Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto

Riepilogo

La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L'elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l'espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all'invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.

Abstract

I gliomi diffusamente infiltranti sono associati ad elevata morbilità e mortalità a causa della natura infiltrativa della diffusione del tumore. Sono tumori morfologicamente complessi, con un alto grado di variabilità proteomica sia nel tumore stesso che nel suo microambiente eterogeneo. Il potenziale maligno di questi tumori è potenziato dalla disregolazione delle proteine coinvolte in diversi percorsi chiave, compresi i processi che mantengono la stabilità cellulare e preservano l'integrità strutturale del microambiente. Sebbene ci siano state numerose analisi di glioma bulk e monocellulari, c'è una relativa scarsità di stratificazione spaziale di questi dati proteomici. La comprensione delle differenze nella distribuzione spaziale dei fattori tumorigenici e delle popolazioni di cellule immunitarie tra il tumore intrinseco, il bordo invasivo e il microambiente offre preziose informazioni sui meccanismi alla base della proliferazione e della propagazione del tumore. La profilazione spaziale digitale (DSP) rappresenta una potente tecnologia che può costituire la base per queste importanti analisi multistrato.

DSP è un metodo che quantifica in modo efficiente l'espressione proteica all'interno di regioni spaziali specificate dall'utente in un campione di tessuto. La DSP è ideale per studiare l'espressione differenziale di più proteine all'interno e tra le regioni di distinzione, consentendo più livelli di analisi quantitativa e qualitativa. Il protocollo DSP è sistematico e facile da usare, consentendo un'analisi spaziale personalizzata dei dati proteomici. In questo esperimento, i microarray tissutali sono costruiti da biopsie del nucleo di glioblastoma archiviate. Successivamente, viene selezionato un pannello di anticorpi, mirando alle proteine di interesse all'interno del campione. Gli anticorpi, che sono preconiugati a oligonucleotidi del DNA fotoscisvivi UV, vengono quindi incubati con il campione di tessuto durante la notte. Sotto la visualizzazione al microscopio a fluorescenza degli anticorpi, le regioni di interesse (ROI) all'interno delle quali quantificare l'espressione proteica sono definite con i campioni. La luce UV viene quindi diretta ad ogni ROI, fendendo gli oligonucleotidi del DNA. Gli oligonucleotidi sono microaspirati e contati all'interno di ciascun ROI, quantificando la proteina corrispondente su base spaziale.

Introduzione

I gliomi diffusamente infiltranti sono il tipo più comune di tumore cerebrale maligno negli adulti e sono invariabilmente letali. La propensione delle cellule di glioma a migrare ampiamente nel cervello è una grande sfida terapeutica. Il meccanismo con cui si diffondono comporta la migrazione diretta e l'invasione incontrollata. Le cellule di glioma invasive hanno dimostrato di esibire tropismo e migrazione lungo i tratti di sostanza bianca¹, con recenti ricerche che implicano la demielinizzazione di questi tratti come una caratteristica protumorigenica attiva². L'invasione è mediata da una transizione epiteliale-mesenchimale, in cui le cellule di glioma acquisiscono proprietà mesenchimali riducendo l'espressione di geni codificanti proteine della matrice extracellulare e molecole di adesione cellulare, amplificando la migrazione e facilitando la propagazione attraverso il microambiente tumorale ^3,4,5.

A livello molecolare, è stata dimostrata la rottura di diverse proteine che conferiscono stabilità cellulare e interfaccia con componenti immunogenici⁶. È noto che i gliomi infiltrativi subiscono la soppressione di proteine con proprietà anti-apoptotiche (ad esempio, PTEN)⁷. Inoltre sovraesprimono proteine che promuovono l'evasione della risposta immunitaria dell'ospite (ad esempio, PD1 / PDL1)⁸. La disregolazione di queste vie complesse aumenta la tumorigenicità e aumenta il potenziale maligno.

All'interno di campioni di glioma invasivo, l'obiettivo era quello di valutare l'espressione differenziale di proteine chiave per la crescita, la sopravvivenza e la proliferazione cellulare e per l'integrità strutturale del microambiente tra componenti invasive e non invasive. Inoltre, abbiamo cercato di studiare la regolazione differenziale delle proteine con un ruolo immunogenico attivo, offrendo informazioni sul meccanismo attraverso il quale le difese immunitarie dell'ospite compromesso possono aumentare il potenziale proliferativo e invasivo dei gliomi. Ciò è particolarmente rilevante data la recente ampiezza della ricerca che dimostra come i marcatori immunitari e i driver della disregolazione nella malignità possano servire come bersagli dell'immunoterapia. L'identificazione di bersagli terapeutici praticabili tra le molte proteine coinvolte nell'immunosorveglianza e nella reattività richiede un approccio altamente sensibile e completo.

