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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Um die Funktion von lncRNAs in zeitabhängigen Prozessen wie z.B. chromosomaler Instabilität zu analysieren, muss ein verlängerter Knockdown-Effekt erzielt werden. Zu diesem Zweck wird hier ein Protokoll vorgestellt, das modifizierte Antisense-Oligonukleotide verwendet, um einen effektiven Knockdown in Zelllinien für 21 Tage zu erreichen.

Zusammenfassung

Lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) spielen eine wichtige regulatorische Rolle bei der Genexpression auf transkriptioneller Ebene. Experimentelle Beweise haben gezeigt, dass sich ein erheblicher Teil der lncRNA bevorzugt im Zellkern ansammelt. Für die Analyse der Funktion von nukleären lncRNAs ist es wichtig, einen effizienten Knockdown dieser Transkripte im Zellkern zu erreichen. Im Gegensatz zur Verwendung von RNA-Interferenz, einer Technologie, die von der zytoplasmatischen Silencing-Maschinerie abhängt, kann eine Antisense-Oligonukleotid-Technologie (ASO) einen RNA-Knockdown erreichen, indem RNase H für die nukleäre RNA-Spaltung an die RNA-DNA-Duplexe rekrutiert wird. Im Gegensatz zur Verwendung von CRISPR-Cas-Werkzeugen für das Genom-Engineering, bei denen mögliche Veränderungen des Chromatinzustands auftreten können, ermöglichen ASOs den effizienten Knockdown von Kerntranskripten, ohne das Genom zu verändern. Eines der größten Hindernisse für den ASO-vermittelten Knockdown ist jedoch seine vorübergehende Wirkung. Für die Untersuchung der lang anhaltenden Effekte des lncRNA-Silencings ist es erforderlich, einen effizienten Knockdown über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten. In dieser Studie wurde ein Protokoll entwickelt, um einen Knockdown-Effekt für mehr als 21 Tage zu erzielen. Ziel war es, die cis-regulatorischen Effekte des lncRNA-Knockdowns auf das benachbarte kodierende Gen RFC4 zu bewerten, das mit der chromosomalen Instabilität zusammenhängt, einem Zustand, der nur über die Zeit und die Zellalterung beobachtet wird. Es wurden zwei verschiedene humane Zelllinien verwendet: PrEC, normale primäre Prostataepithelzellen, und HCT116, eine Epithelzelllinie, die aus kolorektalen Karzinomen isoliert wurde und einen erfolgreichen Knockdown in den untersuchten Zelllinien erzielte.

Einleitung

Der überwiegende Teil des menschlichen Genoms wird transkribiert, was zu einer Vielzahl von Transkripten führt, einschließlich lncRNAs, deren Anzahl die Anzahl der annotierten kodierenden Gene im menschlichen Transkriptom übersteigt1. LncRNAs sind Transkripte, die länger als 200 Nukleotide sind und nicht für Proteinekodieren 2,3 und kürzlich auf ihre wichtigen regulatorischen Funktionen in der Zelle untersucht wurden4. Es wurde gezeigt, dass ihre Funktionen von ihrer subzellulären Lokalisationabhängen 5, wie z. B. dem Zellkern, wo sich ein signifikanter Teil der lncRNAs ansammelt und aktiv an der Transkriptionsregulationbeteiligt ist 6 und für die Aufrechterhaltung der Kernarchitektur7, neben anderen biologischen Prozessen 8,9,10.

