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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Per analizzare la funzione degli lncRNA in processi dipendenti dal tempo come l'instabilità cromosomica, è necessario ottenere un effetto di knockdown prolungato. A tal fine, qui viene presentato un protocollo che utilizza oligonucleotidi antisenso modificati per ottenere un efficace knockdown nelle linee cellulari per 21 giorni.

Abstract

Gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell'espressione genica a livello trascrizionale. Evidenze sperimentali hanno stabilito che una frazione sostanziale di lncRNA si accumula preferenzialmente nel nucleo. Per l'analisi della funzione degli lncRNA nucleari, è importante ottenere un efficiente knockdown di questi trascritti all'interno del nucleo. In contrasto con l'uso dell'interferenza dell'RNA, una tecnologia che dipende dal meccanismo di silenziamento citoplasmatico, una tecnologia oligonucleotidica antisenso (ASO) può ottenere il knockdown dell'RNA reclutando la RNasi H nei duplex RNA-DNA per la scissione dell'RNA nucleare. A differenza dell'uso degli strumenti CRISPR-Cas per l'ingegneria genomica, dove possono verificarsi possibili alterazioni dello stato della cromatina, gli ASO consentono l'efficiente knockdown dei trascritti nucleari senza modificare il genoma. Tuttavia, uno dei principali ostacoli al knockdown mediato da ASO è il suo effetto transitorio. Per lo studio degli effetti duraturi del silenziamento degli lncRNA, è necessario mantenere un knockdown efficiente per lungo tempo. In questo studio, è stato sviluppato un protocollo per ottenere un effetto knockdown per oltre 21 giorni. Lo scopo era quello di valutare gli effetti cis-regolatori del knockdown di lncRNA sul gene codificante adiacente RFC4, che è correlato all'instabilità cromosomica, una condizione che si osserva solo attraverso il tempo e l'invecchiamento cellulare. Sono state utilizzate due diverse linee cellulari umane: PrEC, cellule epiteliali prostatiche primarie normali, e HCT116, una linea cellulare epiteliale isolata dal carcinoma del colon-retto, che ha ottenuto un knockdown di successo nelle linee cellulari analizzate.

Introduzione

La stragrande maggioranza del genoma umano viene trascritta, dando origine a un'ampia varietà di trascritti, inclusi gli lncRNA, che, in numero, superano il numero di geni codificanti annotati nel trascrittoma umano1. Gli lncRNA sono trascritti più lunghi di 200 nucleotidi che non codificano per le proteine 2,3 e sono stati recentemente esaminati per le loro importanti funzioni regolatorie nella cellula4. È stato dimostrato che le loro funzioni dipendono dalla loro localizzazione subcellulare5, come il nucleo in cui si accumula una frazione significativa di lncRNA e partecipa attivamente alla regolazione trascrizionale6 e al mantenimento dell'architettura nucleare7, tra gli altri processi biologici 8,9,10.

Per la caratterizzazione funzionale degli lncRNA nucleari, devono essere utilizzati metodi in grado di indurre knockdown (KD) nel nucleo, e gli ASO sono un potente strumento per silenziare i trascritti nucleari. In generale, gli ASO sono sequenze di DNA a singolo filamento di ~20 coppie di basi di lunghezza che si legano all'RNA complementare mediante appaiamento di basi di Watson-Crick 11,12,13 e possono modificare la funzione dell'RNA attraverso meccanismi che dipendono dalla loro struttura chimica e dalle modifiche 13,14. Le modifiche chimiche dell'ASO possono essere suddivise in 2 gruppi principali: modifiche della spina dorsale e modifiche dell'anello di zucchero 2'15, entrambe intese ad aumentare la stabilità conferendo un'elevata resistenza alle nucleasi ma anche a migliorare l'effetto biologico previsto13,16. Tra le modificazioni dello scheletro, il fosforamidato morfolino (PMO), il tiofosforamidato e i legami morfolino sono ampiamente utilizzati per scopi quali l'interferenza nello splicing17,18 fungendo da agenti bloccanti sterici19 ma non per indurre la degradazione del trascritto. Un'altra modifica della spina dorsale è il legame fosforotioato (PS), una delle modifiche più comunemente usate negli ASO. A differenza delle modifiche precedentemente menzionate, i legami PS non interferiscono con il reclutamento della RNasi H 12,20, consentendo così il knockdown dell'RNA. Tuttavia, esiste anche un'ampia varietà di modifiche dell'anello di zucchero 2' 21; tuttavia, ai fini dell'abbattimento dell'RNA, tra le modificazioni che inducono effetti di silenziamento efficienti ci sono gli acidi nucleici bloccati (LNA)22, 23 e la modificazione 2'-O-metile24. Anche se gli LNA hanno dimostrato di essere altamente efficaci per il knockdown rispetto ad altre modifiche25, possono indurre effetti indesiderati come l'epatotossicità26 e l'induzione dell'apoptosi in vivo e in vitro27.

