Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

Resumo

A desregulação proteômica desempenha um papel importante na disseminação de gliomas difusos infiltrantes, mas várias proteínas relevantes permanecem não identificadas. O processamento espacial digital (DSP) oferece uma abordagem eficiente e de alto rendimento para caracterizar a expressão diferencial de proteínas candidatas que podem contribuir para a invasão e migração de gliomas infiltrativos.

Resumo

Gliomas de infiltração difusa estão associados a alta morbidade e mortalidade devido à natureza infiltrativa da disseminação tumoral. São tumores morfologicamente complexos, com alto grau de variabilidade proteômica tanto no próprio tumor quanto em seu microambiente heterogêneo. O potencial maligno desses tumores é reforçado pela desregulação de proteínas envolvidas em várias vias-chave, incluindo processos que mantêm a estabilidade celular e preservam a integridade estrutural do microambiente. Embora tenha havido numerosas análises de glioma a granel e unicelular, há uma relativa escassez de estratificação espacial desses dados proteômicos. A compreensão das diferenças na distribuição espacial de fatores tumorigênicos e populações de células imunes entre o tumor intrínseco, a borda invasiva e o microambiente oferece informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes à proliferação e propagação do tumor. O perfil espacial digital (DSP) representa uma tecnologia poderosa que pode formar a base para essas importantes análises multicamadas.

O DSP é um método que quantifica eficientemente a expressão de proteínas dentro de regiões espaciais especificadas pelo usuário em uma amostra de tecido. O DSP é ideal para estudar a expressão diferencial de múltiplas proteínas dentro e entre regiões de distinção, permitindo múltiplos níveis de análise quantitativa e qualitativa. O protocolo DSP é sistemático e fácil de usar, permitindo a análise espacial personalizada de dados proteômicos. Neste experimento, microarranjos teciduais são construídos a partir de biópsias de núcleo de glioblastoma arquivadas. Em seguida, um painel de anticorpos é selecionado, visando proteínas de interesse dentro da amostra. Os anticorpos, que são pré-conjugados a oligonucleotídeos de DNA UV-fotoclevíveis, são então incubados com a amostra de tecido durante a noite. Sob a visualização por microscopia de fluorescência dos anticorpos, as regiões de interesse (ROIs) dentro das quais quantificar a expressão proteica são definidas com as amostras. A luz UV é então direcionada para cada ROI, clivando os oligonucleotídeos do DNA. Os oligonucleotídeos são microaspirados e contados dentro de cada ROI, quantificando a proteína correspondente em uma base espacial.

Introdução

Gliomas de infiltração difusa são o tipo mais comum de tumor cerebral maligno em adultos e são invariavelmente letais. A propensão para as células do glioma migrarem extensivamente no cérebro é um grande desafio terapêutico. O mecanismo pelo qual eles se espalham envolve migração dirigida e invasão descontrolada. Demonstrou-se que as células invasivas do glioma exibem tropismo e migração ao longo dos tratos da substância branca¹, com pesquisas recentes implicando a desmielinização desses tratos como uma característica ativa e protumorigênica². A invasão é mediada por uma transição epitelial-mesenquimal, na qual as células do glioma adquirem propriedades mesenquimais, reduzindo a expressão de genes que codificam proteínas da matriz extracelular e moléculas de adesão celular, amplificando a migração e facilitando a propagação através do microambiente tumoral ^3,4,5.

No nível molecular, tem sido demonstrada a ruptura de diversas proteínas que conferem estabilidade celular e interface com componentes imunogênicos⁶. Sabe-se que os gliomas infiltrativos sofrem supressão de proteínas com propriedades antiapoptóticas (por exemplo, PTEN)⁷. Eles também superexpressam proteínas que promovem a evasão da resposta imune do hospedeiro (por exemplo, PD1/PDL1)⁸. A desregulação dessas vias complexas aumenta a tumorigenicidade e aumenta o potencial maligno.

