JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

염색체 불안정성과 같은 시간 의존적 과정에서 lncRNA의 기능을 분석하려면 장기간의 녹다운 효과를 달성해야 합니다. 이를 위해 여기에 제시된 프로토콜은 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 21일 동안 세포주에서 효과적인 녹다운을 달성하는 프로토콜입니다.

초록

긴 비암호화 RNA(lncRNA)는 전사 수준에서 유전자 발현에 중요한 조절 역할을 합니다. 실험적 증거는 lncRNA의 상당한 부분이 핵에 우선적으로 축적된다는 것을 입증했습니다. 핵 lncRNA의 기능을 분석하기 위해서는 핵 내부에서 이러한 전사체를 효율적으로 녹다운하는 것이 중요합니다. 세포질 침묵 기계에 의존하는 기술인 RNA 간섭의 사용과 대조적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 기술은 핵 RNA 절단을 위해 RNase H를 RNA-DNA 듀플렉스에 모집하여 RNA 녹다운을 달성할 수 있습니다. 염색질 상태의 가능한 변경이 발생할 수 있는 게놈 엔지니어링에 CRISPR-Cas 도구를 사용하는 것과 달리 ASO는 게놈을 수정하지 않고 핵 전사체를 효율적으로 녹다운할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 ASO 매개 녹다운의 주요 장애물 중 하나는 일시적인 효과입니다. lncRNA 침묵의 오래 지속되는 효과에 대한 연구를 위해서는 장기간 동안 효율적인 녹다운을 유지하는 것이 필요합니다. 본 연구에서는 21일 이상 녹다운 효과를 얻을 수 있는 프로토콜을 개발하였다. 그 목적은 시간과 세포 노화를 통해서만 관찰되는 상태인 염색체 불안정성과 관련된 인접한 코딩 유전자 RFC4에 대한 lncRNA 녹다운의 시스 조절 효과를 평가하는 것이었습니다. 두 개의 서로 다른 인간 세포주, 즉 정상 원발성 전립선 상피 세포인 PrEC와 결장직장 암종에서 분리된 상피 세포주인 HCT116을 사용하여 분석된 세포주에서 성공적인 녹다운을 달성했습니다.

서문

인간 게놈의 대다수는 전사되어 lncRNA를 포함한 다양한 전사체를 생성하며, 이는 인간 전사체에서 주석이 달린 코딩 유전자의 수를 초과합니다1. LncRNAs는 단백질을 암호화하지 않는 200개의 뉴클레오티드보다 긴 전사체이며, 2,3 세포4에서 중요한 조절 기능에 대해 최근에 검사되었습니다. 그들의 기능은 lncRNAs의 상당한 부분이 축적되고 활발하게 전사 조절6 및 핵 구조 유지 보수7에 참여하는 핵과 같은 세포 내 국소화5에 의존하는 것으로 나타났습니다8 , 9 , 10 .

핵 lncRNA의 기능적 특성화를 위해서는 핵에서 녹다운(KD)을 유도할 수 있는 방법을 사용해야 하며, ASO는 핵 전사체를 침묵시키는 강력한 도구입니다. 일반적으로 ASO는 왓슨-크릭 염기쌍 11,12,13에 의해 상보적 RNA에 결합하는 ~20 염기쌍 길이의 단일 가닥 DNA 염기서열이며, 이들의 화학적 구조 및 변형13,14에 의존하는 메커니즘을 통해 RNA의 기능을 변형할 수 있습니다. ASO 화학적 변형은 2개의 주요 그룹으로 나눌 수 있습니다: 골격 변형 및 2' 설탕 고리 변형15, 둘 다 뉴클레아제에 높은 내성을 부여하여 안정성을 증가시키는 것을 목적으로 할 뿐만 아니라 의도된 생물학적 효과를 향상시키기 위한 것입니다13,16. 골격 변형 중에서, 인산화성 모르폴리노(PMO), 티오포스포라미데이트 및 모르폴리노 결합은 입체 차단제(19)로서 작용함으로써접합 17,18의 간섭과 같은 목적으로 널리 사용되지만, 전사체의 분해를 유도하지는 않는다. 또 다른 골격 변형은 ASO에서 가장 일반적으로 사용되는 변형 중 하나인 포스포로티오에이트(PS) 결합입니다. 앞서 언급한 변형과 대조적으로, PS 결합은 RNase H 모집12,20을 방해하지 않으므로 RNA 녹다운을 허용합니다. 그러나, 또한 매우 다양한 2' 슈가 링 변형체(21)가 존재한다. 그럼에도 불구하고, RNA 녹다운을 위해 효율적인 침묵 효과를 유도하는 변형 중에는 고정 핵산(LNA)22, 23 및 2'-O-메틸 변형24가 있습니다. LNA는 다른 변형25에 비해 knockdown에 매우 효과적인 것으로 입증되었지만, 간독성26 및 in vivo 및 in vitro27 세포사멸 유도와 같은 원치 않는 효과를 유발할 수 있습니다.