Data l'ampia gamma di proteine candidate che possono essere studiate, abbiamo cercato un metodo simile all'immunoistochimica ma con una maggiore efficienza di elaborazione dei dati. Nel campo della biologia del cancro, DSP è emersa come una potente tecnologia con importanti vantaggi rispetto agli strumenti alternativi per l'analisi proteomica e la quantificazione. Il segno distintivo del DSP è la sua capacità di multiplexing ad alto rendimento, che consente lo studio simultaneo di diverse proteine all'interno di un campione, segnando un'importante distinzione dalle tecnologie standard ma a basso plex come l'immunoistochimica (IHC)^9,10. La caratteristica multiplex del DSP non ne compromette la fedeltà come strumento quantitativo e analitico, come dimostrato da studi che confrontano DSP e IHC. Quando viene utilizzato per la quantificazione proteomica di campioni di carcinoma polmonare non a piccole cellule, ad esempio, DSP ha dimostrato di avere risultati simili a IHC¹¹. Inoltre, DSP offre specifiche regionali personalizzabili, in cui gli utenti possono definire manualmente le regioni all'interno delle quali eseguire l'analisi proteomica. Ciò presenta un vantaggio rispetto ai metodi multiplex a sezione intera^10,12. In un unico ciclo di elaborazione, DSP offre quindi più livelli di analisi esaminando diversi bersagli proteici in più regioni di interesse.

DSP ha applicazioni in diversi contesti patologici. La DSP è particolarmente vantaggiosa nell'analisi oncologica, poiché la variazione spaziale può essere correlata alla trasformazione cellulare e all'espressione differenziale delle proteine. Ad esempio, DSP è stato utilizzato per confrontare il profilo proteomico del cancro al seno con il microambiente tumorale adiacente. Ciò comporta importanti implicazioni per la comprensione della storia naturale di questo tumore e della sua progressione, nonché della potenziale risposta al trattamento¹³. Ulteriori contesti che illustrano la versatilità della DSP includono la quantificazione spaziale della diversità proteica nel carcinoma prostatico¹⁴, l'associazione dell'espressione dei marcatori delle cellule immunitarie con la progressione della malattia nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo 15 e la dimostrazione di un gradiente epiteliale-mesenchimale dell'espressione proteica che distingue il carcinoma ovarico metastatico da quello primario a cellule chiare¹⁶ . Implementando la DSP, caratterizziamo la topografia spaziale delle proteine che potrebbero influenzare la tumorigenesi e l'invasione dei gliomi.

Protocollo

Il protocollo descritto di seguito segue le linee guida del Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti i cui campioni di tessuto sono stati inclusi in questo studio. Vedere la sezione Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti, le apparecchiature e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione della diapositiva¹⁷

1. Recuperare o preparare tessuto fissato in formalina, incorporato in paraffina da gliomi infiltranti diffusamente di tipo adulto umano.
   NOTA: In questo esperimento, sono stati utilizzati blocchi di biopsie incorporati in paraffina di tre pazienti con glioblastoma.
2. Creare un blocco di microarray tissutale (TMA). Prendi diversi nuclei di 2 mm da ogni biopsia e mettili in un singolo blocco TMA (Figura 1, in alto). Tagliare le sezioni dal blocco TMA a 4 μm e montarle su vetrini. Posizionare ogni diapositiva all'interno della guarnizione del portaslitte. Incubare il vetrino a 60 °C per 30 min.

2. Preparazione semi-automatica del sistema IHC e configurazione del software (per il caricamento e l'esecuzione delle diapositive)¹⁷

