JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Для анализа функции некодирующих РНК в зависимых от времени процессах, таких как хромосомная нестабильность, необходимо достичь эффекта длительного нокдауна. С этой целью здесь представлен протокол, в котором используются модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды для достижения эффективного нокдауна в клеточных линиях в течение 21 дня.

Аннотация

Длинные некодирующие РНК (днРНК) играют ключевую регуляторную роль в экспрессии генов на транскрипционном уровне. Экспериментальные данные установили, что значительная часть некодирующей РНК преимущественно накапливается в ядре. Для анализа функции ядерных некодирующих РНК важно добиться эффективного нокдауна этих транскриптов внутри ядра. В отличие от использования РНК-интерференции, технологии, которая зависит от механизма цитоплазматического сайленсинга, технология антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) может достичь нокдауна РНК путем рекрутирования РНКазы H в дуплексы РНК-ДНК для расщепления ядерной РНК. В отличие от использования инструментов CRISPR-Cas для геномной инженерии, где могут произойти возможные изменения в состоянии хроматина, ASO позволяют эффективно нокдаунить ядерные транскрипты без модификации генома. Тем не менее, одним из основных препятствий для ASO-опосредованного нокдауна является его преходящий эффект. Для изучения долгосрочных эффектов сайленсинга некодирующей РНК необходимо поддерживать эффективный нокдаун в течение длительного времени. В этом исследовании был разработан протокол для достижения эффекта нокдауна в течение более 21 дня. Цель состояла в том, чтобы оценить цис-регуляторные эффекты нокдауна lncRNA на соседний кодирующий ген RFC4, который связан с хромосомной нестабильностью, состоянием, которое наблюдается только во времени и старении клеток. Были использованы две различные клеточные линии человека: PrEC, нормальные первичные эпителиальные клетки предстательной железы, и HCT116, эпителиальная клеточная линия, выделенная из колоректальной карциномы, что позволило добиться успешного нокдауна в анализируемых клеточных линиях.

Введение

Подавляющее большинство генома человека транскрибируется, что приводит к появлению широкого разнообразия транскриптов, включая некодирующие РНК, которые по количеству превышают количество аннотированных кодирующих генов в человеческом транскриптоме1. Некодирующие РНК представляют собой транскрипты длиннее 200 нуклеотидов, которые не кодируют белки 2,3 и недавно были исследованы на предмет их важных регуляторных функций в клетке4. Былопоказано, что их функции зависят от их субклеточной локализации5, например, в ядре, где значительная часть некодирующих РНК накапливается и активно участвует в транскрипционной регуляции6, а такжедля поддержания ядерной архитектуры7, среди других биологических процессов 8,9,10.

Для функциональной характеристики ядерных некодирующих РНК необходимо использовать методы, способные индуцировать нокдаун (KD) в ядре, а ASO являются мощным инструментом для подавления ядерных транскриптов. В целом, ASO представляют собой одноцепочечные последовательности ДНК длиной ~20 пар оснований, которые связываются с комплементарной РНК путем спаривания оснований Уотсона-Крика 11,12,13 и могут изменять функцию РНК с помощью механизмов, зависящих от их химической структуры и модификаций13,14. Химические модификации АСО можно разделить на 2 большие группы: модификации основной массы и модификации 2'-сахарного кольца15, обе из которых предназначены для повышения стабильности за счет придания высокой устойчивости к нуклеазам, а также для усиления предполагаемого биологического эффекта13,16. Среди основных модификаций фосфорамидат морфолино (ПМО), тиофосфорамидат и морфолиновые связи широко используются для таких целей, как интерференция в сплайсинге17,18, выступая в качестве стерических блокаторов19, но не для индуцирования деградации транскрипта. Еще одной основной модификацией является фосфоротиоатная (PS) связь, одна из наиболее часто используемых модификаций в ASO. В отличие от ранее упомянутых модификаций, PS-связи не препятствуют набору РНКазы H12,20, тем самым обеспечивая нокдаун РНК. Тем не менее, существует также большое разнообразие модификаций 2' сахарных колец21; тем не менее, с целью нокдауна РНК к числу модификаций, которые индуцируют эффективные эффекты сайленсинга, относятся заблокированные нуклеиновые кислоты (LNA)22, 23 и модификация 2'-O-метила24. Несмотря на то, что МШУ доказали свою высокую эффективность в отношении нокдауна по сравнению с другими модификациями25, они могут вызывать нежелательные эффекты, такие как гепатотоксичность26 и индукция апоптоза in vivo и in vitro27.

