여과 후, 현탁액을 다시 5-10회 피펫하고, 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한 다음, 상층액을 버린다.
13. 10% FBS가 보충된 DMEM-HG 1ml를 사용하여 과량의 콜라게나제를 세척하십시오. 현탁액을 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.
14. 피펫팅으로 배지를 조심스럽게 버린 다음 튜브 바닥의 세포를 방해하지 않고 10% FBS가 보충된 신선한 DMEM-HG 1mL로 교체합니다.
15. 세포가 열블록 중에서 37°C에서 1-1.5시간 동안 인큐베이션한 후 조밀한 펠릿(재응집)을 형성하도록 허용한다.
    참고 : 중배엽 세포가 펠렛을 형성하는 동안, 사지 외배엽을 얻는 것이 편리합니다.

3. 사지 외배엽 얻기

1. 외배엽을 얻기 위해 선택된 다른 22개의 HH 닭 배아와 별도로 섹션 2의 1-6단계를 반복한다.
   참고: 이 목적을 위한 배아의 수는 원하는 RL의 최종 수에 비례합니다. 2:1 외배엽-RL의 비율이 적절하다.
2. 뒷다리 새싹을 얻은 후 플라스틱 피펫을 사용하여 빈 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 임의의 과량의 1x PBS를 제거하고 멸균된 1x PBS 중의 0.5% 트립신 500 μL로 교체한다. 상기 혼합물을 37°C에서 30분 동안 열블록으로 인큐베이션한다.
3. 효소 소화 후, 사지 새싹이 들어있는 트립신 용액을 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.
4. 마이크로피펫을 사용하여 과량의 트립신을 가능한 한 많이 제거하고; 모든 사지 새싹이 덮일 때까지 FBS의 10 %가 보충 된 얼음처럼 차가운 1x PBS로 페트리 접시에 홍수를 일으 킵니다.
   참고 : FBS는 말 혈청을 대체 할 수 있습니다.
5. 입체 현미경으로 사지 새싹을 확인; 외배엽을 사지 중배엽 세포로부터 약간 분리된 투명한 막으로 확인한다(도 1B).
6. 미세한 수술 포셉의 도움으로 사지 새싹의 가장 근위 끝을 잡고 조심스럽게 다른 포셉을 사용하여 외배엽 층을 분리하고 분리하십시오.
   참고 : 외배엽을 얻는 것은 중배엽 세포가 뭉쳐서 외배엽에 부착되어 끈적 거리기 때문에 어려울 수 있습니다. 페트리 접시의 외배엽 만 유지하기 위해 중배엽 세포를 지속적으로 버리는 것이 좋습니다.
7. 외배엽을 얼음처럼 차가운 1x PBS-10% FBS 용액으로 유지하십시오.
   참고: 외배엽은 재응집된 중배엽이 준비되지 않은 경우 4°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나, 펠렛의 인큐베이션 시간을 외배엽 수득과 함께 조정하는 것이 바람직하다.

4. 외배엽 덮개 안쪽에 중배엽 세포 조립

참고 : 이를 위해서는 중배엽 세포의 형성된 펠렛을 포함하는 멸균 된 1x PBS-10 % FBS 용액이있는 페트리 접시에 빈 외배엽이 있어야합니다.