1. Impostare i reagenti. Fare clic sul pulsante Reagent Setup (Configurazione reagente ). Fare clic su Aggiungi nella scheda Configurazione .
   1. Registrare un wash buffer digitando un nome nel campo Nome . Selezionare Ancillary nel campo Tipo . Clicca su Salva.
   2. Registrare una soluzione di blocco ripetendo gli stessi passaggi di cui sopra (modificati se applicabile, ad esempio, nel campo Nome ), ma selezionando Anticorpo primario nel campo Tipo . Selezionare i protocolli desiderati nelle caselle a discesa per Default Staining Protocol e Default HIER Protocol. Selezionare un'opzione Protocollo enzimatico predefinito , se lo si desidera (questa casella è stata lasciata vuota nel protocollo corrente). Clicca su Salva.
2. Registrare il sistema di rilevamento, costituito da un vassoio contenitore di reagenti con codice a barre. Scansiona il codice a barre.
   1. Iniziare a immettere i dettagli del sistema di reagenti nella finestra Aggiungi sistema di reagenti di ricerca . Digitare un Nome per il sistema di rilevamento.
   2. Digitare una data di scadenza. Evidenziare la prima riga del grafico dei reagenti e scansionare il codice a barre di un nuovo contenitore di reagenti da 30 ml, momento in cui il codice a barre popolerà la riga 1.
   3. Posizionare il contenitore nella posizione 1 del sistema di rilevamento. Selezionare il nome del wash buffer nella casella a discesa della colonna Reagente e fare clic su Aggiungi. Ripetere questi passaggi per aggiungere eventuali reagenti aggiuntivi nelle righe successive, inclusa la soluzione di blocco.
3. Impostare il protocollo proteico per IHC. Fare clic su Impostazione protocollo. Evidenziare la riga corrispondente al protocollo desiderato e fare clic su Copia. Immettere il Nome e compilare tutti gli altri campi pertinenti nella finestra Modifica proprietà protocollo .
   1. Selezionare la casella Mostra passaggi di lavaggio. Verificare che i campi Inc (min) e DispenseType siano corretti per ciascun reagente (10 min per la soluzione bloccante, 0 min per il tampone di lavaggio e 150 μL per ogni DispenseType). Clicca su Salva.
4. Prepara lo studio. Riempire il contenitore in posizione 1 con un tampone di lavaggio. Riempire 150 μL per vetrino e 5 ml di volume morto; Lasciare il coperchio aperto. Ripetere questi passaggi per il contenitore nella posizione 2, che deve essere riempito con una soluzione di blocco. Questo contenitore dovrebbe avere 150 μL per vetrino e 350 μL di volume morto.
   1. Caricare il vassoio del contenitore dei reagenti sulla macchina. Consentire al sistema di eseguire misure di riconoscimento del contenitore e conferma del volume. Fare clic su Slide Setup | Aggiungi studio. Inserire l'ID dello studio e il nome dello studio e selezionare 150 μL in Volume di erogazione | il protocollo desiderato nel menu a discesa Protocollo di preparazione (si consiglia Bake and Dewax ). Evidenzia lo studio e fai clic su Aggiungi diapositiva.
   2. Selezionare il tessuto in esame sotto Tipo di tessuto | 150 μL in Volume di erogazione | Singolo e Routine dalle caselle a discesa Modalità colorazione . Selezionare un processo (IHC per lo studio corrente) | il nome della soluzione di blocco nella casella a discesa del campo Marcatore | Protocollo DSP IHC nel campo Colorazione della scheda Protocolli | * Cuocere e decerare per la preparazione | *HIER 20 minuti con ER1 per HIER. Lasciare vuoto il campo Enzima .
   3. Ripetere questa procedura per ogni diapositiva. Fare clic su Chiudi una volta terminato, quindi fare clic su Stampa etichette. Controllare tutte le etichette diapositiva non ancora stampate per lo studio corrente e fare clic su Stampa. Applicare etichette sulla parte superiore delle diapositive.
5. Caricare ed eseguire diapositive. Caricare le diapositive sul vassoio di scorrimento, assicurandosi che il campione e l'etichetta siano rivolti verso l'alto. Posiziona i riquadri di copertura sopra le diapositive, assicurandoti che le diapositive siano orientate con le schede nella parte inferiore. Caricare i vassoi di scorrimento sullo strumento.
   1. Premere il pulsante LED per abbassare il vassoio e consentire allo strumento di iniziare la scansione e il riconoscimento delle diapositive. Fare clic sul pulsante Start per iniziare l'esperimento.
6. Completa l'esperimento. Premere il pulsante LED quando lampeggia in verde, indicando il completamento dell'esecuzione. Rimuovere il vassoio dallo strumento e sollevare con attenzione le piastrelle di copertura da ogni vetrino. Posizionare i vetrini in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), rimuovere il tampone in eccesso e delineare ogni sezione di tessuto con una penna idrofobica per creare una barriera idrofobica.