С целью нокдауна РНК АСО с соответствующими модификациями, упомянутыми выше, могут рекрутировать РНКазу Н1 и Н220,28, и эти ферменты рекрутируются в гибриды ДНК-РНК и расщепляют целевую РНК, высвобождая АСО13. Продукты РНК этого расщепления затем обрабатываются механизмом надзора за РНК, что приводит к деградации РНК29 без модификации интересующей области генома, в отличие от других методов, таких как системы CRISPR-Cas, где изменения в состоянии хроматина могут создавать нежелательные биологические эффекты30. Несмотря на преимущества технологии ASO, временные эффекты подавления из-за деления клеток или деградации ASO с течением времени являются препятствием, которое необходимо преодолеть при изучении зависимых от времени процессов, таких как хромосомная нестабильность (CIN)31.

В частности, CIN определяется как повышенная скорость изменений в числе и структуре хромосом по сравнению с нормальными клетками32 и возникает в результате ошибок в сегрегации хромосом во время митоза, что приводит к генетическим изменениям, которые порождают внутриопухолевую гетерогенность33 с течением времени. Таким образом, ЦИН нельзя оценить только по нахождению анеуплоидного кариотипа. Для правильного изучения и оценки CIN в клеточной культуре важно контролировать клетки с течением времени. Для изучения влияния lncRNA KD на CIN необходима методология, которая позволяет получить пролонгированный эффект KD. С этой целью в данном протоколе были использованы ASO, в которых lncRNA-RFC4 была успешно подавлена в клеточных линиях человека HCT115 и PrEC в течение 18 и 21 дня соответственно. Этот транскрипт представляет собой нехарактерную некодирующую РНК длиной 1,2 kb, а ее геномное расположение находится на хромосоме 3 (q27.3). Он примыкает к белку, кодирующему ген RFC4, ген, связанный с CIN при различных типах рака человека 34,35,36.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол предназначен для выполнения только лабораторным персоналом, имеющим опыт работы с лабораторными процедурами безопасности. Перед началом работы с опасными материалами и оборудованием важно правильно прочитать паспорта безопасности всех реагентов и материалов, используемых в этом протоколе. Важно прочитать, понять и выполнить все требования безопасности, указанные в руководстве по безопасности в лаборатории вашего учреждения по всему протоколу. Утилизация всех биологических и химических отходов должна осуществляться в соответствии с руководством учреждения по обращению с отходами и их утилизации. При неосторожном обращении и в соответствии с безопасными лабораторными практиками материалы и оборудование, используемые в этом протоколе, могут привести к серьезным травмам. Всегда следуйте руководству по технике безопасности и процедурам безопасности учреждения.

1. Проектирование ASO

  1. Вручную разработайте ASO, как описано ниже.
    1. Получите полную последовательность целевого транскрипта и проанализируйте ее в веб-сервере RNAfold, Universityof Vienna 37 (Table of Materials), используя параметры по умолчанию на веб-сайте для получения вторичной структуры с минимальной свободной энергией (MFE).
    2. Когда результаты будут готовы, перейдите к рисунку простой структуры MFE и нажмите кнопку «Просмотреть в Forna », чтобы открыть вторичную структуру MFE на веб-сайте, и программное обеспечение покажет прогнозируемую вторичную структуру анализируемого транскрипта.
    3. Из предсказанной вторичной структуры MFE выберите область длиной 20.о. в РНК, избегая G-строк (последовательностей из 3 гуанинов подряд) при конструировании олигонуклеотидов. Для выбора наилучшей целевой области для ASO используйте регионы, которые, по прогнозам, будут иметь меньшую вероятность спаривания внутренних оснований (рис. 1).
    4. Из выделенной области 20.о. создайте обратную последовательность дополнения. Создайте обратный комплемент вручную или воспользуйтесь онлайн-инструментом обратного дополнения (Таблица материалов). Обратная последовательность комплемента будет представлять собой ASO, которая должна быть синтезирована для эксперимента.
    5. Проанализируйте последовательность ASO с помощью Nucleotide Blast NCBI (blastn) и UCSC Genome Browser on Human (GRCh38/hg38). Убедитесь, что ASO не имеют гомологии с другими транскриптами или другими областями генома человека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез и очистка ASO были выполнены коммерческой компанией (Таблица материалов).
  2. Убедитесь, что синтезируемые олигонуклеотиды обладают следующими характеристиками.
    1. Обеспечьте связи PS по всей последовательности олигонуклеотида38 (рисунок 2А). Убедитесь, что ASO являются химерными, с 5 нуклеотидами, фланкирующими 5' и 3' концы, с сахарными кольцами, модифицированными 2'-O-метилом (рис. 2B).
    2. Убедитесь, что 10 нуклеотидов в середине имеют немодифицированное сахарное кольцо для поддержки связывания РНКазы H (Рисунок 2C).
    3. Попросите компанию выполнить очистку с использованием стандартного обессоливания и обратной фазы (ВЭЖХ)39.
    4. Заказывайте ASO доставку в лиофилизированном формате.
  3. Растворите лиофилизированные АСО в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) без кальция и магния до конечной концентрации 200 мкМ. Хранить при -20 °C.
  4. Готовьте рабочий раствор АСО путем разбавления концентрированного материала до концентрации 20 мкМ. Готовьте разведение с помощью DPBS. Хранить при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования были разработаны два ASO, нацеленные на lncRNA-RFC4. Для оптимизации концентрации АСО для трансфекции и эффективности использовался протокол Zong et al.40 . Два ASO были разработаны и экспериментально оптимизированы в соответствии с протоколом Zong: ASO-lncRFC4 и ASO-lncRFC4-2. После оптимизации был выбран один эффективный ASO, нацеленный на lncRNA-RFC4, ASO-lncRFC4, для протокола пролонгированного нокдауна (дополнительный рисунок 1). В качестве положительного контроля использовали ранее подтвержденную эффективную ASO, нацеленную на lncRNA MALAT18 : ASO-MALAT1. Для отрицательного контроля был разработан ASO, нацеленный на ген Escherichia coli lacZ, ASO-lacZ (номер присоединения NCBI: FN297865).