Ai fini del knockdown dell'RNA, gli ASO con le opportune modifiche menzionate in precedenza possono reclutare RNasi H1 e H220,28, e questi enzimi vengono reclutati in ibridi DNA-RNA e scindono l'RNA bersaglio, rilasciando l'ASO13. I prodotti RNA di questa scissione vengono quindi elaborati dal macchinario di sorveglianza dell'RNA, con conseguente degradazione dell'RNA29 senza modificare la regione genomica di interesse, in contrasto con altre tecniche come i sistemi CRISPR-Cas, dove le modifiche nello stato della cromatina possono creare effetti biologici indesiderati30. Nonostante i vantaggi della tecnologia ASO, gli effetti di silenziamento temporaneo dovuti alla divisione cellulare o alla degradazione dell'ASO nel tempo sono un ostacolo da superare quando si studiano processi dipendenti dal tempo come l'instabilità cromosomica (CIN)31.

In particolare, la CIN è definita come un aumento del tasso di cambiamenti nel numero e nella struttura dei cromosomi rispetto a quelli delle cellule normali32 e deriva da errori nella segregazione cromosomica durante la mitosi, portando ad alterazioni genetiche che originano l'eterogeneità intratumorale33 nel tempo. Pertanto, la CIN non può essere valutata solo trovando un cariotipo aneuploide. Per un corretto studio e valutazione della CIN in coltura cellulare, è importante monitorare le cellule nel tempo. Per lo studio degli effetti di un lncRNA KD sulla CIN, è necessaria una metodologia che consenta un effetto KD prolungato. A questo scopo, gli ASO sono stati utilizzati in questo protocollo, in cui lncRNA-RFC4 è stato silenziato con successo nelle linee cellulari umane HCT115 e PrEC per 18 e 21 giorni, rispettivamente. Questo trascritto è un lncRNA non caratterizzato di 1,2 kb di lunghezza e la sua posizione genomica è sul cromosoma 3 (q27.3). È adiacente al gene codificante la proteina RFC4, un gene associato alla CIN in diversi tipi di cancro umano 34,35,36.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo deve essere eseguito solo da personale di laboratorio con esperienza nelle procedure di sicurezza di laboratorio. È essenziale leggere correttamente le schede di sicurezza di tutti i reagenti e i materiali utilizzati in questo protocollo prima di iniziare a maneggiare materiali e attrezzature pericolose. È essenziale leggere, comprendere e soddisfare tutti i requisiti di sicurezza indicati nel manuale di sicurezza del laboratorio del proprio istituto lungo l'intero protocollo. Lo smaltimento di tutti i rifiuti biologici e chimici deve essere effettuato secondo il manuale di gestione e smaltimento dei rifiuti dell'istituto. Se non maneggiati con cura e secondo le pratiche di laboratorio sicure, i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo possono causare gravi lesioni. Seguire sempre il manuale del laboratorio di sicurezza dell'istituto e le procedure di sicurezza.

1. Progettazione di ASO

  1. Progettare manualmente gli ASO come descritto di seguito.
    1. Ottenere la sequenza completa del trascritto target e analizzarla nel RNAfold WebServer, Università di Vienna37 (Tabella dei materiali), utilizzando i parametri predefiniti sul sito Web per ottenere la struttura secondaria a energia libera minima (MFE).
    2. Quando i risultati sono pronti, vai al disegno della struttura semplice MFE e fai clic su Visualizza in Forna per aprire la struttura secondaria MFE sul sito Web e il software mostrerà la struttura secondaria prevista della trascrizione analizzata.
    3. Dalla struttura secondaria MFE prevista, selezionare una regione di 20 bp di lunghezza nell'RNA, evitando le stringhe G (sequenze di 3 guanine in fila) durante la progettazione degli oligonucleotidi. Per la selezione della migliore regione target per l'ASO, utilizzare le regioni che si prevede abbiano una minore probabilità di appaiamento di basi interne (Figura 1).
    4. Dalla regione selezionata di 20 bp, creare la sequenza di complemento inverso. Create manualmente il complemento inverso o utilizzate lo strumento online complemento inverso (Tabella dei materiali). La sequenza del complemento inverso sarà l'ASO che deve essere sintetizzato per l'esperimento.
    5. Analizza la sequenza ASO utilizzando Nucleotide Blast NCBI (blastn) e UCSC Genome Browser on Human (GRCh38/hg38). Assicurarsi che gli ASO non mostrino omologia con altri trascritti o altre regioni genomiche nel genoma umano.
      NOTA: La sintesi e la purificazione dell'ASO sono state eseguite da una società commerciale (Tabella dei materiali).
  2. Assicurarsi che gli oligonucleotidi sintetizzati abbiano le seguenti caratteristiche.
    1. Garantire i legami PS lungo l'intera sequenza dell'oligonucleotide38 (Figura 2A). Assicurarsi che gli ASO siano chimerici, con 5 nucleotidi che fiancheggiano le estremità 5' e 3' con anelli di zucchero modificati con 2'-O-metile (Figura 2B).
    2. Assicurarsi che i 10 nucleotidi al centro abbiano un anello di zucchero non modificato per supportare il legame della RNasi H (Figura 2C).
    3. Chiedere all'azienda di eseguire la purificazione utilizzando la desalinizzazione standard e l'HPLC39 a fase inversa (RP).
    4. Ordina la consegna ASO in formato liofilizzato.
  3. Sciogliere gli ASO liofilizzati in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) senza calcio e magnesio fino a una concentrazione finale di 200 μM. Conservare a -20 °C.
  4. Preparare la soluzione di lavoro di ASO diluendo il brodo concentrato a una concentrazione di 20 μM. Preparare la diluizione utilizzando DPBS. Conservare a -20 °C.
    NOTA: Per questo studio, sono stati progettati due ASO che hanno come bersaglio lncRNA-RFC4. Per l'ottimizzazione della concentrazione di ASO per la trasfezione e l'efficienza, è stato seguito il protocollo di Zong et al.40 . Due ASO sono stati progettati e ottimizzati sperimentalmente secondo il protocollo di Zong: ASO-lncRFC4 e ASO-lncRFC4-2. Dopo l'ottimizzazione, è stato selezionato un efficace lncRNA-RFC4 che ha come bersaglio lncRNA-RFC4, ASO-lncRFC4, per il protocollo di knockdown prolungato (Figura 1 supplementare). Come controllo positivo, è stato utilizzato un lncRNA MALAT18 che ha come bersaglio lncRNA ASO efficace precedentemente confermato: ASO-MALAT1. Per il controllo negativo, è stato progettato un ASO mirato al gene Escherichia coli lacZ, ASO-lacZ (numero di accesso NCBI: FN297865).

2. Preparazione delle cellule

NOTA: Lavorare all'interno della cappa per colture cellulari ogni volta che vengono maneggiate linee cellulari, soluzioni, materiali o qualsiasi prodotto da utilizzare durante la manipolazione di colture cellulari. Quando si manipolano liquidi per colture cellulari, utilizzare sempre pipette sierologiche sterilizzate o micropipette con puntali sterilizzati. Soddisfare e seguire sempre tutti i requisiti di sicurezza indicati nel manuale di sicurezza del laboratorio dell'istituto durante l'intero protocollo.