3. Incubazione di anticorpi e colorazione dei nuclei¹⁷

1. Selezionare un pannello di anticorpi per localizzare gli antigeni di interesse (vedere Tabella 1 per gli anticorpi utilizzati in questo esperimento).
   NOTA: Ogni anticorpo è già stato coniugato ad un oligonucleotide del DNA con un segmento UV-fotosciavabile (PC-oligo) che lo identifica in modo univoco (oligo indicizzatori, Figura 2).
2. Realizzare una soluzione anticorpo-PC-oligo funzionante aggiungendo, per ogni vetrino, 8 μL di ciascun anticorpo (diluito 1:40) nel pannello. Utilizzare il reagente bloccante come diluente per raggiungere il volume finale di 200 μL per ogni vetrino. Incubare per una notte a 4 °C (Figura 3, Fase 1).
   NOTA: marcatori morfologici, coloranti biologici o anticorpi marcati con fluorescenza possono anche essere aggiunti alla soluzione in questa fase.
3. Il giorno successivo, posizionare il vetrino in un barattolo Coplin e lavare 3 x 10 minuti in 1x TBS-T. Postfisso in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da 2 x 5 minuti in 1x TBS-T.
4. Aggiungere la macchia nucleare SYTO13 (diluita 1:10 in 1x TBS) per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare 2x con 1x TBS-T, quindi conservare il vetrino in 1x TBS-T.

4. Visualizzazione della fluorescenza, identificazione del ROI e fotoscissione UV sullo strumento DSP¹⁷

1. Dopo aver passato il mouse sopra Raccolta dati nel Centro di controllo, selezionare Nuovo/Continua esecuzione.
2. Posizionare la diapositiva nel portavetrina, con l'etichetta rivolta verso l'utente. Abbassare il morsetto del vassoio di scorrimento, assicurandosi che il tessuto sia visibile nella finestra allungata. Aggiungere 6 mL di Buffer S.
3. Seguire le istruzioni nel Centro di controllo. Ingrandisci tra diversi assi con i cursori X e Y per delineare una regione per la scansione. Seleziona Scansione. Consentire la scansione fino a quando non è stata ripresa l'intera area di destinazione definita.
4. Genera un'immagine 20x. Definire il ROI automaticamente o manualmente (Figura 3, Passaggio 2). Per seguire questo protocollo, selezionare tre ROI circolari di dimensioni uguali (diametro di 250 μm) per ciascun nucleo di tessuto (Figura 4, in basso).
   NOTA: i ROI sono personalizzabili in termini di dimensioni e forma. È possibile selezionare diversi ROI all'interno di ogni sezione. In questo esperimento, i ROI circolari vengono definiti manualmente.
5. Approvare i ROI facendo clic sul pulsante Esci dall'area di lavoro di scansione . Attendere che la luce UV scissa gli oligo dagli anticorpi.
6. Quando il processo di pulizia dello strumento è stato completato, selezionare Nuova raccolta dati per continuare con le diapositive o la piastra corrente. In caso contrario, selezionare Rimuovi diapositive e micropiastra.
7. Aprire la finestra Finalizza piastra facendo doppio clic sull'area dell'icona della piastra in basso a destra del Centro di controllo. Se il numero di lotto del Code Pack di ibridazione (Hyb ) (#) è noto, immettere il numero e fare clic su Aggiorna (facoltativo durante questo passaggio). Fare clic su Finalizza.
8. Staccare il portavetrini e la piastra di raccolta seguendo le istruzioni. Conservare le diapositive in TBS-T. Se i vetrini non verranno utilizzati per un lungo periodo, coprirli con un mezzo acquoso e un coprifoglio.

