Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Zusammenfassung

Proteomische Dysregulation spielt eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung diffus infiltrierender Gliome, aber mehrere relevante Proteine bleiben unidentifiziert. Digital Spatial Processing (DSP) bietet einen effizienten Hochdurchsatzansatz zur Charakterisierung der differentiellen Expression von Kandidatenproteinen, die zur Invasion und Migration infiltrativer Gliome beitragen können.

Zusammenfassung

Diffus infiltrierende Gliome sind aufgrund der infiltrativen Natur der Tumorausbreitung mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden. Sie sind morphologisch komplexe Tumoren mit einem hohen Grad an proteomischer Variabilität sowohl über den Tumor selbst als auch über seine heterogene Mikroumgebung. Das bösartige Potenzial dieser Tumoren wird durch die Dysregulation von Proteinen verstärkt, die an mehreren Schlüsselwegen beteiligt sind, einschließlich Prozessen, die die zelluläre Stabilität aufrechterhalten und die strukturelle Integrität der Mikroumgebung bewahren. Obwohl es zahlreiche Massen- und Einzelzell-Gliomanalysen gab, gibt es einen relativen Mangel an räumlicher Schichtung dieser proteomischen Daten. Das Verständnis der Unterschiede in der räumlichen Verteilung von tumorigenen Faktoren und Immunzellpopulationen zwischen dem intrinsischen Tumor, dem invasiven Rand und der Mikroumgebung bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die der Tumorproliferation und -ausbreitung zugrunde liegen. Digital Spatial Profiling (DSP) stellt eine leistungsstarke Technologie dar, die die Grundlage für diese wichtigen Mehrschichtanalysen bilden kann.

DSP ist eine Methode, die die Proteinexpression innerhalb benutzerdefinierter räumlicher Regionen in einer Gewebeprobe effizient quantifiziert. DSP ist ideal für die Untersuchung der differentiellen Expression mehrerer Proteine innerhalb und zwischen Regionen der Unterscheidung und ermöglicht mehrere Ebenen der quantitativen und qualitativen Analyse. Das DSP-Protokoll ist systematisch und benutzerfreundlich und ermöglicht eine maßgeschneiderte räumliche Analyse von Proteomdaten. In diesem Experiment werden Gewebe-Microarrays aus archivierten Glioblastom-Kernbiopsien konstruiert. Als nächstes wird ein Panel von Antikörpern ausgewählt, die auf Proteine von Interesse in der Probe abzielen. Die Antikörper, die an UV-photospaltbare DNA-Oligonukleotide vorkonjugiert werden, werden dann über Nacht mit der Gewebeprobe inkubiert. Unter fluoreszenzmikroskopischer Visualisierung der Antikörper werden mit den Proben Interessengebiete (ROIs) definiert, innerhalb derer die Proteinexpression quantifiziert werden kann. UV-Licht wird dann auf jeden ROI gerichtet und spaltet die DNA-Oligonukleotide. Die Oligonukleotide werden mikroaspiriert und innerhalb jedes ROI gezählt, wobei das entsprechende Protein auf räumlicher Basis quantifiziert wird.

Einleitung

Diffus infiltrierende Gliome sind die häufigste Form von bösartigen Hirntumoren bei Erwachsenen und sind ausnahmslos tödlich. Die Neigung von Gliomzellen, extensiv im Gehirn zu wandern, ist eine große therapeutische Herausforderung. Der Mechanismus, durch den sie sich ausbreiten, beinhaltet gezielte Migration und unkontrollierte Invasion. Es wurde gezeigt, dass invasive Gliomzellen Tropismus und Migration entlang der Bahnen der weißen Substanz aufweisen¹, wobei neuere Forschungen die Demyelinisierung dieser Trakte als aktives, protumorigenes Merkmal implizieren². Die Invasion wird durch einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang vermittelt, bei dem Gliomzellen mesenchymale Eigenschaften erwerben, indem sie die Expression von Genen reduzieren, die extrazelluläre Matrixproteine und Zelladhäsionsmoleküle kodieren, die Migration verstärken und die Ausbreitung durch die Tumormikroumgebung ^{erleichtern 3,4,5}.

