Isolierung von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes aus Buffy Coats durch immunmagnetische Hochdurchsatz-Bead-Trennung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine automatisierungskompatible Methode mit hohem Durchsatz zur Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes für Biobanking und andere Zwecke.

Zusammenfassung

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) sind eine heterogene Population von Monozyten und Lymphozyten. Kryokonservierte PBMCs haben eine stabile Lebensfähigkeit bei langfristiger Lagerung, was sie zu einem idealen Zelltyp für viele nachgelagerte Forschungszwecke macht, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunoassays und Genomsequenzierung. In der Regel werden PBMCs durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert, jedoch handelt es sich um einen Arbeitsablauf mit niedrigem Durchsatz, der schwierig und kostspielig zu skalieren ist. In diesem Artikel wird ein Hochdurchsatz-Workflow unter Verwendung einer auf magnetischen Beads basierenden PBMC-Isolationsmethode vorgestellt, die schnell zu implementieren ist. Die Gesamtzellkonzentration, die Lebensfähigkeit und die Populationsverteilung mit PBMCs, die mittels Dichtegradientenisolierung erhalten wurden, wurden verglichen, und die Zellviabilität und der Anteil der Zelltypen waren für beide Techniken vergleichbar. Isolierte PBMCs zeigten bis zu 9 Tage nach der Blutentnahme eine Lebensfähigkeit von über 70 %, obwohl die Ausbeute nach 5 Tagen im Vergleich zu PBMCs, die innerhalb von 24 Stunden nach der Blutentnahme verarbeitet wurden, um die Hälfte abnahm. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Artikel ein PBMC-Protokoll beschreibt, das einen Bead-basierten Ansatz zur Anpassung an einen Hochdurchsatz-Workflow verwendet, und zeigt, dass sowohl manuelle als auch automatisierte Bead-basierte Methoden die Verarbeitungskapazität erhöhen und Flexibilität für verschiedene Budgets bieten können.

Einleitung

Die Isolierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) ist eine Technik, bei der Lymphozyten und Monozyten von anderen Vollblutbestandteilen getrennt und isoliert werden. PBMCs sind ein vielseitiger Zelltyp, der für zahlreiche Anwendungen eingesetzt wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Immuntherapien, Impfstoffentwicklung, Ziel- oder Biomarker-Identifizierung und Entwicklung von Antikörpern/niedermolekularen Medikamenten ^1,2. Diese Zellen können von gesunden oder kranken Personen isoliert und sofort in nachgelagerten Prozessen verwendet oder für zukünftige Forschungen kryokonserviert werden³. In einigen Fällen ist der nachgelagerte Zweck bekannt, während in anderen, wie im Biobanking üblich, PBMCs isoliert und für zukünftige nicht näher spezifizierte Anwendungen gelagert^{werden 4}.

Die Dichtegradientenzentrifugation ist die traditionelle Technik zur Isolierung der PBMCs ^5,6,7 aus Vollblut, wobei die differentielle Trennung der konstituierenden Zelltypen basierend auf der Zelldichte während der Zentrifugation genutzt wird. Obwohl es bei dieser Methode einige Unterschiede geben kann, wird Vollblut im Allgemeinen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, über ein Dichtegradientenmedium in einem speziellen oder Standardzentrifugenröhrchen geschichtet und dann geschleudert. Es ergeben sich vier unterschiedliche Schichten: Die obere Plasmaschicht ist mit Blutplättchen angereichert, eine dünne PBMC-Schicht befindet sich über dem Dichtegradientenmedium und die untere Schicht schließlich besteht aus roten Blutkörperchen (RBCs) und Granulozyten. Obwohl diese Methode früher als "Goldstandard"⁸ bezeichnet wurde, gibt es Einschränkungen für das Scale-up, wie z. B. lange Verarbeitungszeit, Zentrifugenkapazität, Schwierigkeiten bei der Aliquotierung anderer Blutprodukte (d. h. Plasma und Erythrozyten) und die mühsame Automatisierung. Obwohl eine Automatisierung für dieses Verfahren⁹ möglich ist, erfordert es eine umfassende Programmierung eines Liquid Handlers (mit einem Zentrifugationsmodul, das vollständig automatisiert werden soll) und würde ein langwieriger Prozess bleiben.