  1. Preparare il terreno di coltura cellulare completo per ogni linea cellulare come descritto di seguito.
    1. Per HCT116, preparare il terreno 5A di McCoy con il 10% di siero fetale bovino (FBS).
    2. Per la PrEC, preparare il terreno basale delle cellule epiteliali della prostata con il kit per la crescita delle cellule epiteliali della prostata.
  2. Utilizzare tre piastre di coltura da 100 mm (55 cm2 di superficie) per gli esperimenti KD, una per ogni oligonucleotide da utilizzare: ASO mirato all'lncRNA, ASO da utilizzare come controllo positivo (ASO-MALAT1) e ASO da utilizzare come controllo negativo (ASO-lacZ).
  3. Utilizzare due piastre di coltura da 35 mm (9 cm2 di superficie) da utilizzare come punti di controllo per la KD tra i passaggi cellulari, una delle quali sarà trasfettata con un terreno di trasfezione completo per ASO-lncRFC4 e l'altra per ASO-lacZ.
    NOTA: La trasfezione è stata pianificata secondo le procedure e i protocolli del produttore del reagente di trasfezione a base lipidica (vedi Tabella dei materiali) precedentemente riportati41,42.
  4. Seminare le cellule a una densità di 1 x 104 cellule/cm2 in piastre di coltura cellulare. Incubare a 37 °C nell'incubatore utilizzando il 5% di CO2 nell'aria fino a quando le cellule raggiungono il 50% di confluenza (quando il 50% della superficie è coperto dal monostrato cellulare). Con una confluenza del 50%, le cellule sono pronte per essere trasfettate per questo protocollo.
    NOTA: Per la trasfezione di ASO-lncRFC4 e ASO-lacZ, sono state seminate una piastra da 100 mm e una da 35 mm. Per la trasfezione di ASO-MALAT1, è stata seminata solo una piastra da 100 mm (Figura 3A).

3. Trasfezione

  1. Riscaldare il terreno sierico ridotto a 37 °C prima dell'inizio della procedura.
  2. Per la trasfezione con ASO-lacZ e ASO-lncRFC4, seguire i passaggi descritti di seguito.
    NOTA: La trasfezione con ASO-lacZ e ASO-lncRFC4 è prevista per cellule in una superficie di 55 cm2; Quando vengono utilizzate aree diverse, i volumi possono essere regolati di conseguenza. Questa procedura deve essere eseguita per ogni ASO utilizzato nelle stesse condizioni.
    1. Preparare la provetta 1 all'interno della cappa di coltura cellulare sciogliendo 43,75 μL di ASO (20 μM) in 1,4 mL di terreno sierico ridotto caldo in una provetta da centrifuga conica da 15 mL.
    2. Preparare la provetta 2 all'interno della cappa di coltura cellulare mescolando 18,66 μL di reagente di trasfezione a base lipidica con 1,4 mL di terreno sierico ridotto caldo in una provetta per microfugi priva di RNasi da 1,5 mL.
    3. Incubare le provette 1 e 2 all'interno della cappa di coltura cellulare a temperatura ambiente per 10 minuti.
    4. Aggiungere la soluzione contenuta nella provetta 2 (reagente di trasfezione + siero ridotto) direttamente nella provetta 1 (ASO + siero ridotto) lentamente, goccia a goccia, per evitare di diffondere i reagenti sulla superficie della provetta.
    5. Incubare la miscela contenuta nella provetta 1 per 20 minuti all'interno della cappa di coltura a temperatura ambiente.
    6. Aggiungere il terreno di siero ridotto caldo alla provetta 1 fino a un volume finale di 8,75 mL.
      NOTA: Il mezzo di trasfezione finale conteneva ASO a una concentrazione di 100 nM.
