Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Studie stellt ein detailliertes Verfahren zur Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten (smFRET) an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) unter Verwendung ortsspezifischer Markierung durch unnatürliche Aminosäureinkorporation (UAA) vor. Das Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung von smFRET-Proben, Experimente und Datenanalysen.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit von Zellen, auf externe Signale zu reagieren, ist für die Zellentwicklung, das Wachstum und das Überleben unerlässlich. Um auf ein Signal aus der Umgebung reagieren zu können, muss eine Zelle in der Lage sein, es zu erkennen und zu verarbeiten. Diese Aufgabe beruht hauptsächlich auf der Funktion von Membranrezeptoren, deren Aufgabe es ist, Signale in die biochemische Sprache der Zelle umzuwandeln. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie von Membranrezeptorproteinen beim Menschen. Unter den GPCRs sind metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) eine einzigartige Unterklasse, die als obligate Dimere fungieren und eine große extrazelluläre Domäne besitzen, die die Ligandenbindungsstelle enthält. Jüngste Fortschritte in Strukturstudien von mGluRs haben das Verständnis ihres Aktivierungsprozesses verbessert. Die Ausbreitung großräumiger Konformationsänderungen durch mGluRs während der Aktivierung und Modulation ist jedoch kaum verstanden. Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine leistungsstarke Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der Strukturdynamik von Biomolekülen auf Einzelproteinebene. Um den dynamischen Prozess der mGluR2-Aktivierung zu visualisieren, wurden fluoreszierende Konformationssensoren auf Basis des Einbaus von unnatürlichen Aminosäuren (UAA) entwickelt, die eine ortsspezifische Proteinmarkierung ohne Störung der nativen Struktur von Rezeptoren ermöglichten. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie diese Experimente durchzuführen sind, einschließlich des neuartigen UAA-Markierungsansatzes, der Probenvorbereitung und der smFRET-Datenerfassung und -analyse. Diese Strategien sind verallgemeinerbar und können erweitert werden, um die Konformationsdynamik einer Vielzahl von Membranproteinen zu untersuchen.

Einleitung

Die Übertragung von Informationen über die Plasmamembran hängt stark von der Funktion der Membranrezeptorenab 1. Die Bindung von Liganden an einen Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung und Rezeptoraktivierung. Dieser Prozess ist oft allosterischer Natur2. Mit über 800 Mitgliedern sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die größte Familie von Membranrezeptoren beim Menschen3. Aufgrund ihrer Rolle in fast allen zellulären Prozessen sind GPCRs zu wichtigen Zielen für die therapeutische Entwicklung geworden. Im kanonischen Modell der GPCR-Signalübertragung führt die Agonistenaktivierung z....

Protokoll

Der gesamte Workflow des Protokolls wird in Abbildung 1 beschrieben.

1. Vorbereitung der Probenkammer

  1. Gleit- und Deckglasreinigung
    HINWEIS: Diese Schritte zielen darauf ab, die Oberflächen der Objektträger sowie die Deckgläser zu reinigen und für die Aminosilanisierung vorzubereiten. Eine kritische Voraussetzung für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimenten an oberflächengebundenen Molekülen ist eine passivierte Oberfläche. Die zuverlässigste und reproduzierbarste Passivierungstechnik besteht darin, inerte Polymerketten kovalent als dichte Schicht an die Glasoberfläche anzubrin....

Ergebnisse

Expression und fluoreszierende Markierung des UAA-basierten FRET-Sensors
Hier werden beispielhafte Ergebnisse der Insertion und Fluoreszenzmarkierung einer LF (AZP) innerhalb der CRD von mGluR2 (548UAA) diskutiert11. Wie bereits erwähnt, ist zum Einfügen von AZP in mGluR2 die Koexpression der technischen translationalen Maschinerie erforderlich, die eine modifizierte tRNA-Synthetase und komplementäre tRNA (pIRE4-Azi) und mGluR2 mit einem bernsteinfarbenen Codon an Position 5.......

Diskussion

GPCRs sind Proteine, die auf der Zellmembran arbeiten, um die Signaltransduktion einzuleiten. Viele GPCRs bestehen aus mehreren Domänen, wobei die Signalisierung von der kooperativen Interaktion zwischen den Domänen abhängt. Um die Eigenschaften dieser Membranrezeptoren zu modulieren, ist es wichtig, das dynamische Verhalten der verschiedenen Domänen zu verstehen. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine Fluoreszenztechnik, die die Messung von Proteinkonformation und -dynamik in Echtzeit e.......

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern des Reza Vafabakhsh Labors für die Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschuss R01GM140272 (an R.V.), vom Searle Leadership Fund for the Life Sciences an der Northwestern University und vom Chicago Biomedical Consortium mit Unterstützung der Searle Funds des Chicago Community Trust (an R.V.) unterstützt. B.W.L. wurde vom National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061 unterstützt.

....

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-Sodium L-AscorbateSigma AldrichCat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanineChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw et al. 2021Transfected construct
Acetic AcidFisher Chemical64-19-7
AcetoneFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride)Cayman Chemical81530
AminosilaneAldrich919-30-2
Bath Sonicator 2.8 LFisher ScientificUltrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEGLaysan Bio IncItem# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Chemistry Tools1237-500
Copper (II) sulfateSigma AldrichCat # 451657-10G
Cover slipVWR16004-306Sample chamber
Cy3 AlkyneClick Chemistry ToolsTA117-5
Cy5 AlkyneClick Chemistry ToolsTA116-5
DDMAnatracePart# D310 1 GMDetergent
DDM-CHS (10:1)AnatracePart# D310-CH210 1 MLDetergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635SemrockNotch filter
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDAndorDU-897UCamera
ET542lpChromaLong pass emission filter
FF640-FDi01SemrockEmission dichroic filter
FLAG-tag antibodyGenscriptA01429
Fluorescent beadInvitrogen T7279TetraSpeck microspheresSpherical bead
Glass slidesFisherfinest12-544-4sample chamber
GlutamateSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Cell line
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Image splitterOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LaserOxxius4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermo Fisher ScientificL3000015Transfection Reagent
MethanolFisher Chemical67-56-1
MicroscopeOlympusOlympus IX83
Milli-Q waterBarnsteadWater Deionizer
m-PEGLaysan Bio IncItem# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635SemrockDichroic mirror
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum mediumThermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Data analysis and graphing software
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
pIRE4-AziAddgenePlasmid # 105829Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromideSigma AldrichCat # P2636
Protocatechuic acid (PCA)HWI group99-50-3
smCamera (Version 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Camera software
Sodium bicarbonateFisherBioReagents144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma1310-73-2
Syringe filterWhatman UNIFLOCat#9914-2502Liquid filtration
TroloxSigma53188-07

Referenzen

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BiochemieAusgabe 186G Protein gekoppelte Rezeptoren GPCRsKonformationsdynamikMembranrezeptorenunnat rliche Aminos urensmFRET

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Forschung

Lehre

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten