Die Finanzierung durch die National Science Foundation (MF) zur Verfügung gestellt.

Einführung Die OMT ist eine Adaption eines magnetischen Leine-System [1] entwickelt, um eine &quot;virtuelle Feder-Simulator&quot; zu integrieren. Folgende Protokolle werden erklären, wie man richtig Leine fliegt (Teil 1) und stellen Strategien für den Aufbau des Magneten (Teil 2) und Massenstrom geregelt Geruch Abgabesystem (Part3). Die hier beschriebenen Informationen wird für dieses spezielle System optimiert und kann für Bauteile mit anderen technischen Spezifikationen variieren. Teil 1: Tethering Fliegen Die Schritte für die Anbindehaltung hier beschriebenen ähnlich vielen früheren Studien [2], das speziell für den Einsatz in einer OMT [3]. Proper Anbindehaltung ist entscheidend, um robuste und reproduzierbare experimentelle Studien zu gewährleisten. Die Wichtigkeit eines sorgsamen Tethering kann nicht überbewertet werden. <ol><li> Sammeln Sie fliegt 4-6 Tage post Schlüpfen und verhungern sie für 4-6 Stunden. Legen Sie eine Kimwipe mit Wasser angefeuchtet in der foodless Fläschchen, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Übertragen einer Charge von Fliegen aus einer Flasche zu einem kleinen Fläschchen und legen Sie sie in einer Messing-Block auf einem Peltier-Kühlung Bühne bei etwa 4 Grad Celsius eingestellt. Die richtige Temperatur betäubt die Fliegen innerhalb von ca. 30 Sekunden. </li><li> Sortieren Sie die Fliegen an der kalten Oberfläche des Kühlstufe. Ein feuchtes Kimwipe sorgt für eine konstante Kühlung und Feuchtigkeitstransport von der Nagelhaut. Wählen Sie die größten Weibchen Anbindehaltung. </li><li> Mit einem feinen Pinsel, drücken Sie eine Fliege in die richtige Position in der custom-built Sarkophag geformt, um einen einzigen Wildtyp weibliche Fruchtfliege unterzubringen. <img src="/files/ftp_upload/old/1063_2008_11_26_2/1063_Figure-01_thumb.png" alt="" /> Abbildung 1. <a href="https://www.jove.com/files/1063_2008_10_28_1/1063_Figure-01.png">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.</a> </li><li> Wir Position ein minutien pin (Fines Science Tools) mit einem Magnetstab an einem Mikromanipulator befestigt. Der Stift ist so ausgerichtet, dass das stumpfe Ende des dorsalen Thorax berührt unmittelbar hinter dem Kopf zwischen den beiden Flügeln werden. Der Stift sollte perfekt vertikal, wenn Kopf-on zu den Augen angesehen. Schon eine kleine Menge von &#39;roll&#39; zwischen dem Fliegen und Pin kann nicht toleriert werden. Die Seitenansicht Winkel zwischen dem Stift und der Längsachse des Körpers sollte mit einer Nase-up Winkel von 30 Grad relativ zum Horizont (Abb. 1). Hinweis: Für einen optimalen Betrieb in den Magneten Leine, die Stifte müssen eventuell auf kürzere Längen zugeschnitten werden. Dies hängt ganz von der Entfernung zwischen der Aussetzung Magneten. </li><li> Sobald die minutien pin ausgerichtet ist, mit einem dünnen Stahlseil um einen kleinen Tropfen UV-aktivierbare Kleber (Electrolite Corp), um das stumpfe Ende des minutien pin gelten. </li><li> Bearbeiten Sie die Pin so den Leim Tropfen berührt die Fliege Thorax gerade über dem Kopf. Mit der richtigen Tröpfchengröße, sollte der Kleber Glühen und Flow aus dem Stift auf den Brustkorb. Seien Sie vorsichtig, nicht zu viel Kleber verwenden. </li><li> Cure den Leim mit zwei 20 Sekunden bricht der UV-Licht. </li><li> Legen Sie die feste fliegen beiseite und wiederholen. Scheiben kleine Quadrate Kimwipe und mit einer Pinzette geben eine