RNA 녹다운을 위해 앞서 언급한 적절한 변형을 가진 ASO는 RNase H1 및 H220,28을 모집할 수 있으며, 이러한 효소는 DNA-RNA 하이브리드로 모집되어 표적 RNA를 절단하여 ASO13을 방출합니다. 이 절단의 RNA 산물은 RNA 감시 기계에 의해 처리되어 염색질 상태의 변형이 원치 않는 생물학적 효과30를 생성할 수 있는 CRISPR-Cas 시스템과 같은 다른 기술과 달리 관심 게놈 영역을 변형하지 않고 RNA 분해29를 초래합니다. ASO 기술의 장점에도 불구하고 시간 경과에 따른 세포 분열 또는 ASO 분해로 인한 일시적인 침묵 효과는 염색체 불안정성(CIN)31과 같은 시간 의존적 과정을 연구할 때 극복해야 할 장애물입니다.

특히, CIN은 정상 세포에 비해 염색체 수 및 구조의 변화율이 증가한 것으로 정의되며32 유사분열 중 염색체 분리의 오류로 인해 발생하며, 시간이 지남에 따라 종양 내 이질성33을 유발하는 유전적 변형을 초래합니다. 따라서 CIN은 이수성 핵형을 찾는 것만으로는 평가할 수 없습니다. 세포 배양에서 CIN에 대한 적절한 연구 및 평가를 위해서는 시간 경과에 따른 세포를 모니터링하는 것이 중요합니다. CIN에 대한 lncRNA KD의 효과를 연구하기 위해서는 KD 효과를 연장할 수 있는 방법론이 필요합니다. 이를 위해 이 프로토콜에는 ASO가 사용되었으며, 여기서 lncRNA-RFC4는 인간 세포주 HCT115 및 PrEC에서 각각 18일 및 21일 동안 성공적으로 침묵시켰습니다. 이 전사체는 길이가 1.2kb인 특성화되지 않은 lncRNA이며 게놈 위치는 염색체 3(q27.3)에 있습니다. 그것은 단백질 코딩 유전자 RFC4, 다른 유형의 인간 암에서 CIN과 관련된 유전자 34,35,36에 인접 해 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

알림: 이 프로토콜은 실험실 안전 절차에 대한 경험이 있는 실험실 직원만 수행하기 위한 것입니다. 위험 물질 및 장비 취급을 시작하기 전에 이 프로토콜에 사용된 모든 시약 및 물질의 안전 데이터 시트를 올바르게 읽는 것이 중요합니다. 전체 프로토콜에 따라 기관의 실험실 안전 매뉴얼에 표시된 모든 안전 요구 사항을 읽고, 이해하고, 충족하는 것이 중요합니다. 모든 생물학적 및 화학적 폐기물의 처리는 기관의 폐기물 관리 및 처리 매뉴얼에 따라 수행되어야 합니다. 주의해서 안전한 실험실 관행에 따라 취급하지 않으면 이 프로토콜에 사용된 재료 및 장비는 심각한 부상을 초래할 수 있습니다. 항상 기관의 안전 실험실 매뉴얼 및 안전 절차를 따르십시오.

