Il modello di encefalopatia ipossico ischemica di ischemia perinatale

Riepilogo

Il modello di ratto post-natale per ipossico-ischemica lesioni cerebrali è un consolidato modello di umano neonatale encefalopatia ipossico ischemica (HIE). In questo articolo, si descrive il modello di HIE in post-natale cuccioli di ratto.

Abstract

Encefalopatia ipossico-ischemica (HIE) è la conseguenza di asfissia sistemica che si verificano al momento della nascita. Venticinque per cento dei neonati con HIE sviluppare gravi e permanenti conseguenze neuropsicologiche, compreso il ritardo mentale, paralisi cerebrale ed epilessia. Gli esiti di HIE sono devastanti e permanenti, il che rende fondamentale per identificare e sviluppare strategie terapeutiche per ridurre le lesioni cerebrali nei neonati con HIE. A tal fine, il modello di ratto neonatale per ipossico-ischemica danno cerebrale è stato sviluppato per questo modello condizione umana. Il modello HIE è stato convalidato da Vannucci et al ¹ e da allora è stato ampiamente usato per identificare i meccanismi di danno cerebrale perinatale risultante da ipossia-ischemia ² e per testare potenziali interventi terapeutici ^3,4. Il modello HIE è un processo in due fasi e prevede la legatura della carotide comune sinistra seguita da esposizione a un ambiente ipossico. Flusso ematico cerebrale (CBF) nell'emisfero ipsilaterale alla legatura dell'arteria carotide non diminuisce a causa del flusso collaterale sangue attraverso il circolo di Willis, ma con la tensione di ossigeno inferiore, la CBF nell'emisfero ipsilaterale diminuisce significativamente e si traduce in unilaterali danno ischemico . L'uso di 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) per colorare ed identificare tessuto ischemico cerebrale è stato originariamente sviluppato per i modelli adulti di ischemia cerebrale roditori ^5, e viene utilizzato per valutare il grado di infarctin cerebrale in momenti primi fino a 72 ore dopo l'evento ischemico ^6. In questo video, dimostriamo la ipossico-ischemica modello lesioni nel cervello di ratto post-natale e la valutazione della dimensione dell'infarto mediante colorazione TTC.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Stanford University e si attiene alle linee guida dell'Istituto Nazionale di Sanità per l'uso di animali da esperimento.

Neonatale Rat modello HIE

1. Giorni post-parto (PND) 7 Sprague-Dawley ratti (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) sono completamente anestetizzati con isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL; 3-4% per l'induzione e 1-2% per manutenzione).
2. Una piccola incisione viene fatta nel collo (Extra Sottile Forbici Iris # 14088-10, Fine Science Strumenti Inc, Foster City, CA) per esporre la sinistra arteria carotide comune (CCA).
3. Il CCA è legatura con una sutura di seta 5-0 (5-0 seta, Ethicon, Somer, NJ).
4. L'incisione viene chiusa con adesivo cianoacrilato (Elmers Products Inc, Columbus, OH). L'incisione è coperta di nastro e l'anestesia è fermato. I cuccioli sono tornati alle loro diga e ha permesso di recuperare per 1-2 ore.
5. I cuccioli vengono poi poste in una camera ipossica che contiene l'8% di ossigeno equilibrato con il 92% di azoto per 100 minuti a 37 ° C. 8% di azoto dei gas oxygen/92% (Airgas, Sacramento, CA) che attraverso un tubo nella gabbia del mouse dotato di un coperchio di plastica. La copertina è fatta per adattarsi alla gabbia e ha due fori di 2 cm di diametro, una delle quali per ricevere il tubo collegato alla bombola di ossigeno 8% del gas e un altro permette al gas di flowout. La camera si trova in un bagno d'acqua ed è riscaldato prima dell'uso e un termometro all'interno di esso deve registrare 37 ° C prima di ipossia.
6. Alla fine di 100 minuti di ipossia, i cuccioli sono tornato di nuovo ai loro diga per il recupero.
7. 24 ore dopo la fine di ipossia, i cuccioli sono eutanasia da anestesia profonda con isoflurano. Tessuto cerebrale è perfuso con soluzione fisiologica fredda, seguita da una soluzione di fredda 1% TTC in tampone fosfato, pH 7.4 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). TTC devono essere tenuti al riparo dalla luce.
8. Cervelli sono stati rimossi e raffreddati per 1-2 minuti in ghiaccio, e quattro sezioni coronali 3 mm tra i (livelli 1-4) vengono tagliati, a partire rostralmente a livello del opticchiasm e infundibolo, corrispondente al bregma 1,8 ~ 2,0 mm Livello di il cervello di topo adulto.
9. Sezioni di cervello sono immersi in una TTC e incubate a 37 ° C per 8 minuti, seguita da fissazione in paraformaldeide 4% / PBS durante la notte. TTC perché è sensibile alla luce, tenere le fette al riparo dalla luce durante questo periodo.
10. Le sezioni colorate TTC vengono scansionati e digitalizzati. Utilizzando immagini J (NIH, Bethesda, MD), i seguenti sono misurati per ogni livello: area di infarto (area senza macchia), l'area dell'emisfero ipsilaterale, e la zona dell'emisfero controlaterale. La percentuale dell'area infartuata per fetta è calcolato come: (area di infarto / area di emisfero ipsilaterale), A _1, A _2, A ₃ e A _4. Il volume percentuale di infarto è calcolato come la somma (A ₁ + A ₂ + A ₃ + A ₄₎ * 3 mm. Aree di lesioni corticali o striato può anche essere quantificato separatamente in modo simile.

Rappresentante Risultati

Figura 1. Rappresentante HIE livelli coronale 1-4 macchiata di TTC.

TTC sezioni colorate coronali dimostrare area di infarto (in bianco).

Discussione

Il modello di roditore postnatale HIE è un modello stabilito che l'ipossia cerebrale ricapitola che si verificano nel periodo peri-natale dei neonati. Ampi studi istologici e caratterizzazione immunocitochimica hanno dimostrato che il roditore 7 giorni vecchio ha la maturità analogo cervello per modellare terzo trimestre di gravidanza ⁷ feto umano. Il modello di HIE roditore è stato molto istruttivo per comprendere i meccanismi di danno cerebrale perinatale da ipossia ^2, dove interventi come l'ipotermia sono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley Rat Pups	Animal	Charles River Laboratories
Isoflurane	Surgery	Baxter Internationl Inc.
8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas	Surgery	Airgas
2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	T8877
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Reagent	GIBCO, by Life Technologies
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148