Visualisierung der Konformationsdynamik von Membranrezeptoren mit Einzelmolekül-FRET

Zusammenfassung

Diese Studie stellt ein detailliertes Verfahren zur Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten (smFRET) an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) unter Verwendung ortsspezifischer Markierung durch unnatürliche Aminosäureinkorporation (UAA) vor. Das Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung von smFRET-Proben, Experimente und Datenanalysen.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit von Zellen, auf externe Signale zu reagieren, ist für die Zellentwicklung, das Wachstum und das Überleben unerlässlich. Um auf ein Signal aus der Umgebung reagieren zu können, muss eine Zelle in der Lage sein, es zu erkennen und zu verarbeiten. Diese Aufgabe beruht hauptsächlich auf der Funktion von Membranrezeptoren, deren Aufgabe es ist, Signale in die biochemische Sprache der Zelle umzuwandeln. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie von Membranrezeptorproteinen beim Menschen. Unter den GPCRs sind metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) eine einzigartige Unterklasse, die als obligate Dimere fungieren und eine große extrazelluläre Domäne besitzen, die die Ligandenbindungsstelle enthält. Jüngste Fortschritte in Strukturstudien von mGluRs haben das Verständnis ihres Aktivierungsprozesses verbessert. Die Ausbreitung großräumiger Konformationsänderungen durch mGluRs während der Aktivierung und Modulation ist jedoch kaum verstanden. Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine leistungsstarke Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der Strukturdynamik von Biomolekülen auf Einzelproteinebene. Um den dynamischen Prozess der mGluR2-Aktivierung zu visualisieren, wurden fluoreszierende Konformationssensoren auf Basis des Einbaus von unnatürlichen Aminosäuren (UAA) entwickelt, die eine ortsspezifische Proteinmarkierung ohne Störung der nativen Struktur von Rezeptoren ermöglichten. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie diese Experimente durchzuführen sind, einschließlich des neuartigen UAA-Markierungsansatzes, der Probenvorbereitung und der smFRET-Datenerfassung und -analyse. Diese Strategien sind verallgemeinerbar und können erweitert werden, um die Konformationsdynamik einer Vielzahl von Membranproteinen zu untersuchen.

Einleitung

Die Übertragung von Informationen über die Plasmamembran hängt stark von der Funktion der Membranrezeptoren^{ab 1}. Die Bindung von Liganden an einen Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung und Rezeptoraktivierung. Dieser Prozess ist oft allosterischer Natur². Mit über 800 Mitgliedern sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die größte Familie von Membranrezeptoren beim Menschen³. Aufgrund ihrer Rolle in fast allen zellulären Prozessen sind GPCRs zu wichtigen Zielen für die therapeutische Entwicklung geworden. Im kanonischen Modell der GPCR-Signalübertragung führt die Agonistenaktivierung z....

Protokoll

Der gesamte Workflow des Protokolls wird in Abbildung 1 beschrieben.

1. Vorbereitung der Probenkammer

1. Gleit- und Deckglasreinigung
   HINWEIS: Diese Schritte zielen darauf ab, die Oberflächen der Objektträger sowie die Deckgläser zu reinigen und für die Aminosilanisierung vorzubereiten. Eine kritische Voraussetzung für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimenten an oberflächengebundenen Molekülen ist eine passivierte Oberfläche. Die zuverlässigste und reproduzierbarste Passivierungstechnik besteht darin, inerte Polymerketten kovalent als dichte Schicht an die Glasoberfläche anzubrin....

Ergebnisse

Expression und fluoreszierende Markierung des UAA-basierten FRET-Sensors
Hier werden beispielhafte Ergebnisse der Insertion und Fluoreszenzmarkierung einer LF (AZP) innerhalb der CRD von mGluR2 (548UAA) diskutiert¹¹. Wie bereits erwähnt, ist zum Einfügen von AZP in mGluR2 die Koexpression der technischen translationalen Maschinerie erforderlich, die eine modifizierte tRNA-Synthetase und komplementäre tRNA (pIRE4-Azi) und mGluR2 mit einem bernsteinfarbenen Codon an Position 5.......

Diskussion

GPCRs sind Proteine, die auf der Zellmembran arbeiten, um die Signaltransduktion einzuleiten. Viele GPCRs bestehen aus mehreren Domänen, wobei die Signalisierung von der kooperativen Interaktion zwischen den Domänen abhängt. Um die Eigenschaften dieser Membranrezeptoren zu modulieren, ist es wichtig, das dynamische Verhalten der verschiedenen Domänen zu verstehen. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine Fluoreszenztechnik, die die Messung von Proteinkonformation und -dynamik in Echtzeit e.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	Cat # 06162
548UAA	Liauw et al. 2021		Transfected construct
Acetic Acid	Fisher Chemical	64-19-7
Acetone	Fisher Chemical	67-64-1
Adobe Illustrator (2022)	https://www.adobe.com/	RRID:SCR_010279	Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride)	Cayman Chemical	81530
Aminosilane	Aldrich	919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L	Fisher Scientific		Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG	Laysan Bio Inc	Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES	Click Chemistry Tools	1237-500
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	Cat # 451657-10G
Cover slip	VWR	16004-306	Sample chamber
Cy3 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA117-5
Cy5 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA116-5
DDM	Anatrace	Part# D310 1 GM	Detergent
DDM-CHS (10:1)	Anatrace	Part# D310-CH210 1 ML	Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SH30070.03
Di01-R405/488/561/635	Semrock		Notch filter
DMEM	Corning	10-013-CV
EMCCD	Andor	DU-897U	Camera
ET542lp	Chroma		Long pass emission filter
FF640-FDi01	Semrock		Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody	Genscript	A01429
Fluorescent bead	Invitrogen T7279	TetraSpeck microspheres	Spherical bead
Glass slides	Fisherfinest	12-544-4	sample chamber
Glutamate	Sigma Aldrich	Cat # 6106-04-3
HEK 293T	Sigma Aldrich	Cat # 12022001	Cell line
HEPES	FisherBioReagents	7365-45-9
Image splitter	OptoSplit II
KOH	Fluka	1310-58-3
Laser	Oxxius		4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000015	Transfection Reagent
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
Microscope	Olympus	Olympus IX83
Milli-Q water	Barnstead		Water Deionizer
m-PEG	Laysan Bio Inc	Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635	Semrock		Dichroic mirror
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	51985091	Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)	https://www.originlab.com/	RRID:SCR_014212	Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
pIRE4-Azi	Addgene	Plasmid # 105829	Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma Aldrich	Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA)	HWI group	99-50-3
smCamera (Version 1.0)	http://ha.med.jhmi.edu/resources/		Camera software
Sodium bicarbonate	FisherBioReagents	144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	1310-73-2
Syringe filter	Whatman UNIFLO	Cat#9914-2502	Liquid filtration
Trolox	Sigma	53188-07