Von nun an wird ein alternativer Arbeitsablauf vorgestellt, der die immunomagnetische Bead-Trennung entweder mit einem Acht-Halter-Magneten für die manuelle Verarbeitung oder einem Instrument für die vollautomatische Verarbeitung verwendet. Bei dieser Methode wird ein Antikörper-Cocktail verwendet, der den Zellen zugesetzt wird und unerwünschte Zellpopulationen, in diesem Fall Blutplättchen, Granulozyten und Erythrozyten, bindet. Diese unerwünschten Populationen werden anschließend durch magnetische Trennung entfernt, so dass Monozyten- und Lymphozytenpopulationen in der negativen Fraktion verbleiben, die für die nachgelagerte Verarbeitung bereit sind¹⁰. Diese Methode der negativen Selektion ist schneller als die Methode der positiven Selektion, die zusätzliche Schritte erfordert, um den Antikörper und den magnetischen Bead-Komplex aus den PBMCs zu entfernen. Die negative Selektion ist zusätzlich vorteilhaft, da sie als eine Möglichkeit zur Erhaltung der Zellfunktionalität beschrieben wurde^11,12.

Protokoll

Blutproben für die Qualitätskontrolle und intern generierte Daten (wie Zellzahl, Lebensfähigkeit und Alter der Probe bei der Verarbeitung) wurden aus genehmigten Forschungsstudien in der NSW Health Statewide Biobank des Royal Prince Alfred Hospital gewonnen (HREC-Zulassung: 2019/ETH06776). Verarbeitete (d. h. plasmaarme), nicht gescreente und anonymisierte adulte menschliche Blutproben wurden in EDTA-Röhrchen entnommen. Diese Blutproben zur Qualitätskontrolle wurden weniger als 72 Stunden nach der Entnahme verarbeitet und für PBMC-Isolierungsexperimente verwendet, bei denen der Dichtegradient und die auf Kügelchen basierenden Methoden verglichen wurden. Für die Methode zur Trennung des Dichtegradienten, die in den repräsentativen Ergebnissen verwendet wird, siehe das Verfahren in der Zusatzdatei 1. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und den für diese Studie verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vollblut-Präparat

1. 10 ml Vollblutröhrchen (beschichtet mit Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], Säurecitrat-Dextrose [ACD] oder Lithiumheparin) 10 Mal bei Raumtemperatur vorsichtig invertieren.
2. Optional: Wenn Vollblut gelagert werden soll, aliquotiert in Kryoröhrchen für eine Lagerung von -80 °C.
3. Die Röhrchen mit einem Schwingrotor bei 800 x g für 10 min bei 22 °C bei eingeschalteter Bremse zentrifugieren (9 Beschleunigung/ 9 Verzögerung).