Dentro de amostras de glioma invasivo, o objetivo foi avaliar a expressão diferencial de proteínas fundamentais para o crescimento, sobrevivência e proliferação celular, e para a integridade estrutural do microambiente entre componentes invasivos e não invasivos. Além disso, procuramos estudar a regulação diferencial de proteínas com um papel imunogênico ativo, oferecendo informações sobre o mecanismo pelo qual as defesas imunológicas comprometidas do hospedeiro podem aumentar o potencial proliferativo e invasivo dos gliomas. Isso é especialmente relevante, dada a recente amplitude de pesquisas que demonstram como os marcadores imunológicos e os fatores de desregulação na malignidade podem servir como alvos da imunoterapia. A identificação de alvos terapêuticos viáveis entre as muitas proteínas envolvidas na imunovigilância e reatividade requer uma abordagem altamente sensível e abrangente.

Dada a ampla gama de proteínas candidatas que podem ser estudadas, buscamos um método semelhante à imuno-histoquímica, mas com maior eficiência no processamento de dados. Dentro do campo da biologia do câncer, o DSP emergiu como uma tecnologia poderosa com vantagens importantes sobre ferramentas alternativas para análise e quantificação proteômica. A marca registrada do DSP é sua capacidade de multiplexação de alto rendimento, permitindo o estudo simultâneo de várias proteínas diferentes dentro de uma amostra, marcando uma distinção importante das tecnologias padrão, mas de baixo plexo, como a imuno-histoquímica (IHC)^9,10. A característica multiplex do DSP não compromete sua fidelidade como ferramenta quantitativa e analítica, como demonstrado por estudos comparando DSP com IHC. Quando usado para quantificação proteômica de espécimes de câncer de pulmão de células não pequenas, por exemplo, o DSP demonstrou ter resultados semelhantes aos da IHC¹¹. Além disso, o DSP oferece especificação regional personalizável, na qual os usuários podem definir manualmente as regiões dentro das quais executar a análise proteômica. Isso apresenta uma vantagem sobre os métodos multiplex de seção inteira^10,12. Em uma única rodada de processamento, o DSP oferece várias camadas de análise, pesquisando vários alvos de proteínas em várias regiões de interesse.

DSP tem aplicações em vários contextos patológicos diferentes. A DSP é especialmente vantajosa na análise oncológica, pois a variação espacial pode se correlacionar com a transformação celular e a expressão diferencial de proteínas. Por exemplo, o DSP tem sido usado para comparar o perfil proteômico do câncer de mama com o microambiente tumoral adjacente. Isso traz implicações importantes para a compreensão da história natural desse tumor e sua progressão, bem como para a potencial resposta ao tratamento¹³. Contextos adicionais que ilustram a versatilidade do DSP incluem quantificação espacial da diversidade proteica no câncer de próstata¹⁴, associação da expressão de marcadores de células imunes com a progressão da doença no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço 15 e demonstração de um gradiente epitelial-mesenquimal de expressão proteica distinguindo o câncer de ovário metastático de células claras primário¹⁶ . Ao implementar o DSP, caracterizamos a topografia espacial de proteínas que poderiam impactar a tumorigênese e a invasão de gliomas.

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Protocolo

O protocolo descrito abaixo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos de Dartmouth-Hitchcock. O consentimento informado foi obtido dos pacientes cujas amostras de tecido foram incluídas neste estudo. Consulte a seção Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo.

1. Preparação de slides¹⁷

1. Recupere ou prepare tecido fixado em formalina e incorporado em parafina de gliomas difusamente infiltrados do tipo adulto humano.
   NOTA: Neste experimento, foram utilizados blocos de biópsias embutidas em parafina de três pacientes com glioblastoma.
2. Crie um bloco de microarray de tecido (TMA). Pegue vários núcleos de 2 mm de cada biópsia e coloque-os em um único bloco TMA (Figura 1, acima). Corte as seções do bloco TMA a 4 μm e monte em lâminas de vidro. Coloque cada slide dentro da junta do suporte deslizante. Incubar a lâmina a 60 °C durante 30 minutos.