2. Подготовка клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте внутри колпака для клеточных культур каждый раз, когда работают с клеточными линиями, растворами, материалами или любыми продуктами, которые будут использоваться во время манипуляций с клеточными культурами. При работе с жидкостями для культивирования клеток всегда используйте стерилизованные серологические пипетки или микропипетки со стерилизованными наконечниками. Всегда выполняйте и соблюдайте все требования безопасности, указанные в руководстве по безопасности в лаборатории учреждения, в течение всего протокола.

  1. Подготовьте полную среду для клеточных культур для каждой клеточной линии, как описано ниже.
    1. Для HCT116 приготовьте среду McCoy's 5A с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
    2. Для PrEC подготовьте базальную среду эпителиальных клеток предстательной железы с помощью набора для роста эпителиальных клеток предстательной железы.
  2. Для экспериментов с КД используйте три культуральных планшета диаметром 100 мм (площадь поверхности 55см2 ), по одному на каждый используемый олигонуклеотид: ASO, нацеленный на lncRNA, ASO для использования в качестве положительного контроля (ASO-MALAT1) и ASO для использования в качестве отрицательного контроля (ASO-lacZ).
  3. Используйте две культуральные пластины диаметром 35 мм (9 см2 в площади) в качестве контрольных точек для KD между клеточными проходами, одна из которых будет трансфицирована полной трансфекционной средой для ASO-lncRFC4, а другая — для ASO-lacZ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекция планировалась в соответствии с процедурами и протоколами производителя реагента для трансфекции на основе липидов (см. Таблицу материалов), о которых ранее сообщалось41,42.
  4. Затравка клеток до плотности 1 х 104 клетки/см2 в чашках для клеточных культур. Инкубируйте при температуре 37 °C в инкубаторе с использованием 5%CO2 в воздухе до тех пор, пока клетки не достигнут 50% конфлюенции (когда 50% поверхности покрыто монослоем клеток). При стечении 50% клетки готовы к трансфекции по этому протоколу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансфекции ASO-lncRFC4 и ASO-lacZ были затравлены одна 100-мм тарелка и одна 35-мм тарелка. Для трансфекции ASO-MALAT1 затравливали только 100-миллиметровую чашку (рис. 3А).