2. Buffy-Mantel-Kollektion

1. Legen Sie die Proben nach der Zentrifugation in eine biologische Sicherheitswerkbank und prüfen Sie, ob die drei verschiedenen Schichten vorhanden sind (wie in Abbildung 1 gezeigt).
   HINWEIS: Erythrozyten befinden sich in der unteren dunkelroten Schicht des Zentrifugenröhrchens. Über der Erythrozytenschicht befindet sich eine weiße, undurchsichtige Schicht mit weißen Blutkörperchen und Blutplättchen, die als Buffy Coat bekannt ist. Die oberste gelbe Schicht enthält Plasma.
2. Optional: Wenn Plasma gelagert werden soll, aliquotes Plasma in Kryoröhrchen für eine Lagerung von -80 °C.
3. 1 ml Buffy Coat (Ausgangsmaterial) aus einem 10-ml-Blutröhrchen pipettieren und in das in Schritt 3.1 und Schritt 4.1 für die manuelle bzw. automatisierte Methode angegebene und beschriftete Röhrchen überführen. Den Buffy Coat (weiße, undurchsichtige Schicht) mit der Pipettenspitze schwenken und den Buffy Coat durch Ansaugen auffangen.
   HINWEIS: Weniger als 100 μl Plasma und Erythrozyten sind während der Aspiration akzeptabel. Wenn für einen Teilnehmer mehrere Blutröhrchen entnommen werden, können Buffy-Mäntel gepoolt werden; Dies kann jedoch die Thrombozytenkonzentration beeinflussen¹³.
4. Für die manuelle Verarbeitung fahren Sie mit Abschnitt 3 fort. Für die automatisierte Verarbeitung fahren Sie mit Abschnitt 4 fort.
5. Optional: Wenn Erythrozyten gelagert werden sollen, aliquotieren Sie die Erythrozyten in Kryoröhrchen für eine Lagerung von -80 °C.

3. PBMC-Reinigung - Manuelle Methode

HINWEIS: Bis zu 8 Proben pro Magnethalter können von einem einzigen Bediener verarbeitet werden.

1. Beschriften Sie 3 x 5 mL Polystyrolröhrchen mit den Buchstaben A-C.
   HINWEIS: Verwenden Sie die fortlaufende Nummerierung, wenn Sie mehr als eine Stichprobe durchführen, z. B. 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.
2. 60 μl 0,1 M EDTA (für eine endgültige EDTA-Konzentration von 6 mM, pH 8,0, siehe Zusatzdatei 2 für das Rezept) in das Röhrchen A geben, das den in Schritt 2.3 übertragenen Buffy Coat enthält.
3. Geben Sie 50 μl des Cocktail-Mix-Röhrchens (siehe Materialtabelle) in das Röhrchen A, mischen Sie, indem Sie es mindestens 3 Mal auf und ab pipettieren und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Geben Sie 890 μl PBS in das Röhrchen A und mischen Sie, indem Sie es mindestens 3 Mal auf und ab pipettieren.
5. Wirbeln Sie das magnetische Bead-Rohr (siehe Materialtabelle) 30 s lang vortexen.
6. Geben Sie 50 μl der magnetischen Kügelchen in das Röhrchen A und mischen Sie, indem Sie mindestens 3 Mal auf und ab pipettieren.
7. Röhrchen A sofort in das Magnetstativ setzen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
8. Pipettieren Sie die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in das Röhrchen B und sammeln Sie die klare Fraktion mit keinen/minimalen (<100 μl) Erythrozyten für eine optimale PBMC-Rückgewinnung.
   HINWEIS: Stören Sie nicht die am Magneten gebundenen Perlen. Eine Transferpipette wird empfohlen.
9. Nehmen Sie das Rohr A vom Magnetständer und entsorgen Sie es.
10. Geben Sie 50 μl magnetische Kügelchen in die Zellsuspension in Röhrchen B und mischen Sie, indem Sie mindestens 3 Mal auf und ab pipettieren.
11. Röhrchen B sofort in das Magnetstativ setzen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
12. Pipettieren Sie die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in das Röhrchen C und sammeln Sie nur die klare Fraktion.
    HINWEIS: Stören Sie nicht die am Magneten gebundenen Perlen. Eine Transferpipette wird empfohlen.
13. Nehmen Sie das Rohr B vom Magnetständer und entsorgen Sie es.
14. Röhrchen C sofort in das Magnetstativ setzen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
15. Pipettieren Sie die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in ein markiertes Zentrifugenröhrchen und füllen Sie es mit PBS auf 2 mL auf.
16. Übertragen Sie 50 μl der Zellsuspension in einen Probenbecher des automatisierten Zellzählers. Für eine Verdünnungszellzahl von 1:10 fügen Sie 450 μl PBS hinzu. Fahren Sie mit Abschnitt 5 für die Schritte zur Zellzählung fort.