1. ASO의 설계

  1. 아래 설명된 대로 ASO를 수동으로 설계합니다.
    1. 타겟 전사체의 전체 염기서열을 얻고 웹사이트의 기본 매개변수를 사용하여 RNAfold WebServer, University of Vienna37 (Table of Materials)에서 분석하여 최소 자유 에너지(MFE) 2차 구조를 얻습니다.
    2. 결과가 준비되면 MFE 일반 구조 도면으로 이동하고 View In Forna 를 클릭하여 웹 사이트에서 MFE 2차 구조를 열면 소프트웨어가 분석된 성적표의 예측된 2차 구조를 표시합니다.
    3. 예측된 MFE 2차 구조에서 RNA에서 20bp 길이의 영역을 선택하여 올리고뉴클레오티드를 설계할 때 G-string(3개의 구아닌이 연속으로 있는 서열)을 피합니다. ASO에 가장 적합한 대상 영역을 선택하려면 내부 염기쌍의 확률이 더 낮을 것으로 예측되는 영역을 사용합니다(그림 1).
    4. 선택한 20bp 영역에서 역보수 염기서열을 생성합니다. 역보수를 수동으로 생성하거나 역보수(reverse complement) 온라인 도구(Table of Materials)를 사용합니다. 역보수 염기서열은 실험을 위해 합성해야 하는 ASO입니다.
    5. Nucleotide Blast NCBI(blastn) 및 UCSC Genome Browser on Human(GRCh38/hg38)을 사용하여 ASO 염기서열을 분석합니다. ASO가 인간 게놈의 다른 전사체 또는 다른 게놈 영역과 상동성을 나타내지 않는지 확인합니다.
      참고: ASO 합성 및 정제는 상업 회사에서 수행했습니다(재료 표).
  2. 합성된 올리고뉴클레오티드가 다음과 같은 특성을 갖는지 확인하십시오.
    1. 올리고뉴클레오티드38 의 전체 염기서열을 따라 PS 결합을 확인합니다(그림 2A). ASO가 키메릭이며, 5' 및 3' 끝 부분에 2'-O-메틸로 변형된 당 고리가 있는 5개의 뉴클레오티드가 있는지 확인합니다(그림 2B).
    2. 중간에 있는 10개의 뉴클레오티드에 RNase H 결합을 지원하기 위해 변형되지 않은 설탕 고리가 있는지 확인합니다(그림 2C).
    3. 표준 탈염 및 역상(RP) HPLC39를 사용하여 정제를 수행하도록 회사에 요청합니다.
    4. 동결건조 형식으로 ASO 배송을 주문합니다.
  3. 동결건조된 ASO를 칼슘과 마그네슘 없이 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 최종 농도 200μM까지 용해합니다.-20°C에서 보관합니다.
  4. 농축된 원액을 20μM의 농도로 희석하여 ASO의 작업 용액을 준비합니다. DPBS를 사용하여 희석액을 준비합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
    참고: 이 연구를 위해 lncRNA-RFC4를 표적으로 하는 두 개의 ASO가 설계되었습니다. 형질주입 및 효율성을 위한 ASO 농도의 최적화를 위해 Zong et al.40 의 프로토콜을 따랐습니다. Zong의 프로토콜에 따라 ASO-lncRFC4 및 ASO-lncRFC4-2의 두 ASO가 설계되고 실험적으로 최적화되었습니다. 최적화 후, lncRNA-RFC4를 표적으로 하는 하나의 효과적인 ASO, ASO-lncRFC4를 연장된 녹다운 프로토콜에 대해 선택했습니다(보충 그림 1). 양성 대조군으로, 이전에 확인된 효율적인 ASO 표적 lncRNA MALAT18 : ASO-MALAT1이 사용되었습니다. 음성 대조군의 경우, 대장균 lacZ 유전자를 표적으로 하는 ASO-lacZ(NCBI 등록 번호: FN297865)를 설계했습니다.

2. 세포의 준비

참고: 세포 배양 조작 중에 사용되는 세포주, 용액, 재료 또는 제품을 처리할 때마다 세포 배양 후드 내부에서 작업하십시오. 세포 배양을 위해 액체를 조작할 때는 항상 멸균된 혈청학적 피펫 또는 멸균된 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하십시오. 전체 프로토콜 동안 항상 기관의 실험실 안전 매뉴얼에 표시된 모든 안전 요구 사항을 충족하고 따르십시오.

  1. 하기 설명된 바와 같이 각 세포주에 대한 완전한 세포 배양 배지를 준비합니다.
    1. HCT116의 경우, 10%의 소 태아 혈청(FBS)이 함유된 McCoy's 5A 배지를 준비합니다.
    2. PrEC의 경우, 전립선 상피 세포 성장 키트를 사용하여 전립선 상피 세포 기저 배지를 준비합니다.
  2. KD 실험을 위해 3개의 100mm 배양 플레이트(55cm2 표면적)를 사용하며, 사용할 각 올리고뉴클레오티드에 대해 하나씩: lncRNA를 표적으로 하는 ASO, 양성 대조군(ASO-MALAT1)으로 사용되는 ASO, 음성 대조군(ASO-lacZ)으로 사용되는 ASO.
  3. 두 개의 35mm 배양 플레이트(표면적9cm2 )를 세포 통로 사이의 KD에 대한 체크포인트로 사용하며, 그 중 하나는 ASO-lncRFC4용 완전 형질주입 배지로 형질주입되고 다른 하나는 ASO-lacZ용으로 형질주입됩니다.
    참고: 형질주입은 이전에 보고된 지질 기반 형질주입 시약(재료표 참조) 제조업체의 절차 및 프로토콜(41,42)에 따라 계획되었습니다.
  4. 세포 배양 접시에서 1 x 104 cells/cm2 의 밀도로 세포를 종자합니다. 세포가 50% 포화도에 도달할 때까지 공기 중 5% CO2 를 사용하여 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다(표면의 50%가 세포 단층으로 덮인 경우). 50%의 confluence로 세포는 이 프로토콜에 대해 transfection할 준비가 된 것입니다.
    참고: ASO-lncRFC4 및 ASO-lacZ의 transfection을 위해 100mm 접시 1개와 35mm 접시 1개를 파종했습니다. ASO-MALAT1의 transfection을 위해 100mm 접시만 파종했습니다(그림 3A).