1. 펠렛이 형성된 후(섹션 2 참조), 피펫팅에 의해 튜브로부터 ∼600 μL의 배지를 버린다.
2. 피펫 팁을 사용하여 펠렛을 바닥에서 조심스럽게 분리하고 부수거나 파괴하지 마십시오.
3. 펠릿이 튜브 바닥에서 완전히 분리되면 튜브를 거꾸로 돌려 펠렛을 빈 외배엽이 들어있는 페트리 접시로 옮깁니다 (그림 1C).
4. 한 쌍의 미세 수술 포셉의 도움으로 펠렛의 작은 조각을 자르고 외배엽에 가능한 한 가깝게 놓습니다.
5. 가방 인 것처럼 외과 용 포셉으로 외배엽을 열고 펠릿 조각을 외피 덮개에 가능한 한 단단히 넣으십시오. 원하는 만큼 많은 RL에 대해 이 단계를 반복합니다(그림 1D).
   참고: 펠렛의 조각을 하나씩 자르고, 외배엽을 채워 1x PBS-10% FBS 용액을 깨끗하게 유지한다. 펠릿의 크기는 각 외배엽에 해당해야합니다.
6. 외배엽과 중배엽이 실온에서 ~ 30 분 동안 함께 치유되도록 한 다음 배아 숙주에 이식하십시오. 사용하지 않은 외배엽과 중배엽은 버리십시오.

5. 채워진 외배엽을 숙주 배아에 이식
 

참고 : 외배엽을 이식하기 전에 벤치 탑에서 서로 옆에 두 개의 입체 현미경을 배치하십시오.이 현미경은 배아 조작 및 RL 이식을위한 것입니다. 다른 하나는 채워진 외배엽을 배아로 옮길 준비가되어있는 상태로 유지하기위한 것입니다.

1. 채워진 외배엽을 이식하기 위해 원하는 알의 수를 선택하십시오.
2. 무딘 포셉의 끝을 사용하여 22 HH 숙주 배아의 달걀 껍질을 탭하여 창을 엽니 다. 공기 막을 확인하고 한 쌍의 미세 수술 포셉을 사용하여 완전히 제거하십시오.
3. 앞다리 근처의 양수 낭을 열어 배아의 오른쪽 측면을 노출시킵니다. 절차를 수행하는 데 필요한 금액 만 엽니 다.
4. 앞다리 위치에 따라 텅스텐 바늘 ( 재료 표 참조)으로 상처를 긁어 내고 2-3 개의 somites의 길이로 상처를 긁어 내고 출혈이 생길 때까지 중배엽을 약간 손상시킵니다.
5. 채워진 외배엽 (RL)을 병아리 배아 내로 개별적으로 옮기고 재조합 사지의 기저부를 소마이트 상처 위에 놓습니다.
   참고 : RL 전송은 플라스틱 피펫 또는 각진 슬릿 나이프로 수행 할 수 있습니다.
6. 직경 0.025mm와 길이 0.5-1mm의 팔라듐 와이어 두 개로 RL을 올바르게 고정 합니다(재료 표 참조). RL의 기저부를 상처와 정렬하여 숙주 배아의 옆구리에 부착되고 혈관화되도록 한다(도 1E).
7. 창문을 테이프로 봉인하고 계란을 인큐베이터로 돌려 보내십시오. 분석을 위해 원하는 시점에서 배아를 수집하십시오.

결과

잘 수행 된 재조합 사지를 인식
이식 후, 조작된 배아를 인큐베이터로 복귀시켜 RL이 발달할 수 있도록 하였다. 배양 시간은 실험의 요구 사항과 상관 관계가 있습니다. 그럼에도 불구하고, RL은 이식 12시간 후에 쉽게 구별될 수 있다. 이식이 적절한지 여부를 결정하기 위해, RL을 공여체 배아의 중배엽 벽에 단단히 부착시킨 돌출부로서 관찰하였다(도 2A). 반대?...

토론

일반적으로, RL 프로토콜은 다섯 단계로 나눌 수 있다: (1) 배아 배양, (2) 외배엽을 채우기 위한 사지 중배엽 세포 획득, (3) 외배엽을 얻는 것, (4) 외배엽 덮개 내부에 중배엽 세포를 조립하는 것, 및 (5) 채워진 외배엽을 숙주 배아로 이식하는 것. RL 기술의 주요 한계는 길고 상세한 프로토콜이며, 이는 적절하게 수행하기 위해 인내심이 필요한 많은 중요한 포인트를 가지고 있습니다. 프로토콜을 성?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01