Für die funktionelle Charakterisierung von nukleären lncRNAs müssen Methoden verwendet werden, die in der Lage sind, Knockdown (KD) im Zellkern zu induzieren, und ASOs sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um nukleäre Transkripte zum Schweigen zu bringen. Im Allgemeinen handelt es sich bei ASOs um einzelsträngige DNA-Sequenzen mit einer Länge von ~20 Basenpaaren, die durch Watson-Crick-Basenpaarung an komplementäre RNA binden 11,12,13 und die Funktion der RNA durch Mechanismen modifizieren können, die von ihrer chemischen Struktur und Modifikationen abhängen13,14. ASO-chemische Modifikationen können in 2 Hauptgruppen unterteilt werden: Backbone-Modifikationen und 2'-Zuckerringmodifikationen15, die beide dazu bestimmt sind, die Stabilität zu erhöhen, indem sie eine hohe Resistenz gegen Nukleasen verleihen, aber auch die beabsichtigte biologische Wirkungverstärken 13,16. Unter den Rückgratmodifikationen werden Phosphoramidat-Morpholino (PMO), Thiophosphoramidat und Morpholino-Bindungen häufig für Zwecke wie die Interferenz beim Spleißen17,18 verwendet, indem sie als sterische Blocker19 dienen, aber nicht, um den Abbau des Transkripts zu induzieren. Eine weitere Backbone-Modifikation ist die Phosphorthioat (PS)-Bindung, eine der am häufigsten verwendeten Modifikationen in ASOs. Im Gegensatz zu den zuvor genannten Modifikationen stören PS-Bindungen nicht die Rekrutierung von RNase H12,20, wodurch ein RNA-Knockdown ermöglicht wird. Es gibt jedoch auch eine Vielzahl von 2'-Zuckerringmodifikationen21; nichtsdestotrotz gehören zum Zwecke des RNA-Knockdowns zu den Modifikationen, die effiziente Silencing-Effekte induzieren, die gesperrten Nukleinsäuren (LNAs)22, 23 und die 2'-O-Methyl-Modifikation24. Obwohl sich LNAs im Vergleich zu anderen Modifikationen als hochwirksam für den Knockdown erwiesen haben25, können sie unerwünschte Wirkungen wie Hepatotoxizität26 und Apoptose-Induktion in vivo und in vitrohervorrufen 27.

Zum Zwecke des RNA-Knockdowns können ASOs mit den oben genannten Modifikationen RNase H1 und H220,28 rekrutieren, und diese Enzyme werden an DNA-RNA-Hybride rekrutiert und spalten die Ziel-RNA, wodurch das ASO13 freigesetzt wird. Die RNA-Produkte dieser Spaltung werden dann von der RNA-Überwachungsmaschinerie verarbeitet, was zu einem RNA-Abbau29 führt, ohne die interessierende genomische Region zu verändern, im Gegensatz zu anderen Techniken wie CRISPR-Cas-Systemen, bei denen Modifikationen im Chromatinzustand unerwünschte biologische Wirkungen hervorrufen können30. Trotz der Vorteile der ASO-Technologie sind die vorübergehenden Silencing-Effekte aufgrund der Zellteilung oder des ASO-Abbaus im Laufe der Zeit ein Hindernis, das es bei der Untersuchung zeitabhängiger Prozesse wie der chromosomalen Instabilität (CIN) zu überwinden gilt31.

Insbesondere ist CIN definiert als eine erhöhte Rate von Veränderungen in der Chromosomenzahl und -struktur im Vergleich zu denen normaler Zellen32 und entsteht aus Fehlern in der Chromosomensegregation während der Mitose, was zu genetischen Veränderungen führt, die im Laufe der Zeit eine intratumorale Heterogenität33 hervorrufen. Daher kann CIN nicht nur durch das Finden eines aneuploiden Karyotyps bewertet werden. Für die ordnungsgemäße Untersuchung und Bewertung von CIN in Zellkulturen ist es wichtig, die Zellen im Laufe der Zeit zu überwachen. Um die Auswirkungen einer lncRNA KD auf CIN zu untersuchen, wird eine Methodik benötigt, die einen verlängerten KD-Effekt ermöglicht. Zu diesem Zweck wurden in diesem Protokoll ASOs verwendet, wobei lncRNA-RFC4 in den humanen Zelllinien HCT115 und PrEC für 18 bzw. 21 Tage erfolgreich stillgelegt wurde. Bei diesem Transkript handelt es sich um eine nicht charakterisierte lncRNA mit einer Länge von 1,2 kb, deren genomische Lokalisation sich auf Chromosom 3 (q27.3) befindet. Es grenzt an das proteinkodierende Gen RFC4, ein Gen, das bei verschiedenen Krebsarten beim Menschen mit CIN assoziiert ist 34,35,36.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll darf nur von Laborpersonal durchgeführt werden, das Erfahrung mit Laborsicherheitsverfahren hat. Es ist wichtig, die Sicherheitsdatenblätter aller in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Materialien ordnungsgemäß zu lesen, bevor mit dem Umgang mit gefährlichen Materialien und Geräten begonnen wird. Es ist wichtig, alle Sicherheitsanforderungen, die im Laborsicherheitshandbuch Ihrer Einrichtung aufgeführt sind, zusammen mit dem gesamten Protokoll zu lesen, zu verstehen und zu erfüllen. Die Entsorgung aller biologischen und chemischen Abfälle muss gemäß dem Abfallwirtschafts- und Entsorgungshandbuch der Einrichtung erfolgen. Bei unvorsichtiger Handhabung und gemäß sicherer Laborpraxis können die in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Geräte schwere Verletzungen verursachen. Befolgen Sie immer das Sicherheitslaborhandbuch und die Sicherheitsverfahren der Institution.