3. Трансфекция

  1. Перед началом процедуры разогрейте пониженную в сыворотке среду до 37 °С.
  2. Для трансфекции с помощью ASO-lacZ и ASO-lncRFC4 выполните описанные ниже действия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекцию с помощью ASO-lacZ и ASO-lncRFC4 планируется проводить для клеток на площади поверхности 55см2; При использовании различных областей объемы могут быть отрегулированы соответствующим образом. Эта процедура должна быть выполнена для каждого используемого ASO в одинаковых условиях.
    1. Подготовьте пробирку 1 внутри колпака для клеточных культур, растворив 43,75 мкл ASO (20 мкМ) в 1,4 мл теплой восстановленной среды для сыворотки в конической центрифужной пробирке объемом 15 мл.
    2. Подготовьте пробирку 2 внутри колпака для клеточных культур, смешав 18,66 мкл липидного реагента для трансфекции с 1,4 мл теплой восстановленной сывороточной среды в 1,5 мл микрофуги, не содержащей РНКазы.
    3. Инкубировать пробирки 1 и 2 внутри колпака для клеточных культур при комнатной температуре в течение 10 мин.
    4. Добавьте раствор, содержащийся в пробирке 2 (трансфекционный реагент + восстановленная сыворотка) непосредственно в пробирку 1 (АСО + восстановленная сыворотка) медленно, капля за каплей, чтобы избежать растекания реагентов по поверхности пробирки.
    5. Смесь, содержащуюся в пробирке 1, инкубировать в течение 20 мин внутри культурального колпака при комнатной температуре.
    6. Добавьте теплое средство для восстановления сыворотки в пробирку 1 до конечного объема 8,75 мл.
      Примечание: Окончательная трансфекционная среда содержала АСО в концентрации 100 нМ.
    7. Извлеките питательную среду из чашки для культивирования клеток, содержащей трансфицируемые клетки, и добавьте 7,5 мл трансфекционной среды в культуральную пластину диаметром 100 мм и 1 мл в культуральную тарелку диаметром 35 мм непосредственно в монослое клеток, по каплям. Убедитесь, что среда равномерно распределена по всей поверхности, осторожно встряхивая посуду.
    8. Инкубировать в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 на воздухе в течение 6 часов.
    9. После 6 ч инкубации в трансфекционной среде добавьте 7,5 мл полной среды в клетки 100 мм культурального планшета и 1 мл полной среды в клетки 35 мм культурального планшета. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2.
  3. Для трансфекции с помощью ASO-MALAT1 проведите эксперименты, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекцию с помощью ASO-MALAT1 планируется проводить для клеток с площадью поверхности 55 см2 .
    1. Подготовьте пробирку 1 внутри колпака для клеточных культур, растворив 37,5 мкл ASO (20 мкМ) в 1,2 мл теплой восстановленной среды для сыворотки в конической центрифужной пробирке объемом 15 мл.
    2. Подготовьте пробирку 2, смешав 16 мкл липидного реагента для трансфекции с 1,2 мл теплой восстановленной сыворотки.
    3. Инкубировать пробирки 1 и 2 при комнатной температуре в течение 10 мин внутри колпака для клеточных культур.
    4. Добавьте раствор, содержащийся в пробирке 2 (реагент для трансфекции на основе липидов + восстановленная сыворотка) непосредственно в пробирку 1 (АСО + восстановленная сыворотка) медленно, капля за каплей, чтобы избежать растекания реагентов по поверхности пробирки.
    5. Смесь, содержащуюся в пробирке 1, инкубировать в течение 20 мин внутри культурального колпака при комнатной температуре.
    6. Добавьте теплое средство для восстановления сыворотки в пробирку 1 до конечного объема 7,5 мл. Конечная трансфекционная среда содержала АСО в концентрации 100 нМ.
    7. Извлеките питательную среду из чашки для культивирования клеток, содержащей трансфицируемые клетки, и добавьте 7,5 мл трансфекционной среды непосредственно в монослой клеток по каплям, чтобы обеспечить равномерное распределение среды по всей поверхности путем осторожного встряхивания чашки.
    8. Инкубировать при 37 °C в инкубаторе с использованием 5%CO2 на воздухе в течение 6 часов.
    9. После 6 ч инкубации с трансфекционной средой добавьте в клетки 7,5 мл готовой среды и инкубируйте в инкубаторе при 37 °C и 5%CO2.
  4. Оценивайте клетки под микроскопом каждые 12-24 часа, пока клетки не будут готовы к следующему раунду трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Затем трансфекция должна быть выполнена, когда клетки достигнут слияния на 70%. При необходимости замените среду на готовую питательную среду.
  5. Когда клетки на 70% слились в чашке для культивирования клеток, повторите процедуру (шаги с 3.1 по 3.4) и выполните следующий раунд трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После второй трансфекции клетки следует оценивать под микроскопом каждые 12-24 часа. Забор и пассирование клеток должны быть выполнены, когда клетки достигают конфлюенции на 80%-85%. При необходимости замените среду на готовую питательную среду.