Auf molekularer Ebene wurde die Störung mehrerer Proteine nachgewiesen, die zelluläre Stabilität verleihen und mit immunogenen Komponenten interagieren⁶. Es ist bekannt, dass infiltrative Gliome eine Unterdrückung von Proteinen mit anti-apoptotischen (z. B. PTEN) Eigenschaften durchlaufen⁷. Sie überexprimieren auch Proteine, die die Umgehung der Immunantwort des Wirts fördern (z. B. PD1 / PDL1)⁸. Die Fehlregulation dieser komplexen Signalwege erhöht die Tumorigenität und erhöht das maligne Potenzial.

Innerhalb von Proben invasiver Gliome bestand das Ziel darin, die differentielle Expression von Proteinen zu bewerten, die für das Wachstum, Überleben und die Proliferation von Zellen sowie für die strukturelle Integrität der Mikroumgebung zwischen invasiven und nicht-invasiven Komponenten entscheidend sind. Darüber hinaus versuchten wir, die differentielle Regulation von Proteinen mit einer aktiven immunogenen Rolle zu untersuchen und Einblicke in den Mechanismus zu geben, durch den kompromittierte Immunabwehr des Wirts das proliferative und invasive Potenzial von Gliomen verbessern kann. Dies ist besonders relevant angesichts der jüngsten Breite der Forschung, die zeigt, wie Immunmarker und Treiber von Dysregulation bei Malignität als Ziele der Immuntherapie dienen können. Die Identifizierung praktikabler therapeutischer Ziele unter den vielen Proteinen, die an der Immunüberwachung und Reaktivität beteiligt sind, erfordert einen hochsensiblen und umfassenden Ansatz.

Angesichts der breiten Palette von Kandidatenproteinen, die untersucht werden können, suchten wir nach einer Methode, die der Immunhistochemie ähnelt, aber mit verbesserter Datenverarbeitungseffizienz. Im Bereich der Krebsbiologie hat sich DSP zu einer leistungsstarken Technologie mit wichtigen Vorteilen gegenüber alternativen Werkzeugen für die Proteomanalyse und -quantifizierung entwickelt. Das Markenzeichen von DSP ist seine Hochdurchsatz-Multiplexing-Fähigkeit, die die gleichzeitige Untersuchung mehrerer verschiedener Proteine innerhalb einer Probe ermöglicht, was einen wichtigen Unterschied zu Standard-, aber Low-Plex-Technologien wie der Immunhistochemie (IHC) ^{darstellt9,10}. Die Multiplex-Funktion von DSP beeinträchtigt nicht seine Treue als quantitatives und analytisches Werkzeug, wie Studien zeigen, in denen DSP mit IHC verglichen wird. Bei der Verwendung zur proteomischen Quantifizierung von nicht-kleinzelligen Lungenkrebsproben hat DSP beispielsweise ähnliche Ergebnisse wie IHC¹¹. Darüber hinaus bietet DSP eine anpassbare regionale Spezifikation, in der Benutzer manuell Regionen definieren können, in denen proteomische Analysen durchgeführt werden sollen. Dies stellt einen Vorteil gegenüber Ganzsektions-Multiplex-Methoden^10,12 dar. In einer einzigen Verarbeitungsrunde bietet DSP somit mehrere Analyseebenen, indem mehrere Proteinziele in mehreren Regionen von Interesse untersucht werden.