3. 형질주입(Transfection)

  1. 시술을 시작하기 전에 혈청 매체를 37°C로 낮추어 예열합니다.
  2. ASO-lacZ 및 ASO-lncRFC4를 사용한 transfection의 경우 아래 설명된 단계를 따르십시오.
    참고: ASO-lacZ 및 ASO-lncRFC4를 사용한 형질주입은 55cm 2의 표면적에 있는 세포에 대해 계획되어 있습니다. 다른 영역을 사용하는 경우 그에 따라 볼륨을 조정할 수 있습니다. 이 절차는 동일한 조건에서 사용되는 각 ASO에 대해 수행해야 합니다.
    1. 15mL 원추형 원심분리 튜브에 1.4mL의 온난 환원 혈청 배지에 43.75μL의 ASO(20μM)를 용해하여 세포 배양 후드 내부에 튜브 1을 준비합니다.
    2. 1.5mL RNase-free 마이크로분리 튜브에서 18.66μL의 지질 기반 transfection 시약과 1.4mL의 온난환원 혈청 배지를 혼합하여 세포 배양 후드 내부에 튜브 2를 준비합니다.
    3. 튜브 1과 2를 실온에서 10분 동안 세포 배양 후드 내부로 배양합니다.
    4. 튜브 2(트랜스펙션 시약 + 환원 혈청)에 포함된 용액을 튜브 1(ASO + 환원 혈청)에 직접 천천히 한 방울씩 첨가하여 시약이 튜브 표면에 퍼지는 것을 방지합니다.
    5. 튜브 1에 포함된 혼합물을 실온에서 배양 후드 내부에 20분 동안 배양합니다.
    6. 튜브 1의 온열 환원 혈청 배지를 최종 용량 8.75mL에 추가합니다.
      참고: 최종 transfection 배지에는 100nM 농도의 ASO가 포함되어 있습니다.
    7. transfection할 세포가 들어 있는 세포 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 7.5mL의 transfection 배지를 100mm 배양 플레이트에 추가하고 1mL를 세포 단층에 직접 한 방울씩 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 매체가 전체 표면을 따라 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
    8. 37 ° C의 인큐베이터에서 5 % CO2 와 함께 공기 중 6 시간 동안 배양합니다.
    9. 형질주입 배지에서 6시간 배양 후 100mm 배양 플레이트의 세포에 7.5mL의 완전 배지를 추가하고 35mm 배양 플레이트의 세포에 1mL의 완전 배지를 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 배양하십시오.
  3. ASO-MALAT1을 사용한 transfection의 경우 아래 설명된 대로 실험을 수행합니다.
    참고: ASO-MALAT1을 사용한 transfection은 55cm2의 표면적에 있는 세포에 대해 계획되어 있습니다.
    1. 15mL 코니컬 원심분리 튜브에 1.2mL의 온온 환원 혈청 배지에 37.5μL의 ASO(20μM)를 용해하여 세포 배양 후드 내부에 튜브 1을 준비합니다.
    2. 16μL의 지질 기반 transfection 시약과 1.2mL의 온열 환원 혈청 배지를 혼합하여 튜브 2를 준비합니다.
    3. 튜브 1과 2를 세포 배양 후드 내부에서 10분 동안 실온에서 배양합니다.
    4. 튜브 2(지질 기반 트랜스펙션 시약 + 환원 혈청)에 포함된 용액을 튜브 1(ASO + 환원 혈청)에 직접 천천히 한 방울씩 첨가하여 시약이 튜브 표면에 퍼지는 것을 방지합니다.
    5. 튜브 1에 포함된 혼합물을 실온에서 배양 후드 내부에 20분 동안 배양합니다.
    6. 튜브 1의 온열 감소 세럼 배지를 최종 부피 7.5mL에 추가합니다. 최종 형질주입 배지는 100nM 농도의 ASO를 함유했습니다.
    7. transfection할 세포가 들어 있는 세포 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 접시를 부드럽게 흔들어 배지가 전체 표면을 따라 고르게 분포되도록 하기 위해 7.5mL의 transfection 배지를 세포 단층에 직접 적가합니다.
    8. 공기 중 5% CO2 를 사용하여 인큐베이터에서 37°C에서 6시간 동안 배양합니다.
    9. 형질주입 배지로 6시간 배양 후 7.5mL의 완전한 배지를 세포에 추가하고 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에서 배양합니다.
  4. 세포가 다음 transfection 라운드를 위해 준비될 때까지 12-24시간마다 현미경으로 세포를 평가합니다.
    참고: 다음으로, 세포가 70%의 합류점에 도달할 때 transfection을 수행해야 합니다. 필요한 경우 완전한 배양 배지로 교체하는 배지를 교환합니다.
  5. 세포 배양 접시에서 세포가 70% 밀집되면 절차(3.1 - 3.4 단계)를 반복하고 다음 라운드 transfection을 수행합니다.
    참고: 두 번째 transfection 후 12-24시간마다 현미경으로 세포를 평가해야 합니다. 세포 수확 및 계대 배양은 세포가 80%-85%의 합류를 달성할 때 수행해야 합니다. 필요한 경우 완전한 배양 배지로 교체하는 배지를 교환합니다.