für jeden angebundenen fliegen in die Flucht zu beschränken. </li><li> Nach einer Stunde der Erholung werden die angebundenen Fliegen bereit für Experimente. </li><li> Unsachgemäße Kleben behindern kann eine Fliege in der Lage, in der Magnet-Arena durchführen. Jeder fliegen sollte für eine gleichmäßige Drehung zu Beginn eines jeden Versuchs, um sicherzustellen, das Fliegen richtig verklebt überprüft werden. Dies kann durch Drehen ein Streifenmuster mit einem ausreichend großen räumlichen Periode starken optomotorischen Reaktionen auszulösen erreicht werden [4]. Wenn die Fliege an der falschen Neigungswinkel geklebt oder gekippt auf den Stift in Bezug auf die Längsachse, die fliegen können (i) gar nicht drehen, (ii) eine eingeschränkte Beweglichkeit, oder (iii) bei inkonsistenten drehen Geschwindigkeit. In den genannten Fällen die Fliege muss entsorgt und ersetzt werden durch eine neue. Wenn das Problem dadurch behoben wurde wahrscheinlich ein Fall von unsachgemäßer Kleben. (Wenn anstelle der Fliege nicht das Problem löst, siehe Teil 2.4) </li></ol> Teil 2: Ausrichten der Magnete Ausrichten der Magnete (Seltene-Erden-magnets.com) richtig für das Fliegen zu einem glatten 360-Grad-Bewegungsfreiheit zu erreichen. Befolgen Sie diese Schritte richtig ausrichten Magneten. <ol><li> Der untere Ring Magnete sind horizontal durch eine Kunststoff-Hülse gehalten und wird direkt auf der Spitze eines klaren Vakuumkammer (Abb. 1; beschrieben weiter in Teil 3). Die obere Stange Magnet ist vertikal um etwa 3 / 4 &quot;oberhalb des unteren Magneten fixiert. </li><li> Rund Richten Sie den oberen und unteren Magneten visuell, indem die obere Stange Magneten direkt über dem Mittelpunkt der unteren Ring-Magneten. Es ist sinnvoll, den oberen Magneten an einem Mikromanipulator (Siskiyou Inc.) legen für die Feinskalierung. </li><li> Epoxy eine V-Saphirlager (Small Parts) an der Unterseite des oberen Magneten zu minimieren Rotationsreibung und zu standardisieren fliegen Positionierung. </li><li> Platzieren Sie eine Fliege in die Arena und die horizontale und vertikale Position des oberen Magneten, bis die fliegen können ruhig und stetig um 360 Grad drehen in die Hochachse. Jeder fliegen sollte für eine gleichmäßige Drehung zu Beginn jedes Experiment überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Magneten richtig ausgerichtet sind und dass einzelne minutien Pins nicht beschädigt werden (siehe Teil 1,11). Wenn die Magnete nicht richtig ausgerichtet sind die fliegen können (i) überhaupt nicht drehen (ii) eine eingeschränkte Beweglichkeit (iii) bei inkonsistenten Geschwindigkeiten zu drehen. Wenn das Problem durch Austausch der Fliege mit einer neuen Lösung ist, war es wahrscheinlich wegen einer Verklebung Problem (siehe Teil 1). Wenn diese Probleme für jede Fliege existieren, ist es wahrscheinlich ein Problem mit der Ausrichtung der Magnete und weitere Anpassung erforderlich. </li><li> Achtung: beim Spielen mit Seltenerd-Magneten kann Spaß machen, sie sind sehr gefährlich. Missbrauch führt zu beschädigten Geräten und / oder einfache Körperverletzung. Seien Sie besonders vorsichtig mit diesen verlockenden noch leicht unterschätzt Magneten. </li></ol> Teil 3: Odor Lieferung <ol><li> Der Geruch Lieferung System basiert auf einer zuvor beschrieben basiert [5] und ist der härteste Teil zu optimieren (Abb. 1). Es erfordert viel Geduld und Trial-and-error. Befolgen Sie diese Schritte, um stabile Geruch Tracking zu erreichen. </li><li> Die