4. PBMC-Aufreinigung - Automatisiertes Verfahren

HINWEIS: Bis zu 4 Proben können mit einem einzigen automatisierten PBMC-Gerät verarbeitet werden. Mehrere Geräte können von einem einzigen Bediener parallel betrieben werden.

1. Beschriften Sie 2 x 14 mL Röhrchen mit den Buchstaben A und B, 1 x 50 mL Zentrifugenröhrchen mit Buchstabe C und 1 x 50 mL Zentrifugenröhrchen mit "Abfall".
   HINWEIS: Für jeden Lauf auf dem automatisierten PBMC-Gerät ist nur ein Abfallbehälter erforderlich. Verwenden Sie die fortlaufende Nummerierung, wenn Sie mehr als eine Stichprobe durchführen, z. B. 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.
2. 60 μl 0,1 M EDTA (für eine EDTA-Endkonzentration von 6 mM) in das Röhrchen A geben, das den in Schritt 2.3 übertragenen Buffy Coat enthält.
3. Wirbeln Sie das magnetische Bead-Rohr (siehe Materialtabelle)  30 s lang vortexen.
4. Schalten Sie das automatische PBMC-Gerät ein, indem Sie es an der Vorderseite des Geräts einschalten.
5. Wählen Sie auf dem Startbildschirm des automatisierten PBMC-Geräts das Profil und dann das gewünschte Protokoll aus.
   HINWEIS: EasySep Direct Human PBMC isolation 19654 - buffy coat war das Protokollprofil, das für diese PBMC-Isolierung ausgewählt wurde. Siehe das Standardverfahren des Herstellers für dieses Profil im Protokollbericht¹⁴.
6. Geben Sie das Ausgangsvolumen (die Menge des Buffy Coat, die in Röhrchen A angesaugt wird) ein und wiederholen Sie den Vorgang für jede Probe.
7. Wählen Sie alle Quadranten aus, für die dasselbe Reagenzienkit verwendet werden soll.
   HINWEIS: Wenn dasselbe Protokoll für mehr als einen Quadranten verwendet wird, schlägt das automatisierte PBMC-Gerät vor, dasselbe Reagenzienkit für alle Quadranten¹⁴ zu verwenden.
8. Beladen Sie das Karussell des Instruments mit beschrifteten Verbrauchsmaterialien, Filterspitzen und Pufferbehältern. Das Reagenzienkit, das das magnetische Bead-Röhrchen und das Cocktail-Mix-Röhrchen enthält, ist in Quadrant 1 zu laden.
   HINWEIS: Das Gerät fragt den Benutzer, ob er 1 Reagenzienkit für alle Quadranten verwenden möchte. Wählen Sie "Ja" und markieren Sie alle Quadranten mit dem Reagenzienkit.
9. Sobald der Ladevorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie die Deckel von Verbrauchsmaterialien und Reagenzien und wählen Sie auf dem Gerätebildschirm die Option Ausführen.
10. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, wählen Sie Entladen und entnehmen Sie Proben (die PBMC-Suspension enthalten, die in Röhrchen C gekennzeichnet sind) aus dem Karussell des Geräts. Lagern Sie das magnetische Bead-Röhrchen, das Cocktail-Mix-Röhrchen und den Pufferbehälter bei 4 °C. Entsorgen Sie die mit A, B gekennzeichneten Röhrchen und Abfall (siehe Schritt 4.1) und Filterspitzen.
    HINWEIS: Für die automatisierte Methode ist keine Nachfüllung mit PBS erforderlich, da die PBMC-Suspension ein Endvolumen von 7 ml erzeugt.
11. Übertragen Sie 500 μl der Zellen in einen Probenbecher, um eine Zellzählung ohne Verdünnung zu erhalten. Fahren Sie mit Abschnitt 5 für die Zellzählung fort.