4. 세포 수확 및 패시징

참고: 세포 수확 및 계대 배양은 2회의 transfection 후마다, 그리고 2차, 4차 및 6차 transfection 후에 수행됩니다. HCT116 세포에서 수확을 위한 평균 시간은 1차, 3차 및 5차 형질주입 후 6일이었고, PrEC 세포의 경우 1차, 3차 및 5차 형질주입 후 평균 시간은 7일이었다. transfection의 시점은 이 프로토콜에 사용되는 두 세포주에 따라 다릅니다. HCT116의 경우, 2차, 3차, 4차, 5차 및 6차 형질주입은 각각 첫 번째 형질주입 후 3일, 6일, 9일, 12일 및 15일에 수행됩니다. PrEC의 경우, 2번째, 3번째, 4번째, 5번째 및 6번째 형질주입은 각각 첫 번째 형질주입 후 3일, 7일, 10일, 14일 및 18일에 수행된다. 그림 3의 타임라인을 참조하여 transfection, passaging 및 harvesting의 시점을 확인하십시오.

  1. 아래와 같이 100mm 배양 플레이트에서 KD 실험을 위한 세포 수확 및 계대 태양을 수행합니다.
    1. 세포를 수확하고 세포가 80%-85%의 합류를 달성하면 통과를 진행합니다.
    2. 전체 배지를 예열하고 용액을 37°C로 세척합니다. 해리 시약을 실온으로 예열합니다. 해리 시약에 대한 중화 용액을 실온으로 예열합니다.
      참고: 세척 용액, 해리 시약 및 중화 용액은 이 프로토콜에 사용되는 두 세포주에 따라 다릅니다. HCT116 세포는 PBS(인산염 완충 식염수)로 세척하고 트립신-EDTA 용액으로 해리합니다. 해리 시약의 중화는 HCT116 세포에 대한 완전 배양 배지를 사용하여 수행됩니다. PrEC의 경우 HEPES 완충 식염수가 세척 용액으로 사용됩니다. 트립신-EDTA는 해리 시약으로 사용됩니다. dissociation reagent의 중화를 위해서는 trypsin neutralizing solution을 사용하십시오.
    3. 배양 후드 내부에서 세포 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 세척액 3mL로 부드럽게 세척한 후 세척액을 버립니다. 이 단계를 2회 반복합니다.
    4. 세포주에 따라 2mL의 해리 시약을 세포 단층에 첨가하고 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다. 해리가 완료될 때까지 2분마다 세포를 평가합니다.
    5. 세포주에 따라 2mL의 중화 용액을 추가하고 세포 배양 접시에서 세포 현탁액의 전체 부피를 15mL 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    6. RNA 추출을 위해 세포 현탁액 500μL를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 RNA 추출 및 RT-qPCR을 위한 5.1단계로 진행합니다.
    7. 나머지 세포 현탁액을 실온에서 120 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    8. 세포 펠렛을 2mL의 완전 배양 배지에 재현탁하고 표준 절차에 따라 세포 계수를 진행합니다.
    9. 핵형 분석을 위해 직경 35mm(표면적 9cm2)의 세포 배양 접시에서 종자 세포를 1 x 104 cells/cm2의 밀도로 배양하고, 공기 중 5%CO2에서 37°C의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하고 표준 절차에 따라 핵형 분석을 진행합니다.
    10. 다음 세포 계대에서 KD 실험을 계속하기 위해 직경 100mm의 새로운 세포 배양 접시에 1 x 104 cells/cm2 의 밀도로 세포를 시드합니다. 이 요리는 실험의 통로 번호 2가 될 것입니다. 세포가 50%의 합류점에 도달할 때까지 공기 중 5% CO2 를 사용하여 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
      참고: 원하는 경우 나머지 세포는 표준 절차에 따라 단백질 추출 및/또는 동결에 사용할 수 있습니다.
    11. 3.1단계부터 4.1.10단계까지 반복하여 2번 통과와 3번 통로에서 transfection과 harvesting을 수행합니다.
  2. 35mm 배양 접시에서 KD 실험의 체크포인트에 대한 세포 수확을 위한 다음 절차를 따릅니다.
    참고: KD 실험의 첫 번째 체크포인트에 대한 수확은 2차 및 4차 transfection 절차 후 2일 후에 수행됩니다.
    1. 전체 매체와 세척 용액을 37°C로 예열합니다. 해리 시약을 실온으로 예열합니다. 해리 시약에 대한 중화 용액을 실온으로 예열합니다.
    2. 배양 후드 내부에서 세포 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 0.5mL의 세척액으로 부드럽게 세척한 후 세척액을 버립니다. 이 단계를 2회 반복합니다.
    3. 세척액을 버린 후 세포주에 따라 0.5mL의 해리 시약을 첨가하고 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다. 해리가 완료될 때까지 2분마다 세포를 평가합니다.
    4. 세포주에 따라 0.5mL의 중화용액을 첨가하고 세포 배양 접시에서 세포 현탁액의 전체 부피를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
    5. RNA 추출 및 qPCR에 대한 5.1단계로 진행합니다.