    7. Rimuovere i terreni di coltura dalla piastra di coltura cellulare contenente le cellule da trasfettare e aggiungere 7,5 mL di terreno di trasfezione alla piastra di coltura da 100 mm e 1 mL alla piastra di coltura da 35 mm direttamente nel monostrato cellulare, goccia a goccia. Assicurarsi che il supporto sia distribuito uniformemente su tutta la superficie agitando delicatamente il piatto.
    8. Incubare in incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 nell'aria per 6 ore.
    9. Dopo 6 ore di incubazione nel terreno di trasfezione, aggiungere 7,5 mL di terreno completo alle cellule nella piastra di coltura da 100 mm e 1 mL di terreno completo alle cellule nella piastra di coltura da 35 mm. Incubare a 37 °C e 5% CO2.
  3. Per la trasfezione con ASO-MALAT1, eseguire gli esperimenti come descritto di seguito.
    NOTA: La trasfezione con ASO-MALAT1 è prevista per cellule in una superficie di 55 cm2.
    1. Preparare la provetta 1 all'interno della cappa di coltura cellulare sciogliendo 37,5 μL di ASO (20 μM) in 1,2 mL di terreno sierico ridotto caldo in una provetta da centrifuga conica da 15 mL.
    2. Preparare la provetta 2 mescolando 16 μL di reagente di trasfezione a base lipidica con 1,2 mL di terreno sierico ridotto caldo.
    3. Incubare le provette 1 e 2 a temperatura ambiente per 10 minuti all'interno della cappa di coltura cellulare.
    4. Aggiungere la soluzione contenuta nella provetta 2 (reagente di trasfezione a base lipidica + siero ridotto) direttamente nella provetta 1 (ASO + siero ridotto) lentamente, goccia a goccia, per evitare di diffondere i reagenti sulla superficie della provetta.
    5. Incubare la miscela contenuta nella provetta 1 per 20 minuti all'interno della cappa di coltura a temperatura ambiente.
    6. Aggiungere il terreno di siero ridotto caldo alla provetta 1 fino a un volume finale di 7,5 mL. Il mezzo di trasfezione finale conteneva ASO a una concentrazione di 100 nM.
    7. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di coltura cellulare contenente le cellule da trasfettare e aggiungere 7,5 mL di terreno di trasfezione direttamente al monostrato cellulare goccia a goccia per garantire che il terreno sia distribuito uniformemente su tutta la superficie agitando delicatamente la piastra.
    8. Incubare a 37 °C in un incubatore utilizzando il 5% di CO2 in aria per 6 ore.
    9. Dopo 6 ore di incubazione con il terreno di trasfezione, aggiungere 7,5 mL di terreno completo alle cellule e incubare in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
  4. Valutare le cellule al microscopio ogni 12-24 ore fino a quando le cellule non sono pronte per il successivo ciclo di trasfezione.
    NOTA: Successivamente, la trasfezione deve essere eseguita quando le cellule raggiungono una confluenza del 70%. Se necessario, sostituire il terreno sostituendolo con un terreno di coltura completo.
  5. Quando le cellule sono confluenti al 70% nella piastra di coltura cellulare, ripetere la procedura (passaggi da 3.1 a 3.4) ed eseguire il ciclo successivo di trasfezione.
    NOTA: Dopo la seconda trasfezione, le cellule devono essere valutate al microscopio ogni 12-24 ore. La raccolta e il passaggio delle cellule devono essere eseguiti quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80%-85%. Se necessario, sostituire il terreno sostituendolo con un terreno di coltura completo.