1. Design von ASOs

  1. Entwerfen Sie ASOs manuell, wie unten beschrieben.
    1. Erhalten Sie die vollständige Sequenz des Zieltranskripts und analysieren Sie sie auf dem RNAfold WebServer, Universität Wien37 (Table of Materials), unter Verwendung der Standardparameter auf der Website, um die Sekundärstruktur der minimalen freien Energie (MFE) zu erhalten.
    2. Wenn die Ergebnisse vorliegen, gehen Sie zur MFE-Glattstrukturzeichnung und klicken Sie auf In Forna anzeigen , um die MFE-Sekundärstruktur auf der Website zu öffnen, und die Software zeigt die vorhergesagte Sekundärstruktur des analysierten Transkripts an.
    3. Wählen Sie aus der vorhergesagten MFE-Sekundärstruktur eine Region von 20 bp Länge in der RNA aus und vermeiden Sie G-Strings (Sequenzen von 3 Guaninen in einer Reihe) beim Design der Oligonukleotide. Für die Auswahl der besten Zielregion für die ASO verwenden Sie die Regionen, für die eine geringere Wahrscheinlichkeit einer internen Basenpaarung vorhergesagt wird (Abbildung 1).
    4. Erstellen Sie aus dem ausgewählten Bereich von 20 bp die umgekehrte Komplementsequenz. Erstellen Sie das Reverse-Komplement manuell oder verwenden Sie das Online-Tool Reverse-Komplement (Materialtabelle). Die umgekehrte Komplementsequenz ist das ASO, das für das Experiment synthetisiert werden muss.
    5. Analysieren Sie die ASO-Sequenz mit Nucleotide Blast NCBI (blastn) und UCSC Genome Browser on Human (GRCh38/hg38). Stellen Sie sicher, dass ASOs keine Homologie zu anderen Transkripten oder anderen genomischen Regionen im menschlichen Genom aufweisen.
      HINWEIS: Die ASO-Synthese und -Reinigung wurde von einem kommerziellen Unternehmen durchgeführt (Materialtabelle).
  2. Stellen Sie sicher, dass die synthetisierten Oligonukleotide die folgenden Eigenschaften aufweisen.
    1. Stellen Sie sicher, dass PS-Bindungen entlang der gesamten Sequenz des Oligonukleotids38 bestehen (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass ASOs chimer sind, mit 5 Nukleotiden, die die 5'- und 3'-Enden flankieren, mit Zuckerringen, die mit 2'-O-Methyl modifiziert sind (Abbildung 2B).
    2. Stellen Sie sicher, dass die 10 Nukleotide in der Mitte einen unveränderten Zuckerring haben, um die RNase H-Bindung zu unterstützen (Abbildung 2C).
    3. Bitten Sie das Unternehmen, die Reinigung mit der Standard-Entsalzung und der Umkehrphasen-HPLC (RP)39 durchzuführen.
    4. Bestellen Sie die ASO-Lieferung in lyophilisiertem Format.
  3. Die lyophilisierten ASOs in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) ohne Calcium und Magnesium auf eine Endkonzentration von 200 μM auflösen. Bei -20 °C lagern.
  4. Bereiten Sie die Arbeitslösung von ASO vor, indem Sie das konzentrierte Material auf eine Konzentration von 20 μM verdünnen. Bereiten Sie die Verdünnung mit DPBS vor. Bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Für diese Studie wurden zwei ASOs entwickelt, die auf lncRNA-RFC4 abzielen. Zur Optimierung der ASO-Konzentration für Transfektion und Effizienz wurde das Protokoll von Zong et al.40 befolgt. Zwei ASOs wurden nach dem Zong-Protokoll entworfen und experimentell optimiert: ASO-lncRFC4 und ASO-lncRFC4-2. Nach der Optimierung wurde ein wirksames ASO, das auf lncRNA-RFC4 abzielt, ASO-lncRFC4, für das verlängerte Knockdown-Protokoll ausgewählt (Ergänzende Abbildung 1). Als Positivkontrolle wurde eine zuvor bestätigte effiziente ASO, die auf die lncRNA MALAT18 abzielt, verwendet: ASO-MALAT1. Für die Negativkontrolle wurde ein ASO entwickelt, das auf das Escherichia coli lacZ-Gen, ASO-lacZ (NCBI-Zugangsnummer: FN297865), abzielt.