2. Preparação semi-automatizada do sistema IHC e configuração de software (para carregamento e execução de lâminas)¹⁷

1. Configure os reagentes. Clique no botão Configuração do reagente . Clique em Adicionar na guia Configuração .
   1. Registre um buffer de lavagem digitando um nome para ele no campo Nome . Selecione Auxiliar no campo Tipo . Clique em Salvar.
   2. Registre uma solução de bloqueio repetindo as mesmas etapas acima (modificadas conforme aplicável, por exemplo, no campo Nome ), mas selecionando Anticorpo primário no campo Tipo . Selecione os protocolos desejados nas caixas suspensas para Protocolo de Coloração Padrão e Protocolo HIER Padrão. Selecione uma opção Default Enzyme Protocol , se desejado (esta caixa foi deixada em branco no protocolo atual). Clique em Salvar.
2. Registre o Sistema de Detecção, que consiste em uma bandeja de contêiner de reagente com código de barras. Digitalize o código de barras.
   1. Comece a inserir os detalhes do sistema de reagentes na janela Adicionar Sistema de Reagente de Pesquisa . Digite um Nome para o sistema de detecção.
   2. Digite uma Data de validade. Realce a primeira linha do gráfico de Reagentes e Digitalize o Código de Barras de um novo Recipiente de Reagente de 30 mL, momento em que o código de barras preencherá a linha 1.
   3. Coloque o recipiente na posição 1 do Sistema de Detecção. Selecione o nome do buffer de lavagem na caixa suspensa da coluna Reagente e clique em Adicionar. Repita essas etapas para adicionar reagentes adicionais em linhas subsequentes, incluindo a solução de bloqueio.
3. Configure o Protocolo de Proteína para IHC. Clique em Configuração do protocolo. Destaque a linha correspondente ao protocolo desejado e clique em Copiar. Insira o Nome e preencha quaisquer outros campos relevantes na janela Editar Propriedades do Protocolo .
   1. Marque a caixa para Mostrar etapas de lavagem. Confirme se os campos Inc (min) e DispenseType estão corretos para cada reagente (10 min para a Solução de Bloqueio, 0 min para o Buffer de Lavagem e 150 μL para cada DispenseType). Clique em Salvar.
4. Prepare o estudo. Encha o recipiente na posição 1 com um tampão de lavagem. Preencher 150 μL por lâmina e 5 mL de volume morto; deixe a tampa aberta. Repita estas etapas para o recipiente na posição 2, que deve ser preenchido com uma Solução de Bloqueio. Este recipiente deve ter 150 μL por lâmina e 350 μL de volume morto.
   1. Carregue a bandeja do contêiner do reagente na máquina. Permita que o sistema execute medidas de reconhecimento de contêiner e confirmação de volume. Clique em Configuração de Slides | Adicionar estudo. Insira o ID do estudo e o nome do estudo e selecione 150 μL em Volume de distribuição | o protocolo desejado na lista suspensa Protocolo de Preparação (Bake and Dewax é sugerido). Destaque o estudo e clique em Adicionar slide.
   2. Selecione Tecido de teste em Tipo de tecido | 150 μL em Volume de dosagem | Único e Rotina nas caixas suspensas Modo de Mancha . Selecione um Processo (IHC para o presente estudo) | o Nome da Solução de Bloqueio na caixa suspensa do campo Marcador | Protocolo IHC DSP no campo de coloração da guia Protocolos | * Assar e Definar para Preparação | *HIER 20 min com ER1 para HIER. Deixe o campo Enzima em branco.
   3. Repita esse processo para cada slide. Clique em Fechar uma vez terminado e, em seguida, clique em Imprimir etiquetas. Verifique todas as etiquetas de slides ainda não impressas para o estudo atual e clique em Imprimir. Afixe etiquetas na parte superior dos slides.
5. Carregue e execute slides. Carregue os slides na bandeja deslizante, garantindo que a amostra e o rótulo estejam voltados para cima. Coloque os mosaicos da tampa sobre os slides, garantindo que os slides estejam orientados com abas na parte inferior. Carregue as bandejas deslizantes no instrumento.
   1. Pressione o botão LED para abaixar a bandeja e permitir que o instrumento inicie a digitalização e o reconhecimento de slides. Clique no botão Iniciar para iniciar o experimento.
6. Termine o experimento. Pressione o botão LED quando ele piscar para verde, indicando a conclusão da execução. Remova a bandeja do instrumento e levante cuidadosamente as telhas da tampa de cada slide. Coloque as lâminas em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), remova o excesso de tampão e contorne cada seção de tecido com uma caneta hidrofóbica para criar uma barreira hidrofóbica.