ersten Set-up des Geruchs System erfordert laufende Schmalspurbahn Teflon-Schlauch (Kleinteile) aus dem Gas-Multiplexer (Sable Systems International), die custom built Wasser / Geruch Fläschchen. Der Ausgang dieser Flaschen wird direkt an den subkutanen Port-Rohre mit gleichem Teflon-Schlauch. </li><li> Eine klare Acryl Vakuumkammer wird unter der Arena, um den Magneten zu unterstützen positioniert. Wir verwenden ein 4mm Glasrohr unter der Fliege an der Vakuumkammer montiert, um das Vakuum Eröffnung näher an die Fliege zu bringen und zur Verringerung der Durchmesser der Öffnung. </li><li> Legen Sie die Anbindung an eine Fliege in die Arena mit einer Pinzette. </li><li> Schalten Sie ein attraktives Geruch (Apfelessig gut funktioniert), und visuell zu überprüfen, dass die Fliege den Geruch Tracks. Wenn die Fliege scheint keine Vorliebe für den Geruch haben, folgen die nächsten drei Schritte. Dies kann mehrere Fliegen, und mehrere Studien. </li><li> Passen Sie die Position des Geruchs-Anschluss, bis die Fliege erscheint, um den Geruch zu verfolgen. Wir bestiegen den Geruch Ports auf Mikromanipulatoren (Siskiyou Inc.) positioniert und 4mm Rücken-und 3mm anterior der Fliege den Kopf. </li><li> Passen Sie den Massenstrom, bis die Fliege erscheint, um den Geruch zu verfolgen. Unsere Einstellungen sind 7ml/min (Sable Systems International MFC-4). </li><li> Stellen Sie den Durchfluss des Vakuums, bis die Fliege erscheint, um den Geruch zu verfolgen. Wir setzen das Vakuum Durchflussmenge bei 13l/min mit einem Durchflussregler (Cole Parmer). Hinweis: Building Vakuum Versorgungsleitungen im Laufe der Zeit schwanken verursacht Schwankungen in plume Struktur. Es kann nützlich sein, um eine externe Vakuumpumpe, die Durchflussregler Verbindung für konstante Saugleistung Bedingungen. </li><li> Sobald die Position des Hafens und die Volumenströme eingestellt werden, in regelmäßigen Abständen zwischen liefert Wasserdampf und Geruch Dampf-Schalter mit einer schaltbaren mit einem Gas-Multiplexer und visuell zu überprüfen, dass die Fliege nur Spuren der Geruch, wenn der Geruch ist. Gelegentlich kann Restgeruch innerhalb der Geruch Port entlocken Geruch Verfolgung, wenn der Geruch ausgeschaltet ist. Dies kann ohne Entfernen der richtig positioniert Geruch Hafen durch das Ausfüllen der subkutanen Röhren mit Ethanol und sammeln sie auf dem Lieferschein Ende mit einem Kimwipe beseitigt werden. Mit Druckluft, Schlag verbleibende Ethanol aus und wieder Experimente. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Wenn diese Schritte korrekt befolgt werden zwei Dinge zu beachten. Zunächst unter ständigem Drehen visuelle Reize die Anbindung an eine Fliege in der OMT platziert sollte problemlos um 360 Grad drehen in die Hochachse. &quot;Jerky&quot; wird (so genannte Sakkaden) sind charakteristisch für spontane Drehverhalten in Abwesenheit der ständigen visuellen Reizen. Wenn Fliegen können offenbar nicht reibungslos drehen können bei unsachgemässer Verklebung (siehe Teil 1) und falsch ausgerichtete Magneten daran schuld sein (siehe Teil 2). Zweitens, wenn der Geruch eingeschaltet ist, sollte die fliegen in Richtung des Geruchs Kopf. Wenn der Geruch ausgeschaltet ist, sollte die Fliege spontan Sakkade ohne Präferenz für eine einzelne Position in der Arena. Wenn Fliegen nicht aktiv verfolgen Sie den Geruch Fahne, die Position des Geruchs-Port, der Luftdurchsatz und / oder das Vakuum Durchfluss muss möglicherweise angepasst werden (siehe Teil 3).