2. Vorbereitung der Zellen

HINWEIS: Arbeiten Sie jedes Mal in der Zellkulturhaube, wenn Zelllinien, Lösungen, Materialien oder Produkte, die während der Zellkulturmanipulation verwendet werden sollen, gehandhabt werden. Verwenden Sie bei der Manipulation von Flüssigkeiten für die Zellkultur immer sterilisierte serologische Pipetten oder Mikropipetten mit sterilisierten Spitzen. Erfüllen und befolgen Sie während des gesamten Protokolls immer alle Sicherheitsanforderungen, die im Sicherheitshandbuch des Labors der Einrichtung angegeben sind.

  1. Bereiten Sie das vollständige Zellkulturmedium für jede Zelllinie vor, wie unten beschrieben.
    1. Für HCT116 bereiten Sie McCoy's 5A-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) vor.
    2. Bereiten Sie für die PrEC das Basalmedium der Prostataepithelzellen mit dem Prostataepithelzell-Wachstumskit vor.
  2. Für KD-Experimente werden drei 100-mm-Kulturplatten (55 cm2 Oberfläche) verwendet, eine für jedes zu verwendende Oligonukleotid: ASO, das auf die lncRNA abzielt, ASO, das als Positivkontrolle verwendet wird (ASO-MALAT1), und ASO, das als Negativkontrolle verwendet wird (ASO-lacZ).
  3. Verwenden Sie zwei 35-mm-Kulturplatten (9 cm2 in der Oberfläche), die als Kontrollpunkte für KD zwischen den Zellpassagen verwendet werden, von denen eine mit vollständigem Transfektionsmedium für ASO-lncRFC4 und die andere für ASO-lacZ transfiziert wird.
    HINWEIS: Die Transfektion wurde gemäß den zuvor berichteten Verfahren und Protokollen des Herstellers für das lipidbasierte Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) geplant41,42.
  4. Samenzellen mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen/cm2 in Zellkulturschalen. Inkubieren Sie bei 37 °C im Inkubator mit 5 % CO2 an der Luft, bis die Zellen eine Konfluenz von 50 % erreichen (wenn 50 % der Oberfläche von der Zellmonoschicht bedeckt sind). Mit einer Konfluenz von 50 % sind die Zellen bereit, für dieses Protokoll transfiziert zu werden.
    HINWEIS: Für die Transfektion von ASO-lncRFC4 und ASO-lacZ wurden eine 100-mm-Schale und eine 35-mm-Schale ausgesät. Für die Transfektion von ASO-MALAT1 wurde nur eine 100-mm-Schale ausgesät (Abbildung 3A).