5. Zellzählung

1. Führen Sie die Zellzählung und -viabilität mit der Methode zum Ausschluss von Trypanblau-Farbstoffen gemäß den Anweisungen des Herstellers^{durch 15}.
   HINWEIS: Für die internen Prozesse des Autors wird die Zellanalyse mit einem automatisierten Zellzähler mit den folgenden Einstellungen durchgeführt, um die PBMCs zu erfassen.
   Verdünnungsfaktor = 10 (für manuelles Protokoll, wenn die Zellsuspension in einem geringen Volumen vorliegt) oder 1 (für automatisiertes Protokoll)
   Zelltyp: PBMC
   Konzentrationsbereich = 5 x 10⁴ bis 1 x 10⁷ Zellen/ml
   Größenbereich (Durchmesser) = 8 μm bis 50 μm
   Anzahl der Bilder = 50

6. Vorbereitung der Kryokonservierung

1. Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen (mit einem schwingenden Schaufelrotor) bei 300 x g für 8 min bei 22 °C bei eingeschalteter Bremse (9 Beschleunigung/ 9 Verzögerung).
2. Legen Sie die Proben nach der Zentrifugation wieder in die biologische Sicherheitswerkbank.
3. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Eine kleine Menge Überstand kann mit dem PBMC-Pellet belassen werden, um sicherzustellen, dass es nicht gestört wird.
4. Resuspendieren Sie das Pellet in 3 mL kaltem Kryokonservierungsmedium. Mischen Sie die Suspension langsam und sanft auf und ab, bis eine homogene Masse entsteht.
   HINWEIS: Das Volumen des Cyrokonservierungsmediums kann auf der Grundlage der gewünschten PBMC-Endkonzentration angepasst werden.
5. Geben Sie 1 ml des resuspendierten PBMC in ein vorab zugewiesenes Kryoröhrchen und legen Sie es für mindestens 4 Stunden bei -80 °C in einen Gefrierbehälter mit Kontrollrate.
   HINWEIS: Das Volumen der PBMCs, die auf jedes Kryoröhrchen aliquotiert sind, kann je nach Präferenz des Untersuchers angepasst werden.
6. Nachdem Sie Kryoröhrchen mindestens 4 Stunden lang bei -80 °C gelagert haben, übertragen Sie die Kryoröhrchen zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstoffdampfphasentank.

7. Statistische Datenanalyse

1. Repräsentative Ergebnisdaten wurden mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware analysiert, wie in der Zusatzdatei 3 angegeben.

Diskussion

Humane PBMCs sind vielseitige Zelltypen, die für zahlreiche Assays verwendet werden. Der Isolationsdurchsatz ist jedoch in vielen Laboratorien, einschließlich Biobanken, oft eine Einschränkung¹⁶. Zuvor hatte die NSW Health Statewide Biobank PBMCs mit der Dichtegradientenmethode isoliert. Die Automatisierung der Methode zur Trennung von Dichtegradienten zur Erhöhung der Verarbeitungskapazität wurde untersucht, aber es wurden Hindernisse für die Implementierung identifiziert, einschließlich (i) der Kosten für einen vollständig zu automatisierenden Liquid-Handler mit einer Zentrifugationseinheit, mit der zusätzlichen Anforderung einer HEPA-Einheit zur Herstellung eines sterilen Produkts, (ii) geschultem Personal für die Programmierung und (iii) Zeitaufwand für Protokolltests. Daher wurden in dieser Studie alternative Methoden untersucht und das kommerziell erhältliche humane PBMC-Kit identifiziert, das für die manuelle und automatisierte Verarbeitung verwendet werden könnte. Die Sterilität ist gewährleistet, da die für die Verarbeitung erforderliche Ausrüstung in eine Standard-biologische Sicherheitswerkbank (Länge 1,2 m) passt. In diesem Dokument werden Änderungen an dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll¹⁴ beschrieben, um die Effizienz zu steigern und die Reagenzienkosten zu senken, ohne die Qualität zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde das Protokoll des Herstellers erweitert, um detaillierte Schritte zu Biobank-Proben für zukünftige Forschungen zu beschreiben, einschließlich Vollblut (Schritt 1.2), Plasma (Schritt 2.2) und Erythrozyten (Schritt 2.5), die aus dem ursprünglichen Blutröhrchen aliquotiert werden, sowie Zellzählung und Kryokonservierung.

In dieser Studie wurden drei PBMC-Isolationsprotokolle verglichen: Dichtegradiententrennung, manuelle und automatisierte Bead-basierte Isolierung. Es wurden Änderungen am manuellen Bead-basierten Protokoll des Herstellers vorgenommen, einschließlich der Entfernung der Buffy-Coat-Verdünnung vor der PBMC-Isolierung und der Eliminierung der Notwendigkeit eines Break-Offs für Zentrifugen, so dass die Prüfärzte einem anpassungsfähigen, kostengünstigen PBMC-Isolationsprotokoll mit hohem Durchsatz folgen können. Zunächst wurden acht übereinstimmende Vollblutproben verwendet, um PBMCs zu isolieren und die Dichtegradiententrennung und die manuelle Bead-basierte Technik zu vergleichen. Wichtig ist, dass sich die Verteilung der Zellpopulation, die Zellviabilität und die Wiederfindung von PBMCs zwischen den beiden verglichenen Methoden nicht signifikant unterschieden, wie in Abbildung 2A-F, Abbildung 3A bzw. ergänzender Abbildung 1 gezeigt. In den repräsentativen Daten waren die Zellzahlen für die Dichtegradienten-Trennmethode unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode höher, nicht jedoch bei Verwendung eines hämatologischen Zellanalysators. Die PBMC-Zelltypeinstellungen auf dem Zellzähler verwendeten einen Zelldurchmesserbereich von 8 bis 50 μm, und daher umfassen die Zählungen sowohl PBMCs als auch Granulozyten (ungefähr 12 bis 15 μm im Durchmesser), wenn die Trypanblau-Ausschlussmethode¹⁷ verwendet wird. Während der hämatologische Zellzähler eine höhere Spezifität aufwies als die Trypanblau-Ausschlussmethode, lagen einige Wiederfindungsberechnungen über 100 %, was die Fehlermarge des Instruments widerspiegelt (siehe Ergänzende Abbildung 1). Es wird daher empfohlen, dass die Forscher beim Vergleich der Ausbeuten aus PBMC-Isolationsprotokollen eine Kombination von Zellzähltechniken anwenden, da die meisten Techniken nicht sowohl spezifische als auch hochempfindliche differentielle Zellzählungen bieten. Darüber hinaus wurden keine Assays durchgeführt, um die funktionelle Aktivität von PBMCs zu vergleichen, die mit einer der beiden Techniken erzielt wurden, was eine Einschränkung unserer Analyse darstellt.

Als nächstes wurden die manuellen und automatisierten Bead-basierten Methoden verglichen, und es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen PBMC-Ausbeute oder Lebensfähigkeit aus 8 übereinstimmenden Proben festgestellt (Abbildung 4A,B). Die Zellpopulationen wurden nicht einzeln verglichen, da für beide Methoden der gleiche Antikörper-Isolierungscocktail verwendet wurde. Wichtig ist, dass die Hands-on-Zeit für die Verarbeitung von 8 Proben mit dem automatisierten Protokoll von 43 Minuten auf 22 Minuten reduziert wurde (Abbildung 4C). Während der Durchsatz, die Vermeidung von Burnout durch den Techniker und die Konsistenz der Probenverarbeitung durch Automatisierung sichergestellt werden, sind die Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien mit dem 3- bis 4-fachen höher als bei der manuellen Bead-basierten Methode. Dies geschieht nach Änderungen am Protokoll des Herstellers, um 1 ml Buffy Coat (ab einem Vollblutvolumen von 10 ml) anstelle des empfohlenen Bereichs von 2-5 ml (ab einem Vollblutvolumen von 10 ml und/oder mehr) zu verwenden. Wenn das Budget begrenzt ist, kann die Entscheidung für die manuelle Methode die Verarbeitungszeit um ~25 % verkürzen und gleichzeitig die Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien beibehalten, die mit denen der Dichtetrennmethode vergleichbar sind. Es wird empfohlen, nicht mehr als 8 Proben gleichzeitig pro Techniker zu verarbeiten, um eine angemessene Staffelung der Proben (~30 s/Probe) innerhalb der 5-minütigen Inkubationszeiten (Schritte 3.7, 3.11 und 3.14) zu gewährleisten.