5. RNA 적출과 RT-PCR

  1. 세포 현탁액을 200 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 600μL의 차가운 PBS(4°C)로 세포 펠릿을 세척합니다.
  2. 세포 현탁액을 200 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    표준 절차에 따라 RNA 추출을 위해 세포 펠릿을 사용합니다.
  3. 실험실에서 따랐던 표준 절차에 따라 정제된 RNA의 DNase 처리를 진행합니다. 일시 중지 지점에서 정제된 RNA를 -80°C에서 장기간 보관합니다.
  4. 얻은 모든 RNA 샘플과 함께 표준 cDNA 합성을 위해 RNA를 사용합니다. 일시 중지 지점에서 cDNA를 -20°C에서 장기간 보관합니다.
  5. 아래 설명된 단계에 따라 표준 qPCR을 수행합니다.
    1. qPCR의 경우, 올리고뉴클레오티드는 관심 있는 lncRNA, MALAT1 및 내부 대조군으로 구성적으로 발현된 유전자와 같은 전사체를 증폭합니다(표 1). 이 프로토콜의 경우 RPS28 표현식이 내부 제어로 사용되었습니다.
    2. ASO-LacZ 샘플의 cDNA를 사용하여 내부 대조군, 관심 lncRNA 및 MALAT1을 증폭하기 위해 qPCR 반응을 수행합니다. 이 샘플은 다른 샘플의 표현식을 정규화하는 데 사용됩니다.
    3. ASO-lncRNA 샘플의 cDNA를 사용하여 내부 대조군 RPS28 및 관심 있는 lncRNA를 증폭하기 위해 qPCR 반응을 수행합니다.
    4. ASO-MALAT1 샘플의 cDNA를 사용하여 qPCR 반응을 수행하여 내부 대조군 RPS28 및 MALAT1을 증폭합니다. 표 2에 설명된 대로 반응 설정 및 열순환기 조건을 따릅니다.
    5. 내부 대조군에 대해 관심 전사체 발현의 ΔΔCt 정규화로 qPCR 데이터를 분석한 다음 ASO-LacZ 샘플에서 동일한 전사체의 발현에 대해 관심 전사체(lncRNA 또는 MALAT1)의 발현을 정규화하여 전사체의 상대적 발현 수준을 얻습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

본 프로토콜에서 ASO의 사용은 인간 세포주 PrEC 및 HCT116에서 장기간 동안 핵 lncRNA의 KD에 적응되었습니다.

확실히, KD 실험은 그림 4에서 관찰된 바와 같이 실험 21일 동안 세포주 PrEC에서 성공적이었습니다. 이 진술을 확인하기 위해 세포 통과 당시의 발현을 분석하는 것 외에도(그림 4 A-C) 1과 2 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

앞서 언급한 바와 같이, lncRNAs는 세포에서 핵심적인 조절 기능을 가지고 있습니다. 따라서, 이러한 전사체의 조절 장애는 질병에 관여할 수 있습니다. 암은 lncRNA 조절 장애를 특징으로 하는 그러한 질병중 하나입니다 43,44. 이 질환에서 lncRNA는 종양유전자(oncogenes) 45 또는 종양 억제인자(tumor suppressor)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

Montiel-Manriquez, Rogelio는 Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)의 Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas에서 박사 과정을 밟고 있으며 CONACyT CVU 번호 : 581151로 CONACyT 펠로우십을 받았습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
15ml Centrifuge Tubes - 15ml Conical TubesThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm TC-treated Culture DishCorning 430167Surface area:55 cm2
Corning 35 mm TC-treated Culture DishCorning 430165Surface area: 9 cm2
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
Fetal Bovine Serum (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 cell lineATCCCCL-247
HEPES, 1M Buffer SolutionThermo Fisher Scientific15630122
Integrated DNA Technologies NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX ReagentThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A medium ATCC30-2007
Normal Human Primary Prostate Epithelial Cells (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Nucleotide Blast NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Reduced Serum MediaThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific
Prostate Epithelial Cell Basal MediumATCCPCS-440-030
Prostate Epithelial Cell Growth KitATCCPCS-440-040
Reverse complement online toolNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher Scientific12604013Trypsin-EDTA solution
Trypsin Neutralizing SolutionATCCPCS-999-004
Trypsin-EDTA for Primary CellsATCCPCS-999-003
UCSC Genome Browser, Human (GRCh38/hg38)NANAhttps://genome.ucsc.edu/