DSP hat Anwendungen in verschiedenen pathologischen Einstellungen. DSP ist besonders vorteilhaft in der onkologischen Analyse, da räumliche Variation mit zellulärer Transformation und differentieller Proteinexpression korrelieren kann. Zum Beispiel wurde DSP verwendet, um das proteomische Profil von Brustkrebs mit der benachbarten Tumormikroumgebung zu vergleichen. Dies hat wichtige Implikationen für das Verständnis des natürlichen Verlaufs dieses Tumors und seines Fortschreitens sowie für ein mögliches Ansprechen auf die Behandlung¹³. Weitere Kontexte, die die Vielseitigkeit der DSP veranschaulichen, umfassen die räumliche Quantifizierung der Proteindiversität bei Prostatakrebs¹⁴, die Assoziation der Immunzellmarkerexpression mit der Krankheitsprogression beim Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom 15 und die Demonstration eines epithelial-mesenchymalen Gradienten der Proteinexpression, der metastasierten von primärem klarzelligem Ovarialkarzinom unterscheidet¹⁶ . Durch die Implementierung von DSP charakterisieren wir die räumliche Topographie von Proteinen, die die Tumorgenese und Invasion von Gliomen beeinflussen könnten.

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Protokoll

Das unten beschriebene Protokoll folgt den Richtlinien des Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Die Einwilligungserklärung wurde von den Patienten eingeholt, deren Gewebeproben in diese Studie eingeschlossen wurden. Weitere Informationen zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie im Abschnitt Materialtabelle .

1. Objektträgervorbereitung¹⁷

1. Gewinnung oder Vorbereitung von formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe aus diffus infiltrierenden Gliomen des menschlichen Erwachsenentyps.
   HINWEIS: In diesem Experiment wurden paraffineingebettete Biopsienblöcke von drei Patienten mit Glioblastom verwendet.
2. Erstellen Sie einen Tissue Microarray (TMA) -Block. Nehmen Sie mehrere 2-mm-Kerne aus jeder Biopsie und legen Sie sie in einen einzigen TMA-Block (Abbildung 1, oben). Schneiden Sie Abschnitte aus dem TMA-Block mit 4 μm und montieren Sie sie auf Glasobjektträgern. Legen Sie jedes Dia in die Dichtung des Diahalters. Inkubieren Sie den Objektträger bei 60 °C für 30 min.

