Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular

Resumo

Membros recombinantes são um poderoso modelo experimental que permite estudar o processo de diferenciação celular e a geração de padrões sob a influência de sinais embrionários. Este protocolo apresenta um método detalhado para a geração de membros recombinantes com células mesodérmicas de membros de frango, adaptáveis a outros tipos celulares obtidos de diferentes organismos.

Resumo

A diferenciação celular é o processo afinado de comprometimento celular que leva à formação de diferentes tipos de células especializadas durante o estabelecimento de tecidos e órgãos em desenvolvimento. Esse processo é mantido ativamente na idade adulta. A diferenciação celular é um processo contínuo durante o desenvolvimento e homeostase dos órgãos. Entender os primeiros passos da diferenciação celular é essencial para conhecer outros processos complexos, como a morfogênese. Assim, os membros de frango recombinantes são um modelo experimental que permite o estudo da diferenciação celular e geração de padrões sob sinais de padronização embrionária. Este modelo experimental imita um ambiente in vivo ; ele monta células reaggregadas em uma cobertura ectodérmica obtida a partir de um broto de membro inicial. Posteriormente, os ectodermes são transferidos e implantados em um receptor de embrião de filhotes para permitir seu desenvolvimento. Este ensaio foi usado principalmente para avaliar células mesodérmicas de botões de membros; no entanto, pode ser aplicado a outras células-tronco ou progenitoras de outros organismos.

Introdução

O membro vertebrado é um modelo formidável para estudar diferenciação celular, proliferação celular, morte celular, formação de padrões e morfogênese ^1,2. Durante o desenvolvimento, os membros emergem como protuberâncias das células derivadas do mesoderme de placa lateral¹. Os botões de membros consistem em um núcleo central de células mesodérmicas cobertas por um ectoderme. A partir desta estrutura inicial, um membro inteiro e bem formado emerge. Após a êxito do membro, três eixos são reconhecidos: (1) o eixo proximo-distal ([PD] ombro a dedos), (2) o eixo dorso-ventral ([DV] da parte de trás da mão para a palma) e (3) o anterior-posterior ([AP] polegar para dedo). O eixo proximal-distal depende da crista ectodérmica apical (AER), ectodermia especializada localizada na ponta distal do broto do membro. O AER é necessário para o crescimento, manutenção de sobrevivência, proliferação e o estado indiferenciado das células que recebem sinais ^2,3. Por outro lado, a zona de atividade polarizadora (ZPA) controla a padronização anteroposterior⁴, enquanto a dorsal e o ectoderme controlam a padronização dorsoventral ^7,8. A integração da padronização tridimensional implica um cruzamento complexo entre esses três eixos⁵. Apesar de entender a via molecular durante o desenvolvimento dos membros, perguntas abertas sobre os mecanismos que controlam a padronização e o crescimento adequado para formar um membro inteiro permanecem sem resposta.

Edgar Zwilling desenvolveu o sistema de membro recombinante (RL) em 1964 para estudar as interações entre as células mesenquimais dos membros e o ectoderme no desenvolvimento dos membros⁶. O sistema RL monta o mesoderm de broto de membro dissociado-reaggregado no ectoderm do membro embrionário para enxertá-lo na parte dorsal de um embrião de filhote de doador. Os sinais fornecidos pelo ectoderme induzem a expressão de genes de diferenciação e genes padronizadores de forma espátula-temporal, induzindo assim a formação de uma estrutura semelhante a um membro que pode recapitular os programas celulares que ocorrem durante o desenvolvimento dos membros ^7,8,9.

O modelo RL é valioso para entender as propriedades dos componentes dos membros e a interação entre células mesodérmicas e ectodérmicas⁶. Uma RL pode ser definida como uma estrutura semelhante a membros criada pela montagem experimental ou recombinação de células mesodérmicas de botões de membro dentro de uma cobertura ectodérmica⁶. A morfogênese da RL depende das características das células mesodérmicas (ou outros tipos) que responderão aos sinais de padronização ectodérmica. Uma das vantagens deste sistema experimental é sua versatilidade. Essa característica permite a criação de múltiplas combinações variando a fonte de células mesodérmicas, como células de diferentes estágios de desenvolvimento, de diferentes posições ao longo do membro, ou inteiras (não dissocidas) ou células reaggregadas 7,8,9,10. Outro exemplo é a capacidade de obter o ectoderm embrionário de espécies diferentes do frango, por exemplo, tartaruga¹¹, codorna ou rato¹².