3. Incubação de anticorpos e coloração de núcleos¹⁷

1. Seleccione um painel de anticorpos para localizar os antigénios de interesse (ver Tabela 1 para os anticorpos utilizados nesta experiência).
   NOTA: Cada anticorpo já foi conjugado a um oligonucleotídeo de DNA com um segmento UV-fotoclivista (PC-oligo) que o identifica exclusivamente (oligos indexantes, Figura 2).
2. Fazer uma solução de trabalho anticorpo-PC-oligo adicionando, para cada lâmina, 8 μL de cada anticorpo (diluído 1:40) no painel. Use o reagente de bloqueio como diluente para atingir o volume final de 200 μL para cada lâmina. Incubar durante a noite a 4 °C (Figura 3, Passo 1).
   NOTA: Marcadores morfológicos, corantes biológicos ou anticorpos marcados fluorescentemente também podem ser adicionados à solução nesta etapa.
3. No dia seguinte, coloque a lâmina em um frasco Coplin e lave 3 x 10 min em 1x TBS-T. Postfix em paraformaldeído a 4% por 30 min à temperatura ambiente, seguido de 2 x 5 min em 1x TBS-T.
4. Adicione a mancha nuclear SYTO13 (diluída 1:10 em 1x TBS) por 15 min à temperatura ambiente. Lave 2x com 1x TBS-T e, em seguida, armazene a lâmina em 1x TBS-T.

4. Visualização por fluorescência, identificação do ROI e fotoclivagem UV no instrumento DSP¹⁷

1. Depois de passar o mouse sobre a Coleta de Dados na Central de Controle, selecione Novo/Continuar Executar.
2. Coloque o slide no suporte do slide, com o rótulo em direção ao usuário. Abaixe a braçadeira da bandeja deslizante, garantindo que o tecido esteja visível na janela alongada. Adicione 6 mL de tampão S.
3. Siga as instruções na Central de Controle. Aplique zoom entre diferentes eixos com os controles deslizantes X e Y para delinear uma região para digitalização. Selecione Digitalizar. Permita que a varredura prossiga até que toda a área de destino definida tenha sido visualizada.
4. Gere uma imagem de 20x. Defina os ROIs automática ou manualmente (Figura 3, Etapa 2). Para seguir esse protocolo, selecione três ROIs circulares de tamanho igual (diâmetro de 250 μm) para cada núcleo de tecido (Figura 4, abaixo).
   NOTA: Os ROIs são personalizáveis em tamanho e forma. Vários ROIs podem ser selecionados dentro de cada seção. Neste experimento, os ROIs circulares são definidos manualmente.
5. Aprove os ROIs clicando no botão Sair do Espaço de Trabalho de Digitalização . Espere que a luz UV colha os oligos dos anticorpos.
6. Quando o processo do Instrumento de Limpeza tiver sido concluído, selecione Nova Coleta de Dados para continuar com os slides ou chapas atuais. Caso contrário, selecione Remover slides e microplaca.
7. Abra a janela Finalizar placa clicando duas vezes na área do ícone da placa no canto inferior direito da Central de controle. Se o número de lote do Pacote de Código de Hibridização (Hyb ) (#) for conhecido, insira o número e clique em Atualizar (opcional durante esta etapa). Clique em Finalizar.
8. Desprenda o suporte do slide e a placa de coleta seguindo as instruções. Armazene os slides em TBS-T. Se as lâminas não forem usadas por um longo tempo, cubra-as com um meio aquoso e uma tampa.