5. Lettura delle proteine¹⁷

1. Utilizzare una guarnizione permeabile e asciugare gli aspirati a 65 °C in un termociclatore con la parte superiore aperta. Aggiungere 7 μL di acqua trattata con dietil pirocarbonato e mescolare. Incubare a RT per 10 minuti, quindi girare rapidamente.
2. Scegliere le equazioni R e U della sonda appropriate dalla Tabella 2 per guidare la creazione della miscela sonda/tampone. Sulla base del numero di codici Hyb necessari per l'ibridazione nel presente esperimento, applicare l'equazione (1) come di seguito. Mescolare e centrifugare rapidamente.
   # Hyb Codes Probe R Working Pool Probe U Working Pool Hybridization Buffer n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)
3. Aggiungere 84 μL di Probe/Buffer Mix a ciascun Hyb Code Pack da utilizzare. Scorri per mescolare e girare. In una nuova piastra di ibridazione a 96 pozzetti, aggiungere 8 μL di ciascuna miscela Master di Hyb Code in tutti i 12 pozzetti della fila indicata.
4. Trasferire 7 μL dalla piastra di raccolta DSP al pozzetto corrispondente nella piastra di ibridazione. Mescolare delicatamente. Sigillare a caldo ed eseguire una rapida centrifuga. Quindi, incubare per una notte a 67 ° C. Raffreddare il piatto sul ghiaccio ed eseguire un giro veloce.
5. Raggruppare i prodotti hyb da ciascun pozzetto in un tubo a striscia, convogliando delicatamente ogni pozzetto 5 volte per mescolare. Tappare il tubo della striscia e girare verso il basso. Congelare eventuali prodotti hyb rimanenti non raggruppati a -80 °C. Caricare i tubi a nastro nel sistema di analisi.
6. Salvare il file CDF su un'unità USB, quindi trasferire i dati dallo strumento DSP all'analizzatore digitale. Completare la configurazione eseguendo i passaggi seguenti.
   1. Caricare materiali di consumo e campioni raggruppati sulla stazione di preparazione. Sullo schermo, premere Avvia elaborazione. Selezionare Alta sensibilità, quindi Avanti. Premere Seleziona tutto per il numero di pozzi con campioni | Finisci | Avanti sulla notifica e-mail | Inizio.
   2. Una volta terminata la stazione di preparazione, sigillare la cartuccia e trasferirla all'analizzatore digitale. Premere Start Counting, selezionare Stage Position, premere Load Existing CDF file e selezionare il file precedentemente caricato. Premete Fine, selezionate nuovamente la posizione dello stage, premete Fine | Avviare l'esecuzione del programma.
7. Salvare il file compresso dei file di conversione del conteggio reporter dal sistema di analisi a un'unità USB, quindi inserire l'unità nella macchina DSP. Nel Centro di controllo DSP, passare il puntatore del mouse su Raccolta dati, quindi fare clic su Conteggi caricamento. Selezionare il file compresso pertinente.

6. Analisi dei dati¹⁷

1. Fare clic su Record nel Centro di controllo DSP. Per visualizzare le scansioni nella coda, selezionare Aggiungi scansioni selezionate alla coda | La mia coda di analisi. Selezionare Nuovo studio dalla coda dopo aver passato il puntatore del mouse sull'opzione Analisi dati nel Centro di controllo.
2. Scegliere Controllo qualità da Opzioni barra delle applicazioni. Continuare con i valori predefiniti o modificarli se lo si desidera. Selezionare Esegui controllo qualità ed esaminare la griglia dei risultati. Fare clic su Esegui QC per procedere e creare un nuovo set di dati, normalizzando i valori ai controlli di ibridazione positiva.
3. Importare i nuovi tag in un file XLSX. Selezionare Gestisci annotazioni nel riquadro Scansioni , quindi scaricare un modello, inserire i tag e importare il file.
4. FACOLTATIVO: dopo aver eseguito QC, regolare ulteriormente i dati utilizzando altre opzioni della barra degli strumenti. Utilizzare gli strumenti nel riquadro Visualizzazioni per tracciare i dati trasformati.
5. Spostarsi nella casella grigia a discesa dei parametri per comporre ogni grafico nel riquadro Visualizzazioni . Selezionare una particolare regione all'interno di un grafico per visualizzare i segmenti evidenziati corrispondenti nel riquadro Scansioni e fare clic con il pulsante destro del mouse per generare tag o gruppi. All'interno di Riepilogo set di dati, rivedere i grafici da Normalizzazione, Ridimensionamento e altre opzioni per l'analisi e la visualizzazione.
6. Salvare una visualizzazione selezionando l'icona da salvare; rivedere le visualizzazioni già salvate in Riepilogo. Selezionare il pulsante Esporta (.svg) per esportare una visualizzazione in formato .svg. Esportare i dati su cui si basa una visualizzazione facendo clic sul pulsante Esporta (.xlsx). Esportare tutti i dati contenuti all'interno di un set di dati specifico posizionando il cursore sul nome del set di dati nel secondo riquadro e facendo clic sull'icona di esportazione .

Risultati

La Figura 4 mostra i risultati rappresentativi di un esperimento DSP eseguito su campioni di glioblastoma. Viene presentata una mappa di calore, che illustra uno dei metodi con cui acquisire visivamente i dati utilizzando il software DSP. Le righe rappresentano i bersagli proteici e ogni colonna corrisponde a una regione di interesse. Una gamma di colori dal blu al rosso denota rispettivamente un'espressione da bassa ad alta. La variabilità del colore all'interno di una riga riflette l'eter...

Discussione

Data la diversità delle proteine che potrebbero potenzialmente influenzare l'aggressività dei gliomi e l'idea che molte di queste proteine rimangono sconosciute, un metodo di quantificazione delle proteine ad alto rendimento è un approccio tecnologico ideale. Inoltre, dato che i dati spaziali nei campioni oncologici sono spesso correlati con l'espressione differenziale¹⁸, incorporare la profilazione spaziale nell'approccio di quantificazione delle proteine consente un'analisi più efficace.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit--12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block