2. Halbautomatische IHC-Systemvorbereitung und Softwarekonfiguration (zum Laden und Abspielen von Folien)¹⁷

1. Richten Sie die Reagenzien ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Reagenzien-Setup. Klicken Sie auf der Registerkarte Setup auf Hinzufügen.
   1. Registrieren Sie einen Waschpuffer, indem Sie einen Namen dafür in das Feld Name eingeben. Wählen Sie im Feld Typ die Option Zusatz aus. Klicken Sie auf Speichern.
   2. Registrieren Sie eine blockierende Lösung, indem Sie die gleichen Schritte wie oben wiederholen (ggf. geändert, z. B. im Feld Name), aber im Feld Typ die Option Primärer Antikörper auswählen. Wählen Sie die gewünschten Protokolle in den Dropdown-Feldern für Standard-Färbeprotokoll und Standard-HIER-Protokoll aus. Wählen Sie bei Bedarf eine Standard-Enzymprotokolloption aus (dieses Feld wurde im aktuellen Protokoll leer gelassen). Klicken Sie auf Speichern.
2. Registrieren Sie das Erkennungssystem, bestehend aus einem Reagenzienbehälter mit Barcode. Scannen Sie den Barcode.
   1. Beginnen Sie mit der Eingabe von Reagenziensystemdetails im Fenster Forschungsreagenzsystem hinzufügen . Geben Sie einen Namen für das Erkennungssystem ein.
   2. Geben Sie ein Ablaufdatum ein. Markieren Sie die erste Zeile des Reagenziendiagramms und scannen Sie den Barcode eines neuen 30-ml-Reagenzienbehälters, woraufhin der Barcode Zeile 1 füllt.
   3. Stellen Sie den Behälter an Position 1 des Erkennungssystems auf. Wählen Sie den Namen des Waschpuffers in der Dropdown-Box der Spalte Reagenz aus und klicken Sie auf Hinzufügen. Wiederholen Sie diese Schritte, um weitere Reagenzien in nachfolgenden Zeilen hinzuzufügen, einschließlich der Blockierungslösung.
3. Richten Sie das Proteinprotokoll für IHC ein. Klicken Sie auf Protocol Setup. Markieren Sie die Zeile, die dem gewünschten Protokoll entspricht, und klicken Sie auf Kopieren. Geben Sie den Namen ein und füllen Sie alle anderen relevanten Felder im Fenster Protokolleigenschaften bearbeiten aus.
   1. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Waschschritte anzeigen. Vergewissern Sie sich, dass die Felder Inc (min) und DispenseType für jedes Reagenz korrekt sind (10 min für die Blockierlösung, 0 min für den Waschpuffer und 150 μL für jeden DispenseType). Klicken Sie auf Speichern.
4. Bereiten Sie die Studie vor. Füllen Sie den Behälter in Position 1 mit einem Waschpuffer. Füllen Sie 150 μL pro Objektträger und 5 mL Totvolumen; Lassen Sie den Deckel offen. Wiederholen Sie diese Schritte für den Behälter in Position 2, der mit einer Blockierlösung gefüllt werden soll. Dieser Behälter sollte 150 μL pro Objektträger und 350 μL Totvolumen haben.
   1. Legen Sie den Reagenzienbehälterträger auf die Maschine. Erlauben Sie dem System, Behältererkennungs- und Volumenbestätigungsmaßnahmen durchzuführen. Klicken Sie auf Slide Setup | Studie hinzufügen. Geben Sie die Studien-ID und den Studiennamen ein und wählen Sie 150 μL unter Dispense Volume | das gewünschte Protokoll im Dropdown-Menü Vorbereitungsprotokoll (Bake and Dewax wird empfohlen). Markieren Sie die Studie und klicken Sie auf Folie hinzufügen.
   2. Wählen Sie Testgewebe unter Gewebetyp | 150 μL unter Dosiervolumen | Single und Routine aus den Dropdown-Boxen Färbemodus. Wählen Sie einen Prozess (IHC für die aktuelle Studie) | den Namen der Blockierungslösung im Dropdown-Feld des Felds Marker | IHC DSP-Protokoll im Feld Färbung der Registerkarte Protokolle | *Backen und Entwachsen zur Vorbereitung | *HIER 20 min mit ER1 für HIER. Lassen Sie das Feld Enzym leer.
   3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Folie. Klicken Sie auf Schließen , wenn Sie fertig sind, und klicken Sie dann auf Etiketten drucken. Überprüfen Sie alle noch nicht gedruckten Folienetiketten für die aktuelle Studie und klicken Sie auf Drucken. Kleben Sie Beschriftungen oben auf den Folien.
5. Laden und Ausführen von Folien. Legen Sie die Objektträger auf das Objektträgerfach und stellen Sie sicher, dass die Proben- und Etikettenseite nach oben gerichtet ist. Platzieren Sie die Deckkacheln über den Folien, und stellen Sie sicher, dass die Folien mit Registerkarten am unteren Rand ausgerichtet sind. Legen Sie die Diafächer auf das Instrument.
   1. Drücken Sie die LED-Taste , um das Fach abzusenken und dem Gerät das Scannen und Erkennen von Dias zu ermöglichen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um das Experiment zu starten.
6. Beenden Sie das Experiment. Drücken Sie die LED-Taste , wenn sie grün blinkt, um den Abschluss des Laufs anzuzeigen. Entfernen Sie das Fach aus dem Instrument, und heben Sie die Abdeckplatten vorsichtig von jedem Objektträger ab. Legen Sie die Objektträger in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), entfernen Sie überschüssigen Puffer und umreißen Sie jeden Gewebeabschnitt mit einem hydrophoben Stift, um eine hydrophobe Barriere zu schaffen.