참고문헌

  1. Fang, S., et al. NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (Database issue), D308-D314 (2018).
  2. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  3. Palazzo, A. F., Koonin, E. V. Functional Long Non-coding RNAs Evolve from Junk Transcripts. Cell. 183 (5), 1151-1161 (2020).
  4. Ransohoff, J. D., Wei, Y., Khavari, P. A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 143-157 (2017).
  5. Chen, L. L. Linking Long Noncoding RNA Localization and Function. Trends in Biochemical Sciences. 41 (9), 761-772 (2016).
  6. Basu, S., Larsson, E. A Catalogue of Putative cis-Regulatory Interactions Between Long Non-coding RNAs and Proximal Coding Genes Based on Correlative Analysis Across Diverse Human Tumors. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (6), 2019-2025 (2018).
  7. Petermann, F., et al. The Magnitude of IFN-γ Responses Is Fine-Tuned by DNA Architecture and the Non-coding Transcript of Ifng-as1. Molecular Cell. 75 (6), 1229.e5-1242.e5 (2019).
  8. Tripathi, V., et al. The Nuclear-Retained Noncoding RNA MALAT1 Regulates Alternative Splicing by Modulating SR Splicing Factor Phosphorylation. Molecular Cell. 39 (6), 925-938 (2010).
  9. Chen, L. L., Carmichael, G. G. Decoding the function of nuclear long non-coding RNAs. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 357-364 (2010).
  10. Vance, K. W., Ponting, C. P. Transcriptional regulatory functions of nuclear long noncoding RNAs. Trends in Genetics. 30 (8), 348-355 (2014).
  11. Ren, H., Zhang, Z., Zhang, W., Feng, X., Xu, L. Prodrug-type antisense oligonucleotides with enhanced nuclease stability and anti-tumour effects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 162, 105832(2021).
  12. Kole, R. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. DRUG DISCOVERY. 16, (2012).
  13. DeVos, S. L., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics. 10 (3), 486-497 (2013).
  14. Le, B. T., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Angiogenic Factors as Potential Cancer Therapeutics. Molecular Therapy Nucleic Acids. 14, 142-157 (2019).
  15. Shadid, M., Badawi, M., Abulrob, A. Antisense oligonucleotides: absorption, distribution, metabolism, and excretion. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 17 (11), 1281-1292 (2021).
  16. Roberts, T. C., Langer, R., Wood, M. J. A. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (10), 673-694 (2020).
  17. Havens, M. A., Hastings, M. L. Splice-switching antisense oligonucleotides as therapeutic drugs. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6549-6563 (2016).
  18. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), e2114886119(2022).
  19. Lim, K. H., et al. Antisense oligonucleotide modulation of non-productive alternative splicing upregulates gene expression. Nature Communications. 11 (1), 3501(2020).
  20. Crooke, S. T. Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 70-77 (2017).
  21. Monia, B. P., Johnston, J. F., Sasmor, H., Cummins, L. L. Nuclease Resistance and Antisense Activity of Modified Oligonucleotides Targeted to Ha. Journal of Biological Chemistry. 271 (24), 14533-14540 (1996).
  22. Grünweller, A., et al. Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids, 2′-O-methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA. Nucleic Acids Research. 31 (12), 3185-3193 (2003).
  23. Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. 32 (9), 1948-1957 (2018).
  24. Yoo, B. H., Bochkareva, E., Bochkarev, A., Mou, T. C., Gray, D. M. 2′-O-methyl-modified phosphorothioate antisense oligonucleotides have reduced non-specific effects in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (6), 2008-2016 (2004).
  25. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86.e16-101.e16 (2017).
  26. Kasuya, T., et al. Ribonuclease H1-dependent hepatotoxicity caused by locked nucleic acid-modified gapmer antisense oligonucleotides. Scientific Reports. 6 (1), 30377(2016).
  27. Swayze, E. E., et al. Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals. Nucleic Acids Research. 35 (2), 687-700 (2007).
  28. Hyjek, M., Figiel, M., Nowotny, M. RNases H: Structure and mechanism. DNA Repair. 84, 102672(2019).
  29. Lima, W. F., De Hoyos, C. L., Liang, X., Crooke, S. T. RNA cleavage products generated by antisense oligonucleotides and siRNAs are processed by the RNA surveillance machinery. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3351-3363 (2016).
  30. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  31. Drews, R. M., et al. A pan-cancer compendium of chromosomal instability. Nature. 606 (7916), 976-983 (2022).
  32. Benhra, N., Barrio, L., Muzzopappa, M., Milán, M. Chromosomal Instability Induces Cellular Invasion in Epithelial Tissues. Developmental Cell. 47 (2), 161.e4-174.e4 (2018).
  33. Gronroos, E., López-García, C. Tolerance of Chromosomal Instability in Cancer: Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Cancer Research. 78 (23), 6529-6535 (2018).