4. Raccolta e passaggio delle cellule

NOTA: La raccolta e il passaggio delle cellule vengono eseguiti ogni 2 cicli di trasfezione e dopo il 2°, 4° e 6° ciclo di trasfezione. Il tempo medio per il prelievo nelle cellule HCT116 è stato di 6 giorni dopo la1a, 3ae 5a trasfezione, mentre per le cellule PrEC, il tempo medio è stato di 7 giorni dopo la1a, 3a e 5atrasfezione. Il punto temporale per la trasfezione differisce per entrambe le linee cellulari utilizzate in questo protocollo. Per HCT116, la2a, 3a, 4a, 5a e 6a trasfezione vengono eseguite rispettivamente 3, 6, 9, 12 e 15 giorni dopo la prima trasfezione. Per la PrEC, la2a,3a,4a, 5a e 6a trasfezione vengono eseguite rispettivamente 3, 7, 10, 14 e 18 giorni dopo la prima trasfezione. Fare riferimento alla sequenza temporale nella Figura 3 per controllare i punti temporali per la trasfezione, il passaggio e la raccolta.

  1. Eseguire la raccolta e il passaggio delle cellule per gli esperimenti KD in piastre di coltura da 100 mm come descritto di seguito.
    1. Procedi alla raccolta delle cellule e al passaggio quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80%-85%.
    2. Riscaldare l'intero fluido e lavare le soluzioni a 37 °C. Riscaldare il reagente di dissociazione a temperatura ambiente. Riscaldare la soluzione neutralizzante per il reagente di dissociazione a temperatura ambiente.
      NOTA: Le soluzioni di lavaggio, i reagenti di dissociazione e le soluzioni neutralizzanti differiscono per le due linee cellulari utilizzate in questo protocollo. Le cellule HCT116 vengono lavate con PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) e dissociate con soluzione di tripsina-EDTA. La neutralizzazione del reagente di dissociazione viene eseguita con terreni di coltura completi per le cellule HCT116. Per la PrEC, come soluzione di lavaggio viene utilizzata una soluzione salina tamponata con HEPES. La tripsina-EDTA è usata come reagente di dissociazione. Per la neutralizzazione del reagente di dissociazione, utilizzare una soluzione neutralizzante della tripsina.
    3. All'interno della cappa di coltura, rimuovere i terreni di coltura dalla piastra di coltura cellulare e lavare delicatamente con 3 mL di soluzione di lavaggio, quindi scartare la soluzione di lavaggio. Ripetere questo passaggio 2 volte.
    4. Aggiungere 2 mL di reagente di dissociazione secondo la linea cellulare al monostrato cellulare e incubare a 37 °C per 3-5 minuti. Valutare le cellule ogni 2 minuti fino al completamento della dissociazione.
    5. Aggiungere 2 mL di soluzione neutralizzante in base alla linea cellulare e trasferire l'intero volume della sospensione cellulare dal piatto di coltura cellulare a una provetta da centrifuga conica da 15 mL.
    6. Per l'estrazione dell'RNA, prelevare 500 μl della sospensione cellulare e trasferirla in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Posizionare la provetta sul ghiaccio e procedere al passaggio 5.1 per l'estrazione dell'RNA e la RT-qPCR.
    7. Centrifugare il resto della sospensione cellulare a 120 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
    8. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno di coltura completo e procedere alla conta delle cellule secondo le procedure standard.
    9. Per il cariotipo, seminare le cellule a una densità di 1 x 104 cellule/cm2 in una piastra di coltura cellulare di 35 mm di diametro (superficie di 9 cm2), incubare in un incubatore a 37 °C al 5% di CO2 in aria per 24 ore e procedere al cariotipo secondo le procedure standard.
    10. Per continuare gli esperimenti di KD nel successivo passaggio cellulare, seminare le cellule a una densità di 1 x 104 cellule/cm2 in una nuova piastra di coltura cellulare di 100 mm di diametro. Questa parabola sarà il passaggio numero 2 per l'esperimento. Incubare a 37 °C in incubatore utilizzando il 5% di CO2 in aria fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 50%.
      NOTA: Se lo si desidera, le cellule rimanenti possono essere utilizzate per l'estrazione e/o il congelamento delle proteine secondo le procedure standard.
    11. Ripetere i passaggi da 3.1 a 4.1.10 per la trasfezione e la raccolta dal passaggio 2 e dal passaggio 3.
  2. Seguire la procedura successiva per la raccolta delle cellule per i punti di controllo degli esperimenti KD in piastre di coltura da 35 mm.
    NOTA: La raccolta per il primo checkpoint nell'esperimento KD viene eseguita 2 giorni dopo la 2ae la 4a procedura di trasfezione.
    1. Riscaldare il fluido completo e le soluzioni di lavaggio a 37 °C. Riscaldare il reagente di dissociazione a temperatura ambiente. Riscaldare la soluzione neutralizzante per il reagente di dissociazione a temperatura ambiente.
    2. All'interno della cappa di coltura, rimuovere i terreni di coltura dalla piastra di coltura cellulare e lavare delicatamente con 0,5 mL di soluzione di lavaggio, quindi eliminare la soluzione di lavaggio. Ripetere questo passaggio 2 volte.
    3. Dopo aver scartato le soluzioni di lavaggio, aggiungere 0,5 mL di reagente di dissociazione secondo la linea cellulare e incubare a 37 °C per 3-5 minuti. Valutare le cellule ogni 2 minuti fino al completamento della dissociazione.
    4. Aggiungere 0,5 mL di soluzione neutralizzante in base alla linea cellulare e trasferire l'intero volume della sospensione cellulare dal piatto di coltura cellulare a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e posizionarla sul ghiaccio.
    5. Procedere al passaggio 5.1 per l'estrazione dell'RNA e la qPCR.

