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Diese Studie stellt ein detailliertes Verfahren zur Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten (smFRET) an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) unter Verwendung ortsspezifischer Markierung durch unnatürliche Aminosäureinkorporation (UAA) vor. Das Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung von smFRET-Proben, Experimente und Datenanalysen.
Die Fähigkeit von Zellen, auf externe Signale zu reagieren, ist für die Zellentwicklung, das Wachstum und das Überleben unerlässlich. Um auf ein Signal aus der Umgebung reagieren zu können, muss eine Zelle in der Lage sein, es zu erkennen und zu verarbeiten. Diese Aufgabe beruht hauptsächlich auf der Funktion von Membranrezeptoren, deren Aufgabe es ist, Signale in die biochemische Sprache der Zelle umzuwandeln. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie von Membranrezeptorproteinen beim Menschen. Unter den GPCRs sind metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) eine einzigartige Unterklasse, die als obligate Dimere fungieren und eine große extrazelluläre Domäne besitzen, die die Ligandenbindungsstelle enthält. Jüngste Fortschritte in Strukturstudien von mGluRs haben das Verständnis ihres Aktivierungsprozesses verbessert. Die Ausbreitung großräumiger Konformationsänderungen durch mGluRs während der Aktivierung und Modulation ist jedoch kaum verstanden. Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine leistungsstarke Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der Strukturdynamik von Biomolekülen auf Einzelproteinebene. Um den dynamischen Prozess der mGluR2-Aktivierung zu visualisieren, wurden fluoreszierende Konformationssensoren auf Basis des Einbaus von unnatürlichen Aminosäuren (UAA) entwickelt, die eine ortsspezifische Proteinmarkierung ohne Störung der nativen Struktur von Rezeptoren ermöglichten. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie diese Experimente durchzuführen sind, einschließlich des neuartigen UAA-Markierungsansatzes, der Probenvorbereitung und der smFRET-Datenerfassung und -analyse. Diese Strategien sind verallgemeinerbar und können erweitert werden, um die Konformationsdynamik einer Vielzahl von Membranproteinen zu untersuchen.
Die Übertragung von Informationen über die Plasmamembran hängt stark von der Funktion der Membranrezeptorenab 1. Die Bindung von Liganden an einen Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung und Rezeptoraktivierung. Dieser Prozess ist oft allosterischer Natur2. Mit über 800 Mitgliedern sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die größte Familie von Membranrezeptoren beim Menschen3. Aufgrund ihrer Rolle in fast allen zellulären Prozessen sind GPCRs zu wichtigen Zielen für die therapeutische Entwicklung geworden. Im kanonischen Modell der GPCR-Signalübertragung führt die Agonistenaktivierung z....
Der gesamte Workflow des Protokolls wird in Abbildung 1 beschrieben.
1. Vorbereitung der Probenkammer
Expression und fluoreszierende Markierung des UAA-basierten FRET-Sensors
Hier werden beispielhafte Ergebnisse der Insertion und Fluoreszenzmarkierung einer LF (AZP) innerhalb der CRD von mGluR2 (548UAA) diskutiert11. Wie bereits erwähnt, ist zum Einfügen von AZP in mGluR2 die Koexpression der technischen translationalen Maschinerie erforderlich, die eine modifizierte tRNA-Synthetase und komplementäre tRNA (pIRE4-Azi) und mGluR2 mit einem bernsteinfarbenen Codon an Position 5.......
GPCRs sind Proteine, die auf der Zellmembran arbeiten, um die Signaltransduktion einzuleiten. Viele GPCRs bestehen aus mehreren Domänen, wobei die Signalisierung von der kooperativen Interaktion zwischen den Domänen abhängt. Um die Eigenschaften dieser Membranrezeptoren zu modulieren, ist es wichtig, das dynamische Verhalten der verschiedenen Domänen zu verstehen. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine Fluoreszenztechnik, die die Messung von Proteinkonformation und -dynamik in Echtzeit e.......
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Wir danken den Mitgliedern des Reza Vafabakhsh Labors für die Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschuss R01GM140272 (an R.V.), vom Searle Leadership Fund for the Life Sciences an der Northwestern University und vom Chicago Biomedical Consortium mit Unterstützung der Searle Funds des Chicago Community Trust (an R.V.) unterstützt. B.W.L. wurde vom National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061 unterstützt.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
(+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
DMEM | Corning | 10-013-CV | |
EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
Image splitter | OptoSplit II | ||
KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
Trolox | Sigma | 53188-07 |
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