3. Antikörperinkubation und Kernfärbung¹⁷

1. Wählen Sie ein Panel von Antikörpern aus, um die interessierenden Antigene zu lokalisieren (siehe Tabelle 1 für Antikörper, die in diesem Experiment verwendet werden).
   HINWEIS: Jeder Antikörper wurde bereits an ein DNA-Oligonukleotid mit einem UV-photospaltbaren Segment (PC-Oligo) konjugiert, das ihn eindeutig identifiziert (Indexierungsoligos, Abbildung 2).
2. Stellen Sie eine funktionierende Antikörper-PC-Oligo-Lösung her, indem Sie für jeden Objektträger 8 μL jedes Antikörpers (verdünnt 1:40) in die Platte geben. Verwenden Sie das blockierende Reagenz als Verdünnungsmittel, um das Endvolumen von 200 μL für jeden Objektträger zu erreichen. Über Nacht bei 4 °C inkubieren (Abbildung 3, Schritt 1).
   HINWEIS: Morphologiemarker, biologische Farbstoffe oder fluoreszenzmarkierte Antikörper können der Lösung in diesem Schritt ebenfalls zugesetzt werden.
3. Am nächsten Tag den Objektträger in ein Coplin-Glas geben und 3 x 10 min in 1x TBS-T waschen. Postfix in 4% Paraformaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 2 x 5 min in 1x TBS-T.
4. Fügen Sie SYTO13 Kernfleck (verdünnt 1:10 in 1x TBS) für 15 min bei Raumtemperatur hinzu. 2x mit 1x TBS-T waschen und dann den Objektträger in 1x TBS-T aufbewahren.

4. Fluoreszenzvisualisierung, ROI-Identifikation und UV-Photospaltung auf dem DSP-Instrument¹⁷

1. Nachdem Sie den Mauszeiger über die Datenerfassung im Kontrollzentrum bewegt haben, wählen Sie Neu/Ausführen fortsetzen.
2. Legen Sie das Dia in den Diahalter, wobei das Etikett in Richtung des Benutzers gerichtet ist. Senken Sie die Schieberschale, um sicherzustellen, dass das Gewebe im länglichen Fenster sichtbar ist. Fügen Sie 6 ml Buffer S hinzu.
3. Folgen Sie den Anweisungen im Kontrollzentrum. Zoomen Sie mit den X- und Y-Schiebereglern zwischen verschiedenen Achsen, um einen Bereich für das Scannen abzugrenzen. Wählen Sie Scannen aus. Lassen Sie den Scan fortfahren, bis der gesamte definierte Zielbereich abgebildet wurde.
4. Generieren Sie ein 20-faches Bild. Definieren Sie die ROIs entweder automatisch oder manuell (Abbildung 3, Schritt 2). Um diesem Protokoll zu folgen, wählen Sie drei gleich große, kreisförmige ROIs (Durchmesser von 250 μm) für jeden Gewebekern aus (Abbildung 4, unten).
   HINWEIS: ROIs sind in Größe und Form anpassbar. Innerhalb jedes Abschnitts können mehrere ROIs ausgewählt werden. In diesem Experiment werden zirkuläre ROIs manuell definiert.
5. Genehmigen Sie die ROIs, indem Sie auf die Schaltfläche Scan-Arbeitsbereich beenden klicken. Warten Sie, bis UV-Licht die Oligos von den Antikörpern trennt.
6. Wenn der Reinigungsinstrumentvorgang abgeschlossen ist, wählen Sie Neue Datenerfassung aus, um mit den aktuellen Objektträgern oder der aktuellen Platte fortzufahren. Wählen Sie andernfalls Objektträger und Mikrotiterplatten entfernen aus.
7. Öffnen Sie das Fenster Platte abschließen , indem Sie auf das Plattensymbol unten rechts im Kontrollzentrum doppelklicken. Wenn die Hybridization (Hyb) Code Pack-Chargennummer (#) bekannt ist, geben Sie die Nummer ein und klicken Sie auf Update (optional in diesem Schritt). Klicken Sie auf Abschließen.
8. Trennen Sie den Diahalter und die Sammelplatte, indem Sie den Anweisungen folgen. Speichern Sie die Folien in TBS-T. Wenn die Dias längere Zeit nicht verwendet werden, bedecken Sie sie mit einem wässrigen Medium und Deckglas.

