Die hypoxische ischämischen Enzephalopathie Model of Perinatal Ischämie

Zusammenfassung

Die postnatale Rattenmodell für hypoxisch-ischämischen Hirn-Trauma ist ein gut etabliertes Modell der menschlichen Neugeborenen hypoxisch ischämischen Enzephalopathie (HIE). In diesem Artikel beschreiben wir das Modell der HIE in postnatalen Rattenjungen.

Zusammenfassung

Hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie (HIE) ist die Folge der systemischen Asphyxie auftreten bei der Geburt. Fünfundzwanzig Prozent der Neugeborenen mit HIE entwickeln schweren und dauerhaften neuropsychologischen Spätfolgen, darunter geistige Retardierung, Zerebralparese und Epilepsie. Die Ergebnisse der HIE sind verheerend und permanent, so dass es kritisch zu identifizieren und zu entwickeln, therapeutische Strategien zu Hirnverletzungen bei Neugeborenen reduzieren mit HIE. Zu diesem Zweck hat die neugeborenen Rattenmodell für hypoxisch-ischämischen Hirn-Trauma wurde entwickelt, um diese conditio humana Modell. Die HIE-Modell wurde erstmals von Vannucci et al ¹ validiert und ist seitdem intensiv genutzt, um Mechanismen der Hirnschädigung durch perinatale Hypoxie-Ischämie ^{2 zu} identifizieren und zu testen, mögliche therapeutische Interventionen ^3,4. Die HIE-Modell ist ein zweistufiger Prozess und umfasst die Ligation der linken Arteria carotis communis durch die Exposition gegenüber einer hypoxischen Umgebung gefolgt. Zerebralen Blutflusses (CBF) in der Hemisphäre ipsilateral zur ligiert Halsschlagader nicht wegen der Sicherheit des Blutflusses über den Kreis der Willis Rückgang, allerdings mit geringeren Sauerstoff-Partialdruck nimmt die CBF in der ipsilateralen Hemisphäre deutlich und führt zu einseitigen ischämischen Schädigung . Die Verwendung von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) zu färben und zu identifizieren ischämische Hirngewebe wurde ursprünglich für die Erwachsenen-Modelle von Nagetier zerebraler Ischämie ⁵ entwickelt, und wird verwendet, um das Ausmaß der zerebralen infarctin zu frühen Zeitpunkten bewerten bis zu 72 Stunden nach dem ischämischen Ereignis ^6. In diesem Video zeigen wir die hypoxisch-ischämischen Schädigung Modell in postnatalen Rattenhirn und der Auswertung der Infarktgröße mittels TTC-Färbung.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Stanford University und hält sich an die National Institutes of Health Richtlinien für die Verwendung von Versuchstieren verabschiedet.

Neonatal Rat HIE-Modell

1. Post-Natal-Tag (PND) 7 Sprague-Dawley Ratten Welpen (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) sind voll mit Isofluran (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL, 3-4% für Induktions-und 1-2% für Wartung).
2. Durch einen kleinen Schnitt in den Hals gemacht (Extra Thin Iris Scissors # 14088-10, Fine Science Tools Inc, Foster City, CA) auf der linken Arteria carotis communis (CCA) aussetzen.
3. Der CCA ist mit 5-0 Seidenfaden (5-0 Seide, Ethicon, Somer, NJ) ligiert.
4. Der Schnitt wird mit Cyanacrylat-Klebstoff (Elmers Products Inc, Columbus, OH) geschlossen. Der Schnitt wird mit Klebeband abgedeckt und Anästhesie wird gestoppt. Die Welpen sind, um ihre Mutter zurück und lässt 1-2 Stunden erholen.
5. Welpen sind dann in einer hypoxischen Kammer, die 8% Sauerstoff mit 92% Stickstoff für 100 Minuten bei 37 ° C. ausgewogenen enthält platziert 8% oxygen/92% Stickstoff (Airgas, Sacramento, CA) fließen über einen Schlauch in die Maus Käfig mit einer Kunststoffabdeckung ausgestattet. Der Deckel unternommen wird, um den Käfig fit und hat zwei Löcher von 2 cm im Durchmesser, ermöglicht eine davon mit dem Rohr verbunden, um die 8% Sauerstoff Gastank und anderen erhalten das Gas flowout. Die Kammer ist in ein Wasserbad gestellt und ist bis vor gewärmt zu bedienen und ein Thermometer im Inneren der muss 37 ° C vor Beginn der Hypoxie zu registrieren.
6. Am Ende der 100 Minuten von Hypoxie, sind die Welpen wieder zu ihren Damm für die Verwertung zurückgegeben.
7. 24 Stunden nach dem Ende der Hypoxie, sind Welpen durch tiefe Narkose mit Isofluran getötet. Hirngewebe wird mit kaltem physiologischer Kochsalzlösung perfundiert, gefolgt von einer Lösung aus kaltem 1% TTC in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). TTC muss immer vor Licht geschützt werden.
8. Brains entfernt und gekühlt 1-2 Minuten auf dem Eis, und vier koronalen Abschnitte 3 mm auseinander (Ebenen 1-4) geschnitten werden, beginnend rostral auf der Ebene der opticchiasm und Infundibulum, entsprechend der Bregma 1,8 ~ 2,0 mm Höhe der adulten Maus Gehirn.
9. Hirnschnitten werden in TTC-Lösung getaucht und bei 37 ° C für 8 Minuten, gefolgt von Fixierung in 4% Paraformaldehyd / PBS über Nacht. Da TTC lichtempfindlich ist, halten Scheiben fern von Licht in dieser Zeit.
10. Der TTC gefärbten Schnitten werden gescannt und digitalisiert. Mit Bild-J (NIH, Bethesda, MD), die folgenden sind für jede Ebene gemessen: Bereich des Infarktes (ungefärbten Bereich), im Bereich der ipsilateralen Hemisphäre und im Bereich der kontralateralen Hemisphäre. Der prozentuale Infarktareal pro Scheibe wie folgt berechnet: (Bereich der Infarkt / Bereich der ipsilateralen Hemisphäre) oder A _1, A _2, A ₃ und A _4. Der prozentuale Volumen des Infarkts ist als die Summe (A ₁ + A ₂ + A ₃ + A ₄₎ * 3mm berechnet. Bereiche der kortikalen oder striatalen Verletzungen können auch separat in einer ähnlichen Weise quantifiziert werden.

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Vertreter HIE koronalen Ebenen 1-4 gefärbt mit TTC.

TTC gefärbten koronalen Abschnitte demonstrieren Bereich der Infarkt (in weiß).

Diskussion

Das Nagetier postnatale HIE-Modell ist ein etabliertes Modell, rekapituliert zerebralen Hypoxie in der perinatalen Periode bei Neugeborenen auftreten. Umfangreiche histologische und immunhistochemische Charakterisierung Studien haben gezeigt, dass die 7 Tage alte Nagetier der analogen Gehirn Reife zu einer dritten Trimester menschlichen Fötus ⁷ Modell hat. Das Nagetier HIE-Modell wurde sehr informativ für das Verständnis der Mechanismen der Hirnschädigung von perinatalen Hypoxie ^2, wo Eingriffe wie Hypothermie wurd...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley Rat Pups	Animal	Charles River Laboratories
Isoflurane	Surgery	Baxter Internationl Inc.
8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas	Surgery	Airgas
2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	T8877
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Reagent	GIBCO, by Life Technologies
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148