3. Transfektion

  1. Erwärmen Sie das reduzierte Serummedium auf 37 °C vor Beginn des Eingriffs.
  2. Für die Transfektion mit ASO-lacZ und ASO-lncRFC4 gehen Sie wie folgt vor.
    HINWEIS: Die Transfektion mit ASO-lacZ und ASO-lncRFC4 ist für Zellen mit einer Oberfläche von 55 cm2 geplant; Wenn verschiedene Bereiche genutzt werden, können die Volumina entsprechend angepasst werden. Dieses Verfahren muss für jedes verwendete ASO unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden.
    1. Bereiten Sie das Röhrchen 1 in der Zellkulturhaube vor, indem Sie 43,75 μl ASO (20 μM) in 1,4 ml warmem, reduziertem Serummedium in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen auflösen.
    2. Bereiten Sie Röhrchen 2 in der Zellkulturhaube vor, indem Sie 18,66 μl Transfektionsreagenz auf Lipidbasis mit 1,4 ml warmem, reduziertem Serummedium in einem 1,5 ml-RNase-freien Mikrofugeröhrchen mischen.
    3. Die Röhrchen 1 und 2 in der Zellkulturhaube 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Geben Sie die in Röhrchen 2 enthaltene Lösung (Transfektionsreagenz + reduziertes Serum) langsam und tropfenweise direkt in Röhrchen 1 (ASO + reduziertes Serum), um ein Verteilen der Reagenzien auf der Oberfläche des Röhrchens zu vermeiden.
    5. Das in Röhrchen 1 enthaltene Gemisch wird 20 Minuten lang in der Kulturhaube bei Raumtemperatur inkubiert.
    6. Geben Sie warmes, reduziertes Serummedium in die Tube 1 bis zu einem Endvolumen von 8,75 ml.
      HINWEIS: Das endgültige Transfektionsmedium enthielt ASO in einer Konzentration von 100 nM.
    7. Nehmen Sie das Kulturmedium aus der Zellkulturschale, in der sich die zu transfizierenden Zellen befinden, und geben Sie 7,5 mL des Transfektionsmediums tropfenweise auf die 100-mm-Kulturplatte und 1 mL auf die 35-mm-Kulturplatte direkt in der Zellmonoschicht. Stellen Sie sicher, dass das Medium durch leichtes Schütteln der Schale gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt ist.
    8. In einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 an der Luft 6 h inkubieren.
    9. Nach 6 Stunden Inkubation im Transfektionsmedium geben Sie 7,5 ml vollständiges Medium zu den Zellen in der 100-mm-Kulturplatte und 1 ml vollständiges Medium zu den Zellen in der 35-mm-Kulturplatte. Bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
  3. Für die Transfektion mit ASO-MALAT1 führen Sie die Experimente wie unten beschrieben durch.
    HINWEIS: Die Transfektion mit ASO-MALAT1 ist für Zellen mit einer Oberfläche von 55 cm2 geplant.
    1. Bereiten Sie das Röhrchen 1 in der Zellkulturhaube vor, indem Sie 37,5 μl ASO (20 μM) in 1,2 ml warmem, reduziertem Serummedium in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen auflösen.
    2. Bereiten Sie Röhrchen 2 vor, indem Sie 16 μl Transfektionsreagenz auf Lipidbasis mit 1,2 ml warmem, reduziertem Serummedium mischen.
    3. Inkubieren Sie die Röhrchen 1 und 2 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Zellkulturhaube.
    4. Geben Sie die in Röhrchen 2 enthaltene Lösung (lipidbasiertes Transfektionsreagenz + reduziertes Serum) langsam und tropfenweise direkt in Röhrchen 1 (ASO + reduziertes Serum), um ein Verteilen der Reagenzien auf der Oberfläche des Röhrchens zu vermeiden.
    5. Das in Röhrchen 1 enthaltene Gemisch wird 20 Minuten lang in der Kulturhaube bei Raumtemperatur inkubiert.
    6. Geben Sie warmes, reduziertes Serummedium in die Tube 1 bis zu einem Endvolumen von 7,5 ml. Das endgültige Transfektionsmedium enthielt ASO in einer Konzentration von 100 nM.
    7. Nehmen Sie das Kulturmedium aus der Zellkulturschale, in der sich die zu transfizierenden Zellen befinden, und geben Sie 7,5 ml des Transfektionsmediums tropfenweise direkt in die Zellmonoschicht, um sicherzustellen, dass das Medium durch leichtes Schütteln der Schale gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt wird.
    8. Bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 an der Luft 6 h inkubieren.
    9. Nach 6 Stunden Inkubation mit dem Transfektionsmedium werden 7,5 ml des vollständigen Mediums in die Zellen gegeben und in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
  4. Untersuchen Sie die Zellen alle 12-24 Stunden mikroskopisch, bis die Zellen für die nächste Transfektionsrunde bereit sind.
    HINWEIS: Als nächstes muss die Transfektion durchgeführt werden, wenn die Zellen eine Konfluenz von 70% erreichen. Tauschen Sie bei Bedarf das Medium aus und ersetzen Sie es durch ein vollständiges Kulturmedium.
  5. Wenn die Zellen in der Zellkulturschale zu 70 % konfluiert sind, wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 3.1 bis 3.4) und führen Sie die nächste Transfektionsrunde durch.
    HINWEIS: Nach der zweiten Transfektion sollten die Zellen alle 12-24 Stunden mikroskopisch beurteilt werden. Die Zellernte und -passage muss durchgeführt werden, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 85 % erreichen. Tauschen Sie bei Bedarf das Medium aus und ersetzen Sie es durch ein vollständiges Kulturmedium.