4. Забор и пассирование клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Забор клеток и пассирование проводятся после каждых 2 раундов трансфекции и после2-го, 4-го и6-го раундов трансфекции. Среднее время сбора в клетках HCT116 составило 6 дней после1-й,3-й и5-й трансфекций, а для клеток PrEC — 7 дней после1-й,3-й и5-й трансфекций. Временной момент для трансфекции отличается для обеих клеточных линий, используемых в этом протоколе. Для HCT1162-я,3-я,4-я,5-я и6-я трансфекции проводят через 3, 6, 9, 12 и 15 дней после первой трансфекции соответственно. Для ПрЭК2-ю,3-ю,4-ю,5-ю и6-ю трансфекцию проводят через 3, 7, 10, 14 и 18 дней после первой трансфекции соответственно. Обратитесь к временной шкале на рисунке 3, чтобы проверить временные точки для трансфекции, пассирования и забора.

  1. Выполните сбор и пассирование клеток для экспериментов с КД в 100-миллиметровых культуральных планшетах, как описано ниже.
    1. Приступайте к забору клеток и прохождению, когда клетки достигнут конфлюенции на 80%-85%.
    2. Прогрейте всю среду и промойте растворы до 37 °C. Разогрейте диссоциационный реагент до комнатной температуры. Разогрейте нейтрализующий раствор для диссоциационного реагента до комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Моющие растворы, диссоциативные реагенты и нейтрализующие растворы различаются для двух клеточных линий, используемых в этом протоколе. Клетки HCT116 промывают PBS (фосфатно-солевой буфер) и диссоциируют раствором трипсин-ЭДТА. Нейтрализацию диссоциативного реагента проводят с помощью полной питательной среды для клеток HCT116. Для PrEC в качестве моющего раствора используется солевой раствор с буферизацией HEPES. В качестве диссоциационного реагента используется трипсин-ЭДТА. Для нейтрализации диссоциативного реагента используют нейтрализующий раствор трипсина.
    3. Внутри культурального колпака извлеките питательную среду из чашки для клеточных культур и аккуратно промойте 3 мл моющего раствора, после чего выбросьте моющий раствор. Повторите этот шаг 2 раза.
    4. Добавьте 2 мл диссоциационного реагента в соответствии с клеточной линией в монослой клетки и инкубируйте при 37 °С в течение 3-5 минут. Оценивайте клетки каждые 2 минуты до полного завершения диссоциации.
    5. Добавьте 2 мл нейтрализующего раствора в соответствии с линией клеток и перенесите весь объем клеточной суспензии из чашки для культивирования клеток в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
    6. Для экстракции РНК берут 500 мкл клеточной суспензии и переносят ее в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Поместите пробирку на лед и перейдите к шагу 5.1 для экстракции РНК и ОТ-кПЦР.
    7. Остальную клеточную суспензию центрифугировать при 120 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросить надосадочную жидкость.
    8. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл готовой питательной среды и приступайте к подсчету клеток в соответствии со стандартной методикой.
    9. Для кариотипирования затравливают клетки до плотности 1 х 104 клеток/см2 в чашке для клеточных культур диаметром 35 мм (площадь поверхности 9см2), инкубируют в инкубаторе при 37 °С при 5% СО2 на воздухе в течение 24 ч и приступают к кариотипированию в соответствии со стандартными процедурами.
    10. Для продолжения экспериментов с КД в следующем клеточном пассаже, затравливают клетки до плотности 1 х 104 клетки/см2 в новой чашке для клеточных культур диаметром 100 мм. Эта тарелка будет проходом No2 для эксперимента. Инкубируйте при температуре 37 °C в инкубаторе с использованием 5%CO2 в воздухе до тех пор, пока клетки не достигнут конфлюенции 50%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании, оставшиеся клетки могут быть использованы для экстракции белка и/или замораживания в соответствии со стандартными процедурами.
    11. Повторите шаги с 3.1 по 4.1.10 для переливания и забора из прохода 2 и из прохода 3.
  2. Следуйте следующей процедуре забора клеток для контрольных точек экспериментов KD в чашках для культур 35 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Забор для первой контрольной точки в эксперименте KD проводится через 2 дня после2-й и4-й процедур трансфекции.
    1. Нагрейте весь фильтрующий материал и моющие растворы до 37 °C. Разогрейте диссоциационный реагент до комнатной температуры. Разогрейте нейтрализующий раствор для диссоциационного реагента до комнатной температуры.
    2. Внутри культурального колпака извлеките питательную среду из чашки для клеточных культур и аккуратно промойте 0,5 мл моющего раствора, а затем выбросьте моющий раствор. Повторите этот шаг 2 раза.
    3. После удаления моющих растворов добавьте 0,5 мл диссоциационного реагента в соответствии с клеточной линией и инкубируйте при 37 °C в течение 3-5 минут. Оценивайте клетки каждые 2 минуты до тех пор, пока диссоциация не будет завершена.
    4. Добавьте 0,5 мл нейтрализующего раствора в соответствии с линией клеток и перенесите весь объем клеточной суспензии из чашки для клеточных культур в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и поместите ее на лед.
    5. Перейдите к шагу 5.1 для экстракции РНК и количественной ПЦР.