Sowohl bei den manuellen als auch bei den automatisierten Bead-basierten Methoden ist die Entfernung des Buffy-Coats ein entscheidender Schritt, um eine optimale PBMC-Isolierung zu gewährleisten. Es ist wichtig zu beachten, dass in diesem Protokoll ein Buffy Coat anstelle von Vollblut verwendet wird, da das Volumen der Reagenzien auf dem Ausgangsmaterial^{Volumen 10} basiert. Das gesamte Volumen des Buffy-Fells effektiv zu entfernen, kann eine technische Herausforderung sein. Ursprünglich wurde bei dieser Methode 0,5 ml Buffy Coat entfernt, die jedoch auf 1 ml erhöht wurde, um die Regeneration zu verbessern. Um eine angemessene und konsistente Wiederherstellung des Buffy Coat zu gewährleisten, ist es wichtig, diesen Prozess in der Protokolldokumentation und Schulung detailliert zu beschreiben. Es wird empfohlen, eine Pipettenspitze beim Ansaugen des Buffy Coats zu schwenken und dabei darauf zu achten, nicht zu viele Erythrozyten aus der darunter liegenden Schicht abzusaugen (Schritt 2.3). Es ist wichtig, den Antikörpercocktail, der unerwünschte Zellen (d. h. Granulozyten und rote Blutkörperchen) bindet, nicht zu sättigen, was sich auf die Ausbeute und Reinheit auswirken kann¹⁰. Um die bei der Extraktion des Buffy Coats angesammelten Erythrozyten zu minimieren, sollte sich die Pipettenspitze zwischen der Plasma- und der Buffy-Coat-Schicht befinden. Das Volumen des Buffy Coats kann ab 1 mL erhöht werden; Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass nicht mehr als 10 % des gesammelten Volumens Erythrozyten enthalten. Alternativ kann ein automatisierter Liquid Handler verwendet werden, um Buffy Coats konsistent zu sammeln¹⁸. Die für die Kalibrierung und Fehlerbehebung von Liquid-Handling-Instrumentenprotokollen erforderlichen Stunden sind jedoch für die meisten Labore möglicherweise nicht durchführbar, insbesondere angesichts der Kosten.