4. Zellernte und Passage

HINWEIS: Die Zellentnahme und -passage erfolgt nach jeweils 2 Transfektionsrunden und nach der 2., 4. und 6. Transfektionsrunde. Die mittlere Zeit für die Ernte in HCT116-Zellen betrug 6 Tage nach der 1., 3. und 5. Transfektion, und für PrEC-Zellen betrug die mittlere Zeit 7 Tage nach der 1., 3. und 5. Transfektion. Der Zeitpunkt für die Transfektion ist für beide in diesem Protokoll verwendeten Zelllinien unterschiedlich. Bei HCT116 werden die 2., 3., 4., 5. und 6. Transfektion 3, 6, 9, 12 bzw. 15 Tage nach der ersten Transfektion durchgeführt. Bei der PrEC werden die 2., 3., 4., 5. und 6. Transfektion 3, 7, 10, 14 bzw. 18 Tage nach der ersten Transfektion durchgeführt. Anhand der Zeitleiste in Abbildung 3 können Sie die Zeitpunkte für Transfektion, Passage und Ernte überprüfen.

  1. Führen Sie die Zellernte und Passage für die KD-Experimente in 100-mm-Kulturplatten durch, wie unten beschrieben.
    1. Fahren Sie mit der Zellernte und der Passage fort, wenn die Zellen einen Zusammenfluss von 80 % bis 85 % erreichen.
    2. Erwärmen Sie das gesamte Medium und waschen Sie die Lösungen auf 37 °C. Erwärmen Sie das Dissoziationsreagenz auf Raumtemperatur. Die Neutralisationslösung für das Dissoziationsreagenz auf Raumtemperatur erwärmen.
      HINWEIS: Waschlösungen, Dissoziationsreagenzien und Neutralisationslösungen unterscheiden sich für die beiden in diesem Protokoll verwendeten Zelllinien. HCT116-Zellen werden mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen und mit Trypsin-EDTA-Lösung dissoziiert. Die Neutralisation des Dissoziationsreagenzes erfolgt mit vollständigen Nährmedien für HCT116-Zellen. Für PrEC wird HEPES-gepufferte Kochsalzlösung als Waschlösung verwendet. Als Dissoziationsreagenz wird Trypsin-EDTA verwendet. Zur Neutralisation des Dissoziationsreagenzes verwenden Sie die Trypsin-Neutralisationslösung.
    3. Nehmen Sie das Kulturmedium in der Kulturhaube aus der Zellkulturschale und waschen Sie es vorsichtig mit 3 ml Waschlösung, gefolgt von einer Entsorgung der Waschlösung. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
    4. Geben Sie 2 mL Dissoziationsreagenz entsprechend der Zelllinie in die Zellmonoschicht und inkubieren Sie bei 37 °C für 3-5 Minuten. Beurteilen Sie die Zellen alle 2 Minuten, bis die Dissoziation abgeschlossen ist.
    5. Geben Sie je nach Zelllinie 2 ml Neutralisationslösung hinzu und übertragen Sie das gesamte Volumen der Zellsuspension aus der Zellkulturschale in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    6. Für die RNA-Extraktion nehmen Sie 500 μl der Zellsuspension und überführen sie in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und fahren Sie mit Schritt 5.1 für die RNA-Extraktion und RT-qPCR fort.