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Tammero, L. F., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision-avoidance+and+landing+responses+are+mediated+by+separate+pathways+in+the+fruit+fly,+Drosophila+melanogaster.">Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+output+reflects+the+linear+superposition+of+visual+and+olfactory+inputs+in+Drosophila.">Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).</li></ol>

Tethering Fliegen und entlocken Stallgeruch Tracking in diesem Bereich ist relativ einfach. Es erfordert Übung, Geduld und Versuch und Irrtum. Viele Teile dieser Arena konnten weiter optimiert werden oder ersetzt, um Variationen in der experimentellen Ertragspotential. Zum Beispiel sind neuere Versionen der Vakuumkammer wesentlich kleiner und lassen mehr Platz unterhalb der Arena. Außerdem kann die Stärke und Art der Seltenen Erden-Magneten leicht variiert werden und zusätzliche Geruchs-Ports könnten hinzugefügt, um die Anzahl der Ger...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cooling Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teca</td>
<td>LHP-300CP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brass Cooling Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>~4 x 8 x 2cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Sarcophagus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contact us for details</td>
</tr>
<tr>
<td>UV-Activated Glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kemxert corp</td>
<td>KOA300</td>
<td>1oz bottle lasts years</td>
</tr>
<tr>
<td>Panel System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>http://www.dickinson.caltech.edu/panels</td>
<td>[4]</td>
</tr>
<tr>
<td>Minutien Pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lower Ring Magnets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0615</td>
<td>5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125"</td>
</tr>
<tr>
<td>Upper Rod Magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0750</td>
<td>0.125" x 1"</td>
</tr>
<tr>
<td>V-Jewel Bearing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>VJ-0469-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MFC-4 Flow Regulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas Multiplexer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Teflon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>STT-20-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 Gauge Hypodermic Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>HTX-20R-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4mm o.d.</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum Flow Regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole Parmer</td>
<td>EW-32464-52</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a magnetic tether system to investigate visual and olfactory mediated flight control in drosophila

Es ist seit vielen Jahren klar, dass Insekten visuelle Hinweise nutzen, um ihre Position in einem Wind-Strom zu stabilisieren. Viele Tiere zu verfolgen Gerüche in den Wind. Als solche visuellen Stabilisierung der Wind Tracking direkt Hilfen in Geruch Tracking-Systems. Aber olfaktorischen Signale direkt beeinflussen visuelle Nachverfolgung Verhalten unabhängig von Wind cues? Auch die jüngste Flut von Untersuchungen über die Neurophysiologie und neurologische Genetik des Geruchssinns bei Drosophila immer mehr technisch anspruchsvolle und quantitative Verhalten Assays motiviert. Hier modifizierten wir eine magnetische Halteseil, das ursprünglich für das Sehen Experimente durch die Ausrüstung der Arena mit schmalen Laminar-Flow-Geruch Federn entwickelt. Eine Fliege ist auf einem kleinen Stahlstift geklebt und aufgehängt in einem Magnetfeld, dass sie frei yaw ermöglicht. Kleiner Durchmesser Lebensmittel Geruch Federn sind nach unten über die Fliege den Kopf gerichtet, entlocken stabil Tracking von einem hungrigen fliegen. Hier haben wir auf die kritische Mechanik der Anbindehaltung zu konzentrieren, die Ausrichtung der Magnete, die Ausarbeitung der Geruch Fahne, und bestätigen Stallgeruch Tracking-Systems.

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A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Hier beschreiben wir, wie man eine Fliege Leine in einer olfaktorischen magnetisch-Leine (OMT) Apparat. Wir beschreiben, wie die seltenen Erden Magneten und Geruch Häfen, und wie Massenströme für den Reiz Lieferung und Vakuumsauger, um eine optimale Geruch Tracking zu erreichen gesetzt auszurichten.

A Magnetic Tether System zur visuellen und olfaktorischen Mediated Flight Control in Drosophila Untersuchen

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Hier beschreiben wir, wie man eine Fliege Leine in einer olfaktorischen magnetisch-Leine (OMT) Apparat. Wir beschreiben, wie die seltenen Erden Magneten und Geruch Häfen, und wie Massenströme für den Reiz Lieferung und Vakuumsauger, um eine optimale Geruch Tracking zu erreichen gesetzt auszurichten.

Serie: A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visuell vermittelte Odor-Tracking während des Fluges in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Forschung

Biologie

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Design und Analyse des Temperaturpräferenzverhaltens und seines circadianen Rhythmus in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...