5. Proteinanzeige¹⁷

1. Verwenden Sie eine durchlässige Dichtung und trocknen Sie die Aspirate bei 65 °C in einem Thermocycler mit offenem Oberteil. Fügen Sie 7 μL mit Diethylpyrocarbonat behandeltes Wasser hinzu und mischen Sie. 10 Minuten bei RT inkubieren und dann schnell herunterdrehen.
2. Wählen Sie die entsprechenden Gleichungen für Sonde R und Sonde U aus Tabelle 2 aus, um die Erstellung der Sonden-Puffer-Mischung zu leiten. Basierend auf der Anzahl der Hyb-Codes, die für die Hybridisierung im vorliegenden Experiment erforderlich sind, wenden Sie Gleichung (1) wie folgt an. Mischen und schnell herunterdrehen.
   # Hyb-Codes Sonde R Arbeitspoolsonde U Arbeitspool-Hybridisierungspuffer n = ______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)
3. Fügen Sie jedem zu verwendenden Hyb-Codepaket 84 μL Sonde/Puffer-Mix hinzu. Streichen zum Mischen und Herunterdrehen. In einer frischen 96-Well-Hybridisierungsplatte 8 μL jedes Hyb Code Master Mix in alle 12 Vertiefungen der angegebenen Reihe geben.
4. 7 μL von der DSP-Sammelplatte in die entsprechende Vertiefung in der Hybridisierungsplatte überführen. Vorsichtig mischen. Heißsiegeln und eine schnelle Drehung durchführen. Anschließend über Nacht bei 67 °C inkubieren. Kühlen Sie die Platte auf Eis und führen Sie eine schnelle Drehung durch.
5. Bündeln Sie die Hyb-Produkte aus jedem Bohrloch in einem Streifenrohr und verrohren Sie jedes Bohrloch vorsichtig 5x, um es zu mischen. Verschließen Sie das Streifenrohr und drehen Sie es herunter. Verbleibende nicht gepoolte Hyb-Produkte bei -80 °C einfrieren. Laden Sie die Bandrohre in das Analysesystem.
6. Speichern Sie die CDF-Datei auf einem USB-Laufwerk und übertragen Sie dann die Daten vom DSP-Gerät auf den Digital Analyzer. Schließen Sie die Einrichtung ab, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Laden Sie Verbrauchsmaterialien und gepoolte Proben auf die Vorbereitungsstation. Drücken Sie auf dem Bildschirm auf Verarbeitung starten. Wählen Sie Hohe Empfindlichkeit und anschließend Weiter. Klicken Sie auf Alle auswählen , um die Anzahl der Bohrlöcher mit | Proben anzuzeigen. Beenden Sie | Als nächstes auf E-Mail-Benachrichtigung | Starten.
   2. Sobald die Vorbereitungsstation abgeschlossen ist, verschließen Sie die Kartusche und übertragen Sie sie auf den digitalen Analysator. Drücken Sie Zählung starten, wählen Sie Bühnenposition, drücken Sie Vorhandene CDF-Datei laden und wählen Sie die zuvor hochgeladene Datei aus. Drücken Sie Fertig, wählen Sie erneut die Bühnenposition, drücken Sie Fertig | Starten Sie die Ausführung des Programms.
7. Speichern Sie die gezippte Datei der Konvertierungsdateien für die Reporteranzahl aus dem Analysesystem auf einem USB-Laufwerk, und legen Sie das Laufwerk dann in den DSP-Computer ein. Bewegen Sie im DSP-Kontrollzentrum den Mauszeiger über Datenerfassung und klicken Sie dann auf Upload-Anzahl. Wählen Sie die entsprechende gezippte Datei aus.