Die Umstellung und Anwendung des auf Automatisierungsbeads basierenden Protokolls war angesichts des Ziels der NSW Health Statewide Biobank, in den nächsten 3 Jahren 23.000 PBMCs zu verarbeiten, von entscheidender Bedeutung. Hier wurde gezeigt, dass PBMCs bis zu 9 Tage nach der Entnahme aus ACD-Röhrchen isoliert werden können, mit einer durchschnittlichen Viabilität von >70%. Während die Ausbeute 24 Stunden nach der Entnahme optimal war, ist eine Verarbeitung innerhalb dieses Zeitrahmens nicht immer möglich, da möglicherweise Proben transportiert werden müssen. Es wurde gezeigt, dass PBMCs, die entweder mit der manuellen oder der automatisierten Bead-basierten Methode isoliert wurden, Ausbeuten von >3 x 10⁵ Zellen/ml Vollblut aufweisen können, wenn sie innerhalb von 4 Tagen nach der Entnahme isoliert werden, und >1 x 10⁵ Zellen/ml Vollblut, wenn sie innerhalb von 10 Tagen nach der Entnahme isoliert werden. Niedrige Zahlen für Proben über 5 Tage werden als Einschränkung dieser Analyse angegeben. Darüber hinaus wurden die Daten nicht nach Alter, Geschlecht und klinischer Anamnese der Teilnehmer getrennt, da diese Informationen nicht zur Verfügung gestellt wurden. Obwohl eine vergleichende Analyse erforderlich ist, um die Auswirkungen von Verzögerungen in den Verarbeitungszeiten für beide Methoden zu untersuchen, wurde bereits berichtet, dass Verzögerungen bei der PBMC-Isolierung mit der Dichtegradientenmethode die Zellqualität verringern und die Erythrozytenkontamination signifikant erhöhen^19,20. Darüber hinaus nehmen die Granulozytenanteile zu, wenn die Verarbeitung verzögert wird, und daher sollten Proben ähnlichen "Alters" für nachgelagerte Analysen gruppiert werden 20,21,22. Bemerkenswert ist, dass dieses Experiment unter Verwendung von Blut durchgeführt wurde, das mit saurer Zitronendextrose (d. h. Trinatriumcitrat, Zitronensäure und Dextrose) antikoaguliert wurde. Die Ausbeute und/oder der Anteil der Zelltypen können jedoch variieren, wenn andere Antikoagulanzien verwendet werden²³; Daher wird den Prüfärzten empfohlen, ein geeignetes Antikoagulans auf der Grundlage der vorgesehenen nachgeschalteten PBMC-Analysen auszuwählen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Protokoll für die PBMC-Isolierung mit magnetischen Beads, das an Arbeitsabläufe mit hohem Durchsatz angepasst werden kann, detailliert beschrieben wird, um die Anforderungen an die Skalierung zu erfüllen, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Sowohl die manuelle als auch die automatisierte Methode können optimiert werden, um durch Änderung des Start- und Resuspensionsvolumens spezifische Zellkonzentrationen zu erzeugen. Die NSW Health Statewide Biobank ist von der Extraktion von ~60 PBMCs pro Monat mit der traditionellen Dichtegradiententrenntechnik auf ~300 PBMCs pro Monat mit dieser automatisierungskompatiblen, beadbasierten Methode umgestiegen. Das nächste Ziel der Autoren ist es, die automatisierte Plattform zu nutzen, um bis zu 1200 PBMCs pro Monat zu verarbeiten und PBMCs, die sowohl durch magnetische Bead-basierte (manuelle und automatisierte) als auch durch Dichtegradiententechniken isoliert wurden, weiter zu vergleichen, um die Implementierung dieser Technik in anderen Labors mit besonderem Schwerpunkt auf Biobanken zu leiten.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR)	StemCellTM Technologies	07930
Class II Biological Safety Cabinet	Thermo ScientififcTM	51033311
CoolCell 1 mL FX	BioTools	BCS-407P	This is the control rate freezing container used.
Distilled Water	Bacto Laboratories	561832
DxH 500 Hematology Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	B40601	Referred to as external automated cell counter.
EasyEightsTM EasySepTM Magnet	StemCellTM Technologies	18103
EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit	StemCellTM Technologies	19654	Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich Pty Ltd	E6758-500G	Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2.
LymphoprepTM Density Gradient Medium	StemCellTM Technologies	7851
Megafuge ST4 Plus Centrifuge	Thermo ScientififcTM	THR75009903
Orion Star A211 pH meter electrode	Thermo ScientififcTM	STARA2110
Orion™ ROSS Ultra™ Glass Triode™ pH/ATC Combination Electrodes	Thermo ScientififcTM	8302BNURCA
Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml	Life Technologies Australia Pty Ltd	10010023
Prism	GraphPad
RoboSepTM Buffer 1X	StemCellTM Technologies	20104	Software used for statistical analysis.
RoboSepTM-S	StemCellTM Technologies	21000	Fully automated cell separator instrument.
RoboSep™ Filter Tips	StemCellTM Technologies	20125
SepMateTM-50 (IVD) tubes	StemCellTM Technologies	85460	IVD - In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes
Vi-CELL XR Cell Anlayzer	Beckman Coulter Life Sciences		Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196).
Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit	Beckman Coulter Life Sciences	383722