5. Leitura de proteínas¹⁷

1. Use uma vedação permeável e seque os aspirados a 65 °C em um termociclador com o topo aberto. Adicionar 7 μL de água tratada com pirocarbonato de dietilo e misturar. Incube no RT por 10 minutos e, em seguida, gire para baixo rapidamente.
2. Escolha as equações R e U da sonda apropriadas na Tabela 2 para orientar a criação da mistura sonda/buffer. Com base no número de Códigos Hyb necessários para a hibridização no presente experimento, aplique a equação (1) conforme abaixo. Misture e gire rapidamente.
   # Hyb Codes Probe R Working Pool Probe U Working Pool Hybridization Buffer n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)
3. Adicione 84 μL de Probe/Buffer Mix a cada Hyb Code Pack a ser usado. Mexa rapidamente para misturar e desfiar. Em uma nova placa de hibridização de 96 poços, adicione 8 μL de cada Hyb Code Master Mix em todos os 12 poços da linha indicada.
4. Transfira 7 μL da placa de coleta DSP para o poço correspondente na placa de hibridização. Misture suavemente. Corte o calor e execute um giro rápido. Em seguida, incubar durante a noite a 67 °C. Esfrie a placa no gelo e faça um giro rápido.
5. Junte os produtos hyb de cada poço em um tubo de tira, canalizando suavemente cada poço 5x para misturar. Tampa o tubo da tira e gire para baixo. Congelar quaisquer produtos de hyb não agrupados remanescentes a -80 °C. Carregue os tubos de tira no sistema de análise.
6. Salve o arquivo CDF em uma unidade USB e, em seguida, transfira os dados do instrumento DSP para o Digital Analyzer. Conclua a configuração executando as etapas a seguir.
   1. Carregue consumíveis e amostras agrupadas na estação de preparação. Na tela, pressione Iniciar processamento. Selecione Alta sensibilidade, seguido de Avançar. Pressione Select All para o número de poços com amostras | Terminar | Em seguida, no | de notificação por e-mail Comece.
   2. Uma vez que a estação de preparação esteja pronta, sele o cartucho e transfira para o analisador digital. Pressione Start Counting, selecione Stage Position, pressione Load Existing CDF file (Carregar arquivo CDF existente) e selecione o arquivo carregado anteriormente. Pressione Concluído, selecione a posição do estágio novamente, pressione Concluído | Comece a executar o programa.
7. Salve o arquivo compactado dos arquivos de conversão de contagem do repórter do sistema de análise em uma unidade USB e insira a unidade na máquina DSP. No Centro de Controle de DSP, passe o mouse sobre Coleta de Dados e clique em Carregar Contagens. Selecione o arquivo compactado relevante.

6. Análise dos dados¹⁷

1. Clique em Registros no Centro de Controle DSP. Para exibir varreduras na fila, selecione Adicionar varreduras selecionadas à fila | Minha fila de análise. Selecione Novo Estudo na Fila depois de passar o mouse sobre a opção Análise de Dados na Central de Controle.
2. Escolha QC nas Opções da Barra de Tarefas. Continue com os valores padrão ou ajuste, se desejar. Selecione Executar QC e revise a Grade de Resultados. Clique em Executar QC para prosseguir e criar um novo conjunto de dados, normalizando os valores para os controles de hibridização positiva.
3. Importe as novas tags para um arquivo XLSX. Selecione Gerenciar anotações no painel Verificações e baixe um modelo, insira as marcas e importe o arquivo.
4. OPCIONAL: Depois de executar o QC, ajuste os dados ainda mais usando outras opções da barra de ferramentas. Use ferramentas no painel Visualizações para plotar os dados transformados.
5. Navegue pela caixa suspensa cinza de parâmetros para compor cada gráfico no painel Visualizações . Selecione uma região específica dentro de um gráfico para visualizar os segmentos realçados correspondentes no painel Digitalizações e clique com o botão direito do mouse para gerar marcas ou grupos. No Resumo do Conjunto de Dados, revise os gráficos de Normalização, Dimensionamento e outras opções para análise e exibição.
6. Salve uma visualização selecionando o ícone para Salvar; revise visualizações já salvas em Resumo. Selecione o botão Exportar (.svg) para exportar uma visualização no formato .svg. Exporte os dados nos quais uma visualização se baseia clicando no botão Exportar (.xlsx ). Exporte todos os dados contidos em um conjunto de dados específico passando o cursor sobre o nome do conjunto de dados no segundo painel e clicando no ícone de exportação .

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Resultados

A Figura 4 mostra os resultados representativos de um experimento de DSP realizado em amostras de glioblastoma. Um mapa de calor é apresentado, ilustrando um dos métodos pelos quais capturar dados visualmente usando o software DSP. As linhas representam alvos proteicos e cada coluna corresponde a uma região de interesse. Um intervalo de cores de azul a vermelho denota expressão baixa a alta, respectivamente. A variabilidade da cor dentro de uma linha reflete a heterogeneidade da proteín...

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Discussão

Dada a diversidade de proteínas que poderiam potencialmente influenciar a agressividade dos gliomas e a noção de que várias dessas proteínas permanecem desconhecidas, um método de quantificação de proteínas de alto rendimento é uma abordagem tecnológica ideal. Além disso, dado que os dados espaciais em amostras oncológicas muitas vezes se correlacionam com a expressão diferencial¹⁸, a incorporação do perfil espacial na abordagem de quantificação de proteínas permite uma análise...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit--12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block