    7. Der Rest der Zellsuspension wird bei 120 x g 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand wird verworfen.
    8. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml vollständigem Kulturmedium und fahren Sie mit der Zellzählung gemäß den Standardverfahren fort.
    9. Für die Karyotypisierung werden Samenzellen mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen/cm2 in einer Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm (Oberfläche von 9 cm2) in einem Inkubator bei 37 °C bei 5 % CO2 an der Luft für 24 h inkubiert und nach Standardverfahren karyotypisiert.
    10. Um die KD-Experimente in der nächsten zellulären Passage fortzusetzen, säen Sie Zellen auf eine Dichte von 1 x 104 Zellen/cm2 in einer neuen Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 100 mm aus. Diese Schale wird Passage Nummer 2 für das Experiment sein. Inkubieren Sie bei 37 °C im Inkubator mit 5 % CO2 an der Luft, bis die Zellen einen Konfluenzgrad von 50 % erreichen.
      HINWEIS: Falls gewünscht, können die verbleibenden Zellen für die Proteinextraktion und/oder das Einfrieren nach Standardverfahren verwendet werden.
    11. Die Schritte 3.1 bis 4.1.10 für die Transfektion und Entnahme aus Gang 2 und Gang 3 wiederholen.
  2. Befolgen Sie das nächste Verfahren zur Zellernte für die Checkpoints der KD-Experimente in 35-mm-Kulturschalen.
    HINWEIS: Die Ernte für den ersten Kontrollpunkt im KD-Experiment erfolgt 2 Tage nach der 2. und 4. Transfektion.
    1. Erwärmen Sie das gesamte Medium und die Waschlösungen auf 37 °C. Erwärmen Sie das Dissoziationsreagenz auf Raumtemperatur. Die Neutralisationslösung für das Dissoziationsreagenz auf Raumtemperatur erwärmen.
    2. Nehmen Sie das Kulturmedium in der Kulturhaube aus der Zellkulturschale und waschen Sie es vorsichtig mit 0,5 ml Waschlösung, bevor Sie die Waschlösung entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
    3. Nach dem Verwerfen der Waschlösungen 0,5 ml Dissoziationsreagenz je nach Zelllinie zugeben und bei 37 °C für 3-5 Minuten inkubieren. Beurteilen Sie die Zellen alle 2 Minuten, bis die Dissoziation abgeschlossen ist.
    4. Fügen Sie je nach Zelllinie 0,5 ml Neutralisationslösung hinzu und übertragen Sie das gesamte Volumen der Zellsuspension aus der Zellkulturschale in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es auf Eis.
    5. Fahren Sie mit Schritt 5.1 für RNA-Extraktion und qPCR fort.