5. Estrazione dell'RNA e RT-PCR

  1. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 2 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Lavare il pellet della cella con 600 μL di PBS freddo (4 °C).
  2. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 2 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    Utilizzare il pellet cellulare per l'estrazione dell'RNA secondo le procedure standard.
  3. Procedere al trattamento con DNasi dell'RNA purificato secondo la procedura standard seguita in laboratorio. Al punto di pausa, conservare l'RNA purificato a -80 °C per lunghi periodi.
  4. Utilizzare l'RNA per la sintesi standard del cDNA con ogni campione di RNA ottenuto. Al punto di pausa, conservare il cDNA a -20 °C per lunghi periodi.
  5. Eseguire la qPCR standard secondo i passaggi descritti di seguito.
    1. Per la qPCR, gli oligonucleotidi amplificano i seguenti trascritti: lncRNA di interesse, MALAT1 e un gene costitutivamente espresso come controllo interno (Tabella 1). Per questo protocollo, l'espressione RPS28 è stata utilizzata come controllo interno.
    2. Eseguire reazioni qPCR per amplificare il controllo interno, l'lncRNA di interesse e MALAT1 utilizzando il cDNA del campione ASO-LacZ. Questo esempio verrà utilizzato per normalizzare l'espressione degli altri campioni.
    3. Eseguire reazioni qPCR per amplificare il controllo interno RPS28 e l'lncRNA di interesse utilizzando il cDNA dal campione di ASO-lncRNA.
    4. Eseguire reazioni qPCR per amplificare i controlli interni RPS28 e MALAT1 utilizzando il cDNA del campione ASO-MALAT1. Seguire l'impostazione della reazione e le condizioni del termociclatore come descritto nella Tabella 2.
    5. Analizzare i dati qPCR mediante normalizzazione ΔΔCt dell'espressione del trascritto di interesse rispetto al controllo interno, quindi normalizzare l'espressione del trascritto di interesse (lncRNA o MALAT1) rispetto all'espressione dello stesso trascritto nel campione ASO-LacZ per ottenere il livello di espressione relativo del trascritto.

Risultati

Nel presente protocollo, l'uso di ASO è stato adattato alla KD di un lncRNA nucleare per un tempo prolungato nelle linee cellulari umane PrEC e HCT116.

Certamente, l'esperimento KD ha avuto successo nella linea cellulare PrEC per 21 giorni dell'esperimento, come osservato in Figura 4. Per confermare questa affermazione, oltre ad analizzare l'espressione nei giorni di passaggio cellulare (Figura 4

Discussione

Come accennato in precedenza, gli lncRNA hanno funzioni regolatorie chiave nella cellula; Pertanto, la disregolazione di questi trascritti può essere coinvolta nelle malattie. Il cancro è una di queste malattie caratterizzate da disregolazione degli lncRNA43,44. In questa malattia, gli lncRNA sono noti per svolgere importanti ruoli regolatori come oncogeni45 o soppressori tumorali46

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Montiel-Manriquez, Rogelio è uno studente di dottorato del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e ha ricevuto una borsa di studio CONACyT con numero CONACyT CVU: 581151.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
15ml Centrifuge Tubes - 15ml Conical TubesThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm TC-treated Culture DishCorning 430167Surface area:55 cm2
Corning 35 mm TC-treated Culture DishCorning 430165Surface area: 9 cm2
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
Fetal Bovine Serum (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 cell lineATCCCCL-247
HEPES, 1M Buffer SolutionThermo Fisher Scientific15630122
Integrated DNA Technologies NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX ReagentThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A medium ATCC30-2007
Normal Human Primary Prostate Epithelial Cells (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Nucleotide Blast NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Reduced Serum MediaThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific
Prostate Epithelial Cell Basal MediumATCCPCS-440-030
Prostate Epithelial Cell Growth KitATCCPCS-440-040
Reverse complement online toolNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher Scientific12604013Trypsin-EDTA solution
Trypsin Neutralizing SolutionATCCPCS-999-004
Trypsin-EDTA for Primary CellsATCCPCS-999-003
UCSC Genome Browser, Human (GRCh38/hg38)NANAhttps://genome.ucsc.edu/

Riferimenti

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