5. Экстракция РНК и ОТ-ПЦР

  1. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 2 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте гранулу ячейки 600 μл холодной PBS (4 °C).
  2. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 2 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    Используйте клеточную гранулу для экстракции РНК в соответствии со стандартными процедурами.
  3. Приступайте к ДНКазной обработке очищенной РНК в соответствии со стандартной процедурой, которой придерживаются в лаборатории. В точке паузы храните очищенную РНК при температуре -80 °C в течение длительного времени.
  4. Используйте РНК для стандартного синтеза кДНК с каждым полученным образцом РНК. В точке паузы храните кДНК при температуре -20 °C в течение длительного времени.
  5. Выполните стандартную количественную ПЦР в соответствии с инструкциями, описанными ниже.
    1. Для количественной ПЦР олигонуклеотиды амплифицируют следующие транскрипты: представляющую интерес lncРНК, MALAT1 и конститутивно экспрессируемый ген в качестве внутреннего контроля (табл. 1). Для этого протокола в качестве внутреннего контроля использовалось выражение RPS28.
    2. Проведите реакции количественной ПЦР для амплификации внутреннего контроля, представляющей интерес lncRNA и MALAT1 с использованием кДНК из образца ASO-LacZ. Этот пример будет использоваться для нормализации выражения из других образцов.
    3. Проведите реакции количественной ПЦР для амплификации внутреннего контроля RPS28 и интересующей lncRNA с использованием кДНК из образца ASO-lncRNA.
    4. Проведите реакции количественной ПЦР для амплификации внутренних контролей RPS28 и MALAT1 с использованием кДНК из образца ASO-MALAT1. Соблюдайте реакцию и условия термоамплификатора, как описано в таблице 2.
    5. Проанализируйте данные количественной ПЦР с помощью ΔΔCt нормализации экспрессии интересующего транскрипта по отношению к внутреннему контролю, а затем нормализуйте экспрессию интересующего транскрипта (lncRNA или MALAT1) против экспрессии того же транскрипта в образце ASO-LacZ, чтобы получить относительный уровень экспрессии транскрипта.

Результаты

В настоящем протоколе использование ASO было адаптировано к KD ядерной lncRNA в течение длительного времени в клеточных линиях человека PrEC и HCT116.

Конечно, эксперимент с КД был успешным в клеточной линии PrEC в течение 21 дня эксперимента, как показано на

Обсуждение

Как упоминалось ранее, некодирующие РНК выполняют ключевые регуляторные функции в клетке; Таким образом, нарушение регуляции этих транскриптов может быть связано с заболеваниями. Рак является одним из таких заболеваний, характеризующихся нарушением регуляции lncRNA

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Монтиэль-Манрикес, Рохелио, является докторантом Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas Национального университета Автономии Мексики (UNAM) и получил стипендию CONACyT с номером CVU: 581151.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15ml Centrifuge Tubes - 15ml Conical TubesThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm TC-treated Culture DishCorning 430167Surface area:55 cm2
Corning 35 mm TC-treated Culture DishCorning 430165Surface area: 9 cm2
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
Fetal Bovine Serum (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 cell lineATCCCCL-247
HEPES, 1M Buffer SolutionThermo Fisher Scientific15630122
Integrated DNA Technologies NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX ReagentThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A medium ATCC30-2007
Normal Human Primary Prostate Epithelial Cells (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Nucleotide Blast NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Reduced Serum MediaThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific
Prostate Epithelial Cell Basal MediumATCCPCS-440-030
Prostate Epithelial Cell Growth KitATCCPCS-440-040
Reverse complement online toolNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher Scientific12604013Trypsin-EDTA solution
Trypsin Neutralizing SolutionATCCPCS-999-004
Trypsin-EDTA for Primary CellsATCCPCS-999-003
UCSC Genome Browser, Human (GRCh38/hg38)NANAhttps://genome.ucsc.edu/