5. RNA-Extraktion und RT-PCR

  1. Die Zellsuspension bei 200 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Waschen Sie das Zellpellet mit 600 μl kaltem PBS (4 °C).
  2. Die Zellsuspension bei 200 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    Verwenden Sie das Zellpellet für die RNA-Extraktion gemäß den Standardverfahren.
  3. Fahren Sie mit der DNase-Behandlung der gereinigten RNA gemäß dem im Labor angewandten Standardverfahren fort. Lagern Sie die gereinigte RNA am Pausenpunkt über einen längeren Zeitraum bei -80 °C.
  4. Verwenden Sie die RNA für die Standard-cDNA-Synthese mit jeder erhaltenen RNA-Probe. Lagern Sie cDNA am Pausenpunkt über einen längeren Zeitraum bei -20 °C.
  5. Führen Sie die Standard-qPCR gemäß den unten beschriebenen Schritten durch.
    1. Für die qPCR amplifizieren Oligonukleotide die folgenden Transkripte: lncRNA von Interesse, MALAT1 und ein konstitutiv exprimiertes Gen als interne Kontrolle (Tabelle 1). Für dieses Protokoll wurde der Ausdruck RPS28 als interne Kontrolle verwendet.
    2. Führen Sie qPCR-Reaktionen durch, um die interne Kontrolle, die lncRNA of Interest und MALAT1 unter Verwendung von cDNA aus der ASO-LacZ-Probe zu amplifizieren. Diese Stichprobe wird verwendet, um die Expression aus den anderen Proben zu normalisieren.
    3. Führen Sie qPCR-Reaktionen durch, um das interne Kontroll-RPS28 und die interessierende lncRNA unter Verwendung von cDNA aus der ASO-lncRNA-Probe zu amplifizieren.
    4. Führen Sie qPCR-Reaktionen durch, um die internen Kontrollen RPS28 und MALAT1 unter Verwendung von cDNA aus der ASO-MALAT1-Probe zu amplifizieren. Befolgen Sie die Reaktionsaufbau- und Thermocyclerbedingungen, wie in Tabelle 2 beschrieben.
    5. Analysieren Sie qPCR-Daten durch ΔΔCt-Normalisierung der Expression des interessierenden Transkripts im Vergleich zur internen Kontrolle und normalisieren Sie dann die Expression des interessierenden Transkripts (lncRNA oder MALAT1) gegen die Expression desselben Transkripts in der ASO-LacZ-Probe, um das relative Expressionsniveau des Transkripts zu erhalten.

Ergebnisse

In dem vorliegenden Protokoll wurde die Verwendung von ASOs in den humanen Zelllinien PrEC und HCT116 über einen längeren Zeitraum an die KD einer nukleären lncRNA angepasst.

Sicherlich war das KD-Experiment in der Zelllinie PrEC für 21 Tage des Experiments erfolgreich, wie in Abbildung 4 zu sehen ist. Um diese Aussage zu bestätigen, analysierten wir zusätzlich zur Analyse der Expression in den Tagen der Zellpassage (

Diskussion

Wie bereits erwähnt, haben lncRNAs wichtige regulatorische Funktionen in der Zelle; Daher kann eine Fehlregulation dieser Transkripte an Krankheiten beteiligt sein. Krebs ist eine solche Krankheit, die durch eine lncRNA-Dysregulation gekennzeichnet ist43,44. Bei dieser Erkrankung ist bekannt, dass lncRNAs als Onkogene45 oder Tumorsuppressoren46 eine wichtige regulatorische Rolle sp...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Montiel-Manriquez, Rogelio ist Doktorandin des Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas der Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und hat ein CONACyT-Stipendium mit der CONACyT CVU-Nummer: 581151 erhalten.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
15ml Centrifuge Tubes - 15ml Conical TubesThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm TC-treated Culture DishCorning 430167Surface area:55 cm2
Corning 35 mm TC-treated Culture DishCorning 430165Surface area: 9 cm2
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
Fetal Bovine Serum (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 cell lineATCCCCL-247
HEPES, 1M Buffer SolutionThermo Fisher Scientific15630122
Integrated DNA Technologies NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX ReagentThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A medium ATCC30-2007
Normal Human Primary Prostate Epithelial Cells (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Nucleotide Blast NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Reduced Serum MediaThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific
Prostate Epithelial Cell Basal MediumATCCPCS-440-030
Prostate Epithelial Cell Growth KitATCCPCS-440-040
Reverse complement online toolNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher Scientific12604013Trypsin-EDTA solution
Trypsin Neutralizing SolutionATCCPCS-999-004
Trypsin-EDTA for Primary CellsATCCPCS-999-003
UCSC Genome Browser, Human (GRCh38/hg38)NANAhttps://genome.ucsc.edu/

Referenzen

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