6. Datenanalyse¹⁷

1. Klicken Sie im DSP Control Center auf Records. Um Scans in der Warteschlange anzuzeigen, wählen Sie Ausgewählte Scans zur Warteschlange hinzufügen | Meine Analysewarteschlange. Wählen Sie Neue Studie aus der Warteschlange, nachdem Sie den Mauszeiger über die Option Datenanalyse im Control Center bewegt haben.
2. Wählen Sie QC aus den Optionen der Taskleiste aus. Fahren Sie mit den Standardwerten fort oder passen Sie sie bei Bedarf an. Wählen Sie Run QC (QC ausführen) aus, und überprüfen Sie das Ergebnisraster. Klicken Sie auf Run QC , um fortzufahren und einen neuen Datensatz zu erstellen, der die Werte auf die positiven Hybridisierungskontrollen normalisiert.
3. Importieren Sie die neuen Tags in eine XLSX-Datei. Wählen Sie im Bereich Scans die Option Anmerkungen verwalten aus, laden Sie dann eine Vorlage herunter, fügen Sie die Tags ein und importieren Sie die Datei.
4. OPTIONAL: Passen Sie nach dem Ausführen von QC die Daten mithilfe anderer Symbolleistenoptionen weiter an. Verwenden Sie die Werkzeuge im Bereich Visualisierungen , um die transformierten Daten darzustellen.
5. Navigieren Sie durch das graue Dropdown-Feld mit Parametern, um jedes Diagramm im Bereich "Visualisierungen " zu erstellen. Wählen Sie einen bestimmten Bereich innerhalb eines Diagramms aus, um die entsprechenden hervorgehobenen Segmente im Scanbereich zu visualisieren, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Tags oder Gruppen zu generieren. Überprüfen Sie in der Datensatzzusammenfassung Diagramme aus Normalisierung, Skalierung und anderen Optionen für die Analyse und Anzeige.
6. Speichern Sie eine Visualisierung, indem Sie das Symbol zum Speichern auswählen. Überprüfen Sie bereits gespeicherte Visualisierungen unter Zusammenfassung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren (.svg), um eine Visualisierung in .svg Format zu exportieren. Exportieren Sie Daten, auf denen eine Visualisierung basiert, indem Sie auf die Schaltfläche Exportieren (.xlsx) klicken. Exportieren Sie alle in einem bestimmten Datensatz enthaltenen Daten, indem Sie den Cursor über den Datensatznamen im zweiten Bereich bewegen und auf das Exportsymbol klicken.

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Ergebnisse

Abbildung 4 zeigt die repräsentativen Ergebnisse eines DSP-Experiments, das an Proben von Glioblastomen durchgeführt wurde. Es wird eine Heatmap vorgestellt, die eine der Methoden zur visuellen Erfassung von Daten mit der DSP-Software veranschaulicht. Zeilen stellen Proteinziele dar, und jede Spalte entspricht einer Region von Interesse. Ein Farbbereich von Blau bis Rot bedeutet einen niedrigen bzw. hohen Ausdruck. Die Variabilität der Farbe innerhalb einer Reihe spiegelt die regionale Pr...

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Diskussion

Angesichts der Vielfalt der Proteine, die möglicherweise die Aggressivität von Gliomen beeinflussen könnten, und der Vorstellung, dass mehrere dieser Proteine unentdeckt bleiben, ist eine Hochdurchsatz-Proteinquantifizierungsmethode ein idealer technologischer Ansatz. Da räumliche Daten in onkologischen Proben häufig mit der differentiellen Expression^{korrelieren 18}, ermöglicht die Einbeziehung räumlicher Profile in den Proteinquantifizierungsansatz eine effektivere Analyse.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit--12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block