  34. Liu, L., et al. An RFC4/Notch1 signaling feedback loop promotes NSCLC metastasis and stemness. Nature Communications. 12 (1), 2693(2021).
  35. Shiomi, Y., Nishitani, H. Control of Genome Integrity by RFC Complexes; Conductors of PCNA Loading onto and Unloading from Chromatin during DNA Replication. Genes. 8 (2), (2017).
  36. Carter, S. L., Eklund, A. C., Kohane, I. S., Harris, L. N., Szallasi, Z. A signature of chromosomal instability inferred from gene expression profiles predicts clinical outcome in multiple human cancers. Nature Genetics. 38 (9), 1043-1048 (2006).
  37. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Research. 36 (suppl_2), W70-W74 (2008).
  38. Wan, W. B., et al. Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages. Nucleic Acids Research. 42 (22), 13456-13468 (2014).
  39. Kanavarioti, A. HPLC methods for purity evaluation of man-made single-stranded RNAs. Scientific Reports. 9 (1), 1019(2019).
  40. Zong, X., et al. Knockdown of Nuclear-Retained Long Noncoding RNAs Using Modified DNA Antisense Oligonucleotides. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs: Methods and Protocols. , 321-331 (2015).
  41. Zhao, M., et al. Lipofectamine RNAiMAX: An Efficient siRNA Transfection Reagent in Human Embryonic Stem Cells. Molecular Biotechnology. 40 (1), 19-26 (2008).
  42. Nuclear bodies and noncoding RNAs: methods and protocols. , Humana Press. New York. (2015).
  43. CAWG Drivers and Functional Interpretation Group. Cancer LncRNA Census reveals evidence for deep functional conservation of long noncoding RNAs in tumorigenesis. Communications Biology. 3 (1), 56(2020).
  44. Schmitt, A. M., Chang, H. Y. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer Cell. 29 (4), 452-463 (2016).
  45. Hosono, Y., et al. Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA. Cell. 171 (7), 1559.e20-1572.e20 (2017).
  46. Cho, S. W., et al. Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell. 173 (6), 1398.e22-1412.e22 (2018).
  47. Ding, W., Ren, J., Ren, H., Wang, D. Long Noncoding RNA HOTAIR Modulates MiR-206-mediated Bcl-w Signaling to Facilitate Cell Proliferation in Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  48. Huo, H., et al. Long non-coding RNA NORAD upregulate SIP1 expression to promote cell proliferation and invasion in cervical cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 106, 1454-1460 (2018).
  49. Prensner, J. R., et al. The Long Non-Coding RNA PCAT-1 Promotes Prostate Cancer Cell Proliferation through cMyc. Neoplasia. 16 (11), 900-908 (2014).
  50. Li, H., et al. Long noncoding RNA NORAD, a novel competing endogenous RNA, enhances the hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition to promote metastasis in pancreatic cancer. Molecular Cancer. 16, (2017).
  51. Li, Q., et al. High expression of long noncoding RNA NORAD indicates a poor prognosis and promotes clinical progression and metastasis in bladder cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 36 (6), 310.e15-310.e22 (2018).
  52. Katayama, H., et al. Long non-coding RNA HOTAIR promotes cell migration by upregulating insulin growth factor-binding protein 2 in renal cell carcinoma. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  53. Ling, H., et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24, underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer. Genome Research. 23 (9), 1446-1461 (2013).
  54. Lee, S., et al. Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins. Cell. 164 (1-2), 69-80 (2016).
  55. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  56. Iwamoto, N., et al. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides. Nature Biotechnology. 35 (9), 845-851 (2017).
  57. Naeem, M., Majeed, S., Hoque, M. Z., Ahmad, I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 9 (7), 1608(2020).
  58. Vicente, M. M., Chaves-Ferreira, M., Jorge, J. M. P., Proença, J. T., Barreto, V. M. The Off-Targets of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Gene Editing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, (2021).
  59. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264(2015).
  60. Shen, X., Corey, D. R. Chemistry, mechanism, and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1584-1600 (2018).
  61. Stein, C. A., Subasinghe, C., Shinozuka, K., Cohen, J. S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Research. 16 (8), 3209-3221 (1988).
  62. Crooke, S. T., Vickers, T. A., Liang, X. Phosphorothioate modified oligonucleotide-protein interactions. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5235-5253 (2020).
  63. Manoharan, M. 2′-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1489 (1), 117-130 (1999).
  64. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnology. 10 (1), 9(2010).
  65. Bassett, A. R., et al. Considerations when investigating lncRNA function in vivo. eLife. 3, e03058(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

LncRNARNARNARNase HRNA DNACRISPR CasRFC4PrECHCT116

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유