Ссылки

  1. Fang, S., et al. NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (Database issue), D308-D314 (2018).
  2. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  3. Palazzo, A. F., Koonin, E. V. Functional Long Non-coding RNAs Evolve from Junk Transcripts. Cell. 183 (5), 1151-1161 (2020).
  4. Ransohoff, J. D., Wei, Y., Khavari, P. A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 143-157 (2017).
  5. Chen, L. L. Linking Long Noncoding RNA Localization and Function. Trends in Biochemical Sciences. 41 (9), 761-772 (2016).
  6. Basu, S., Larsson, E. A Catalogue of Putative cis-Regulatory Interactions Between Long Non-coding RNAs and Proximal Coding Genes Based on Correlative Analysis Across Diverse Human Tumors. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (6), 2019-2025 (2018).
  7. Petermann, F., et al. The Magnitude of IFN-γ Responses Is Fine-Tuned by DNA Architecture and the Non-coding Transcript of Ifng-as1. Molecular Cell. 75 (6), 1229.e5-1242.e5 (2019).
  8. Tripathi, V., et al. The Nuclear-Retained Noncoding RNA MALAT1 Regulates Alternative Splicing by Modulating SR Splicing Factor Phosphorylation. Molecular Cell. 39 (6), 925-938 (2010).
  9. Chen, L. L., Carmichael, G. G. Decoding the function of nuclear long non-coding RNAs. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 357-364 (2010).
  10. Vance, K. W., Ponting, C. P. Transcriptional regulatory functions of nuclear long noncoding RNAs. Trends in Genetics. 30 (8), 348-355 (2014).
  11. Ren, H., Zhang, Z., Zhang, W., Feng, X., Xu, L. Prodrug-type antisense oligonucleotides with enhanced nuclease stability and anti-tumour effects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 162, 105832 (2021).
  12. Kole, R. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. DRUG DISCOVERY. 16, (2012).
  13. DeVos, S. L., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics. 10 (3), 486-497 (2013).
  14. Le, B. T., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Angiogenic Factors as Potential Cancer Therapeutics. Molecular Therapy Nucleic Acids. 14, 142-157 (2019).
  15. Shadid, M., Badawi, M., Abulrob, A. Antisense oligonucleotides: absorption, distribution, metabolism, and excretion. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 17 (11), 1281-1292 (2021).
  16. Roberts, T. C., Langer, R., Wood, M. J. A. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (10), 673-694 (2020).
  17. Havens, M. A., Hastings, M. L. Splice-switching antisense oligonucleotides as therapeutic drugs. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6549-6563 (2016).
  18. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), e2114886119 (2022).
  19. Lim, K. H., et al. Antisense oligonucleotide modulation of non-productive alternative splicing upregulates gene expression. Nature Communications. 11 (1), 3501 (2020).
  20. Crooke, S. T. Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 70-77 (2017).
  21. Monia, B. P., Johnston, J. F., Sasmor, H., Cummins, L. L. Nuclease Resistance and Antisense Activity of Modified Oligonucleotides Targeted to Ha. Journal of Biological Chemistry. 271 (24), 14533-14540 (1996).
  22. Grünweller, A., et al. Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids, 2′-O-methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA. Nucleic Acids Research. 31 (12), 3185-3193 (2003).
  23. Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. 32 (9), 1948-1957 (2018).
  24. Yoo, B. H., Bochkareva, E., Bochkarev, A., Mou, T. C., Gray, D. M. 2′-O-methyl-modified phosphorothioate antisense oligonucleotides have reduced non-specific effects in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (6), 2008-2016 (2004).
  25. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86.e16-101.e16 (2017).
  26. Kasuya, T., et al. Ribonuclease H1-dependent hepatotoxicity caused by locked nucleic acid-modified gapmer antisense oligonucleotides. Scientific Reports. 6 (1), 30377 (2016).
  27. Swayze, E. E., et al. Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals. Nucleic Acids Research. 35 (2), 687-700 (2007).
  28. Hyjek, M., Figiel, M., Nowotny, M. RNases H: Structure and mechanism. DNA Repair. 84, 102672 (2019).
  29. Lima, W. F., De Hoyos, C. L., Liang, X., Crooke, S. T. RNA cleavage products generated by antisense oligonucleotides and siRNAs are processed by the RNA surveillance machinery. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3351-3363 (2016).
  30. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  31. Drews, R. M., et al. A pan-cancer compendium of chromosomal instability. Nature. 606 (7916), 976-983 (2022).
  32. Benhra, N., Barrio, L., Muzzopappa, M., Milán, M. Chromosomal Instability Induces Cellular Invasion in Epithelial Tissues. Developmental Cell. 47 (2), 161.e4-174.e4 (2018).
  33. Gronroos, E., López-García, C. Tolerance of Chromosomal Instability in Cancer: Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Cancer Research. 78 (23), 6529-6535 (2018).