Nesse sentido, a técnica de RL ajuda a estudar o desenvolvimento dos membros e as interações entre células mesenquimais e ectodérmicas de membros do ponto de vista evolutivo. Essa técnica também tem grande potencial para analisar a capacidade de diferentes fontes de células progenitoras de se diferenciar em uma estrutura semelhante a membros, aproveitando os sinais fornecidos pelo ectoderme embrionário 12,13,14. Em contraste com as culturas in vitro, a RL permite avaliar a diferenciação e o potencial morfogenético de uma população celular, interpretando sinais embrionários a partir de um membro em desenvolvimento ^9,15.

Neste protocolo, é fornecido um guia passo-a-passo para a realização de RL bem-sucedida com células de botões mesodérmicos reaggregados, abrindo assim a possibilidade de adaptar este protocolo com diferentes fontes de células reaggregadas ou mesmo diferentes fontes de ectoderme.

Protocolo

Esta pesquisa foi revisada e aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional para o Cuidado e Uso de Animais laboratoriais do Instituto de Investigaciones Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Cidade do México, México). Um fluxograma esquemático das etapas gerais deste protocolo é mostrado na Figura 1A.

1. Incubação de embriões e determinação da viabilidade

1. Incubar ovos de galinha fertilizados a 38 °C e 60% de umidade relativa por cerca de três dias e meio até atingirem a etapa de 22 HH (de acordo com Hamilton e Hamburger, 1951)¹⁶.
   NOTA: Ovos de galinha recém-fertilizados podem ser armazenados a 15 °C por até uma semana.
   1. Para incubar os óvulos fertilizados, coloque os ovos verticalmente com o lado pontudo para baixo na incubadora umidificada. Gire os ovos durante a incubação, pois é necessário evitar que o embrião em desenvolvimento adusca na membrana da casca.
      NOTA: Ovos de galinha fertilizados podem ser obtidos em fazendas locais. Ovos de galinha Leghorn Branco Fertilizado são geralmente usados para evitar a pigmentação das penas em embriões tardios. Considere incubar ovos suficientes separadamente para obter três estruturas: (1) células mesodérmicas de membros, (2) ectodermias de membros e (3) embriões doadores para enxertar a RL.
2. Após três dias e meio de incubação, retire os ovos da incubadora, cotonete com 70% de etanol e deixe secar o ar.
3. Identificar embriões em desenvolvimento candling o ovo para observar os vasos sanguíneos e localizar o embrião. Descarte ovos que não tenham um embrião.
   NOTA: Neste ponto, distribua os ovos para obter células mesodérmicas, ectodermias e os hospedeiros para a RL.

2. Obtenção de células mesodérmicas de membros para preencher ectodermes

NOTA: Antes de iniciar as manipulações, é altamente recomendável desinfetar a área de trabalho, os microscópios e todo o instrumental, limpando com 70% de solução de etanol.

1. Bata na extremidade contundente da casca de ovo com a extremidade de um fórceps contundente para abrir uma janela e remova cerca de 1 cm x 1 cm da casca usando os fórceps.
2. Transfira os ovos para um suporte de plástico ou caixa e coloquei-os um a um sob o estereóscópio. Identifique a membrana de ar e remova-a escolhendo um pequeno buraco onde não são encontrados vasos. Puxe esta área com o auxílio de fórceps cirúrgicos finos.
   NOTA: A membrana de ar pode ser identificada como a membrana branca e opaca observada imediatamente após a janela do ovo.
   1. Remova qualquer pequeno pedaço de casca de ovo que possa entrar em contato com o embrião.
      NOTA: Verifique se os embriões estão no estágio de 22 HH antes de iniciar o protocolo. Embriões em estágios anteriores podem ser devolvidos à incubadora após selar a janela da casca de ovo com fita adesiva.
3. Abra completamente o saco amniótico rasgando o amnion usando os fórceps cirúrgicos finos (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Amnion pode ser identificado como uma membrana transparente que cobre de perto o embrião e é preenchida com fluido amniótico.
4. Remova cuidadosamente o embrião do ovo usando um par de fórceps contundentes e, em seguida, transfira para uma placa de Petri estéril contendo solução salina tamponada com fosfato gelado (1x PBS). Repita este passo para os ovos restantes. Considere que apenas ~8-10 embriões são suficientes para obter as células mesodérmicas.
5. Lave os embriões uma vez no 1x PBS gelado, e com o auxílio de um estereoscópio (ver Tabela de Materiais), retire quaisquer membranas restantes. Localize os botões de subida.
   NOTA: Os botões dos membros são estruturas arredondadas situadas ao longo do eixo anterior-posterior do embrião como saliências do flanco. Os blocos traseiros estão localizados mais posteriormente do que os membros dianteiros.
6. Mantenha os embriões em 1x PBS limpos, e usando um par de fórceps cirúrgicos finos, corte cada broto de pênpeco traseiro longitudinalmente. Corte o botão bem perto do flanco do embrião para dissecar todos os botões de subida. Repita esta etapa com os demais embriões.
7. Use uma pipeta de transferência de plástico para transferir os botões do membro para um tubo vazio de microcentrifuuge de 1,5 mL.
8. Use uma ponta de pipeta para remover qualquer excesso de PBS 1x e substitua o PBS por 500 μL de solução de trippsina de 0,5% (ver Tabela de Materiais). Incubar botões de membro em um termbloco por 7 min a 37 °C.
9. Remova a solução de trippsina e substitua-a por 500 μL de colagenase tipo IV a 2 mg/mL em Hanks Balanced Salt Solution (ver Tabela de Materiais), em seguida, incuba-a em um termbloco a 37 °C por 8 min.
   NOTA: A incubação de trippsina destaca ligeiramente os ectodermes, enquanto a colagenase desagrega células mesodérmicas.
10. Após a incubação, remova o máximo de colagem possível e substitua-a por 1 mL de média de glicose média-alta de Águia Modificada (DMEM-HG) de Dulbecco, suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) para inativar as enzimas. Pipeta a mistura suavemente ~10 vezes.
11. Filtre a suspensão contendo as células com um coador de células de 70 μm para deixar para trás os ectodermes.
    NOTA: A filtragem também removerá quaisquer botões de membro não digdigestos, deixando para trás uma suspensão de células únicas.
12. Após a filtragem, pipete a suspensão novamente 5-10 vezes e centrífuga a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente, em seguida, descarte o sobrenatante.
13. Use 1 ml de DMEM-HG complementado com 10% de FBS para lavar o excesso de colagemnase. Centrifugar a suspensão a 200 x g por 5 min a temperatura ambiente.
14. Descarte o meio cuidadosamente por pipetação e substitua-o por 1 mL de DMEM-HG fresco complementado com 10% de FBS sem perturbar as células na parte inferior do tubo.
15. Deixe as células formarem uma pelota compacta (reagregar) depois de incuba-las por 1-1,5 h a 37 °C em um termbloco.
    NOTA: Enquanto as células mesodérmicas estão formando a pelota, é conveniente obter os ectodermes dos membros.

3. Obtenção dos ectodermes dos membros

1. Repita as etapas 1-6 da seção 2 separadamente com os outros 22 embriões de frango HH escolhidos para obter os ectodermes.
   NOTA: O número de embriões para este fim é proporcional ao número final da RL desejada. Uma razão de 2:1 ectodermes-RL é apropriada.
2. Depois de obter os botões de subida traseira, use uma pipeta de plástico para transferi-los para um tubo de microcentrifuuge vazio. Remova qualquer excesso de 1x PBS e substitua-o por 500 μL de trippsina de 0,5% em PBS estéril. Incubar a mistura por 30 min a 37 °C em um termbloco.
3. Após a digestão enzimática, transfira a solução de trippsina contendo os botões dos membros em uma placa de Petri estéril.
4. Remova o excesso de trippsina o máximo possível usando uma micropipette; inundar a placa de Petri com 1x PBS gelado suplementado com 10% de FBS até que todos os botões de membros estejam cobertos.
   NOTA: A FBS pode ser substituída por soro de cavalo.
5. Identificar os botões do membro sob o estereóscópio; identificar o ectoderme como uma membrana transparente ligeiramente separada das células mesodérmicas do membro (Figura 1B).
6. Segure a extremidade mais proximal do broto do membro com o auxílio de fórceps cirúrgicos finos enquanto se desprende cuidadosamente e separe cuidadosamente a camada de ectoderm usando os outros fórceps.
   NOTA: A obtenção dos ectodermes pode ser difícil devido ao agrupamento de células mesodérmicas e anexação a ectodermias, fazendo com que elas se tornem pegajosas. Recomenda-se descartar constantemente as células mesodérmicas para manter apenas os ectodermes na placa de Petri.
7. Mantenha os ectodermes na solução de 1x PBS-10% FBS gelada.
   NOTA: Os ectodermes podem ser armazenados a 4 °C caso o mesoderm reaggregado não esteja pronto. No entanto, é preferível coordenar o tempo de incubação da pelota com a obtenção ectodérmica.

4. Montagem de células mesodérmicas dentro da cobertura ectodérmica

NOTA: Para isso, é necessário ter os ectodermes vazios em uma placa de Petri com solução estéril 1x PBS-10% FBS contendo uma pelota formada de células mesodérmicas.

1. Depois que a pelota for formada (ver seção 2), descarte ~600 μL do meio do tubo por pipetação.
2. Retire cuidadosamente a pelota do fundo usando uma ponta de pipeta e sem esmagá-la ou destruí-la.
3. Quando a pelota estiver completamente separada da parte inferior do tubo, gire o tubo de cabeça para baixo para transferir a pelota para a placa de Petri contendo os ectodermes vazios (Figura 1C).
4. Corte um pequeno pedaço da pelota com o auxílio de um par de fórceps cirúrgicos finos e coloque-o o mais próximo possível do ectoderm.
5. Como se fosse um saco, abra o ectoderm com os fórceps cirúrgicos, e coloque o pedaço de pelota o mais firmemente possível na tampa ectodérmica. Repita esta etapa para quantas RLs desejarem (Figura 1D).
   NOTA: Corte as peças da pelota uma a uma e encha os ectodermes para manter limpa a solução 1x PBS-10% FBS. O tamanho da pelota precisa corresponder a cada ectoderm.
6. Permita que o ectoderm e o mesoderm se curem juntos por ~30 min à temperatura ambiente e depois enxergá-los no hospedeiro do embrião. Descarte o ectoderm e o mesoderm não-ued.

5. Transplante do ectoderm preenchido em um embrião hospedeiro
 

NOTA: Antes de transplantar os ectodermes, organize dois estereómicros próximos um do outro em um banco, um para manipulação de embriões e enxerto de RL. A outra é para manter os ectodermes preenchidos prontos para transferência para o embrião.

1. Selecione o número de ovos desejados para enxertar os ectodermes preenchidos.
2. Usando a ponta de um fórceps contundente, bata na casca de ovo dos embriões hospedeiros de 22 HH para abrir uma janela. Identifique a membrana de ar e, usando um par de fórceps cirúrgicos finos, remova-a completamente.
3. Abra o saco amniótico perto do membro dianteiro para expor o flanco direito do embrião. Abra apenas a quantidade necessária para realizar o procedimento.
4. Guiado pela posição do membro dianteiro, realize arranhões de ferida com uma agulha de tungstênio (ver Tabela de Materiais) até o comprimento de 2-3 somites, danificando ligeiramente o mesoderm até sangrar.
5. Transfira individualmente um ectoderm preenchido (RL) para o embrião do filhote e coloque a base do membro recombinante sobre a ferida de somite.
   NOTA: A transferência de RL pode ser feita com uma pipeta de plástico ou com uma faca de fenda angular.
6. Fixar corretamente o RL com duas peças de fio de paládio de 0,025 mm de diâmetro e 0,5-1 mm de comprimento (ver Tabela de Materiais). Alinhe a base da RL com a ferida para garantir que ela seja anexada ao flanco do embrião hospedeiro e vascularizada (Figura 1E).
7. Sele a janela com fita adesiva e devolva o ovo para a incubadora. Colete os embriões nos pontos de tempo desejados para análise.

Resultados

Reconhecendo um membro recombinante bem executado
Após o enxerto, os embriões manipulados foram devolvidos à incubadora para permitir que a RL se desenvolvesse. O tempo de incubação correlaciona-se com os requisitos do experimento. No entanto, a RL pode ser facilmente distinguida após 12 horas de implantação. Para determinar se a implantação era adequada, a RL foi observada como uma protuberância que estava firmemente presa à parede mesodérmica do embrião doador (Fig...

Discussão

Em geral, o protocolo RL pode ser dividido em cinco etapas: (1) incubação de embriões, (2) obtenção de células mesodérmicas de membros para preencher os ectodermes, (3) obtenção dos ectodermes, (4) a montagem de células mesodérmicas dentro das capas ectodérmicas e (5) transplantes dos ectoderms preenchidos nos embriões hospedeiros. A maior limitação da técnica RL é o protocolo longo e detalhado, que tem muitos pontos críticos que requerem paciência para executar adequadamente. Para completar com sucess...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01