  34. Liu, L., et al. An RFC4/Notch1 signaling feedback loop promotes NSCLC metastasis and stemness. Nature Communications. 12 (1), 2693 (2021).
  35. Shiomi, Y., Nishitani, H. Control of Genome Integrity by RFC Complexes; Conductors of PCNA Loading onto and Unloading from Chromatin during DNA Replication. Genes. 8 (2), (2017).
  36. Carter, S. L., Eklund, A. C., Kohane, I. S., Harris, L. N., Szallasi, Z. A signature of chromosomal instability inferred from gene expression profiles predicts clinical outcome in multiple human cancers. Nature Genetics. 38 (9), 1043-1048 (2006).
  37. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Research. 36 (suppl_2), W70-W74 (2008).
  38. Wan, W. B., et al. Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages. Nucleic Acids Research. 42 (22), 13456-13468 (2014).
  39. Kanavarioti, A. HPLC methods for purity evaluation of man-made single-stranded RNAs. Scientific Reports. 9 (1), 1019 (2019).
  40. Zong, X., et al. Knockdown of Nuclear-Retained Long Noncoding RNAs Using Modified DNA Antisense Oligonucleotides. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs: Methods and Protocols. , 321-331 (2015).
  41. Zhao, M., et al. Lipofectamine RNAiMAX: An Efficient siRNA Transfection Reagent in Human Embryonic Stem Cells. Molecular Biotechnology. 40 (1), 19-26 (2008).
  42. . . Nuclear bodies and noncoding RNAs: methods and protocols. , (2015).
  43. CAWG Drivers and Functional Interpretation Group. Cancer LncRNA Census reveals evidence for deep functional conservation of long noncoding RNAs in tumorigenesis. Communications Biology. 3 (1), 56 (2020).
  44. Schmitt, A. M., Chang, H. Y. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer Cell. 29 (4), 452-463 (2016).
  45. Hosono, Y., et al. Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA. Cell. 171 (7), 1559.e20-1572.e20 (2017).
  46. Cho, S. W., et al. Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell. 173 (6), 1398.e22-1412.e22 (2018).
  47. Ding, W., Ren, J., Ren, H., Wang, D. Long Noncoding RNA HOTAIR Modulates MiR-206-mediated Bcl-w Signaling to Facilitate Cell Proliferation in Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  48. Huo, H., et al. Long non-coding RNA NORAD upregulate SIP1 expression to promote cell proliferation and invasion in cervical cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 106, 1454-1460 (2018).
  49. Prensner, J. R., et al. The Long Non-Coding RNA PCAT-1 Promotes Prostate Cancer Cell Proliferation through cMyc. Neoplasia. 16 (11), 900-908 (2014).
  50. Li, H., et al. Long noncoding RNA NORAD, a novel competing endogenous RNA, enhances the hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition to promote metastasis in pancreatic cancer. Molecular Cancer. 16, (2017).
  51. Li, Q., et al. High expression of long noncoding RNA NORAD indicates a poor prognosis and promotes clinical progression and metastasis in bladder cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 36 (6), 310.e15-310.e22 (2018).
  52. Katayama, H., et al. Long non-coding RNA HOTAIR promotes cell migration by upregulating insulin growth factor-binding protein 2 in renal cell carcinoma. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  53. Ling, H., et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24, underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer. Genome Research. 23 (9), 1446-1461 (2013).
  54. Lee, S., et al. Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins. Cell. 164 (1-2), 69-80 (2016).
  55. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  56. Iwamoto, N., et al. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides. Nature Biotechnology. 35 (9), 845-851 (2017).
  57. Naeem, M., Majeed, S., Hoque, M. Z., Ahmad, I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 9 (7), 1608 (2020).
  58. Vicente, M. M., Chaves-Ferreira, M., Jorge, J. M. P., Proença, J. T., Barreto, V. M. The Off-Targets of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Gene Editing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, (2021).
  59. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264 (2015).
  60. Shen, X., Corey, D. R. Chemistry, mechanism, and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1584-1600 (2018).
  61. Stein, C. A., Subasinghe, C., Shinozuka, K., Cohen, J. S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Research. 16 (8), 3209-3221 (1988).
  62. Crooke, S. T., Vickers, T. A., Liang, X. Phosphorothioate modified oligonucleotide-protein interactions. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5235-5253 (2020).
  63. Manoharan, M. 2′-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1489 (1), 117-130 (1999).
  64. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnology. 10 (1), 9 (2010).
  65. Bassett, A. R., et al. Considerations when investigating lncRNA function in vivo. eLife. 3, e03058 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

HCRISPR CasRFC4PrECHCT116

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены