Gefördert durch ein Stipendium der National Science Foundation, um MF

Die OMT ist eine Adaption eines magnetischen Leine System 1 entwickelt, um eine virtuelle Wolke Simulator 2 zu integrieren. Folgende Protokolle werden erklären, wie man die erworbenen Video-Bilder (Teil 1) zu optimieren und führen zwei Arten von grundlegenden visuell-olfaktorischen Experimente (Teil 2 &amp; 3). Teil 1: Video Acquisition Optimierung des Videobildes ist entscheidend für die Qualität der erfassten Daten. Befolgen Sie diese Schritte für saubere Bilder. <ol><li> Legen Sie einen frisch gebundenen Fliege in die Arena mit einer Pinzette. </li><li> Positionieren Sie den FireWire-Board-Kamera (Fire-I 1394store.com) unter dem klaren Acryl-Vakuumkammer, so dass die Kamera-Ansicht direkt nach oben durch die Kammer ist, durch ein Glasrohr, an der ventralen Seite des angebundenen fliegen. Achten Sie darauf, dass es keine IR-Filter-Beschichtung auf der Linse des Video-System. </li><li> Zur Beleuchtung der Fliege, verwenden Sie eine kreisförmige Anordnung von Infrarot-LEDs (Small-Parts Inc) knapp unter dem LED-Panels positioniert. Fokus jeweils auf Körper der Fliege LED individuell für eine gleichmäßige Ausleuchtung. </li><li> Um Blendung durch das Panel-System zu reduzieren und visuelle Hinweise von der Fliege beobachtet zu minimieren, ist es nützlich zu beschichten alle reflektierenden Oberflächen innerhalb der Kamera-Ansicht mit flache schwarze Farbe. Raumbeleuchtung sollte abgeschaltet werden, um Blendung und Helligkeitsmodulationen nachweisbar durch die Fliege ins Auge zu reduzieren. </li><li> Sichtprüfung das Kamerabild. Die Fliege sollte helle, weiße gegen einen schwarzen Hintergrund. Wenn das Bild unscharf ist das Objektiv Möglicherweise müssen fokussiert werden. Wenn die Fliege ist dunkel, kann die LED-Arrays werden unscharf oder nur unzureichend für eine angemessene Beleuchtung mit Strom versorgt. Wenn der Hintergrund enthält helle Objekte, mount eine Platte aus schwarzem Flock Papier knapp über die Fliege Hintergrund Reflexion zu minimieren. </li><li> Wir erwerben Video mit benutzerdefinierten Subroutinen in Matlab geschrieben mit dem Image Acquisition Toolbox. </li></ol> Teil 2: Die Fliege finden den Geruch plume Ein einfaches Experiment in der OMT ist die Beobachtung ein hungriger (verhungert) fliegen Ortung und dann aktiv verfolgen eine Fahne von attraktiven Speisen Geruch. Die Manipulation der visuellen Umgebung beeinflusst die Fliege Fähigkeit, robust Nachverfolgen der appetitive Lebensmittel Geruch. Beachten Sie, dass Experimente in der Regel werden in zufälliger Block-Format ausführen, um eine Tendenz in der experimentellen zu minimieren. Alle externen Hardware-(Gas-Multiplexer, LED-Arena, Video-Akquisition) werden durch eigene Software-Routinen in Matlab (Mathworks) geschrieben wurde. <ol><li> Legen Sie einen frisch gebundenen Fliege in die Arena mit einer Pinzette. </li><li> Vor jedem Experiment mit der visuellen Darstellung, drehen die Fliege für mehrere Umdrehungen 3 bis glatte Bewegung um die gesamten 360 Hochachse zu gewährleisten. Wenn die Fliege nicht spinnen nicht reibungslos verwerfen. Wenn das Problem weiterhin besteht, ist die wahrscheinliche Ursache falsch ausgerichtete Magneten. Hinweis: Wenn die Verteilung der Arena Überschrift für mehrere Trajektorien während der Spin-Studie zeigt signifikante Peaks (dh nicht über 360 Grad flach), gibt es wahrscheinlich eine Orientierung Bias aufgrund von falsch ausgerichteten Magneten. </li><li> Präsentieren Sie die Fliege mit dem folgenden Beispiel experimentellen Bedingungen in zufälliger Reihenfolge: i) mit hohem Kontrast Streifenmuster mit Wasserdampf, die aus der Geruchs-Anschluss; ii) mit hohem Kontrast Streifenmuster mit attraktiven Geruch Dampf; iii) eine einzige vertikale Streifen 90 Grad versetzt aus dem Wasserdampf Düse, und iv) einer 90-Grad-Streifen mit Geruch Dampf ausgeglichen. In unserer Erfahrung, Arbeit Intervallen von 30 Sekunden gut für Experimente, in denen Fliegen herausgefordert, den Geruch Quelle auf ihren eigenen zu finden sind. Wir erwerben Video mit 30 Hz für die Dauer der einzelnen experimentellen Bedingungen und die Analyse der Bilder offline mithilfe von benutzerdefinierten Software-Routinen in Matlab geschrieben (eine der nützlichsten eingebauten Matlab-Funktionen ist regionprops.m die geometrischen Eigenschaften einer Ellipse Analysen. </li><li> Bei der Verwendung von hohen Konzentrationen Geruch kann Rest-Geruch aus dem Geruch Port freigegeben, nachdem der Geruch ist ausgeschaltet. Zur Minimierung der Auswirkungen ausgerichtet diesem haben, ist es sinnvoll, die fliegen für ein paar Sekunden Spin mit einem rotierenden Panorama, damit das System zu spülen restliche Geruch kann. </li><li> Es ist auch vorteilhaft für visuell drehen the fly zwischen experimentellen Behandlungen (i) halten die Fliegen aktiv in das Experiment und (ii) zu halten Fliegen aus den verbleibenden an einer Stelle beschäftigt. Ein Beispiel experimentieren können der folgenden Reihenfolge: i) 22. Eingangsdiagnostik Spin; ii) 5 Sekunden Zwischenschleudern; iii) 22. Zustand Paar Nr. 1; iv) 5 Sekunden Zwischenschleudern; v) 22. Zustand Paar Nr. 2. </li></ol> Teil 3: Die Fliege bleibt innerhalb der Geruch plume Ein zweites grundlegendes Experiment in der OMT ist die visuelle drag eine Fliege in einem Geruch plume, sofort die visuelle Bedingungen, und messen Sie dann die Fähigkeit, in die Feder zu bleiben. Auch hier beachten Sie, dass alle Versuche in einer zufälligen Block forma sind fertigt zu minimieren Bias in experimentellen bestellen. <ol><li> Legen Sie einen frisch gebundenen Fliege in die Arena mit einer Pinzette. </li><li> Optisch drehen (Spin) der Fliege mehrmals rund um die Arena vor jedem Experiment als diagnostisches überprüfen, um sicherzustellen, dass das Tier die Fähigkeit zur Orientierung in jeder Richtung hat (siehe Teil 2.2). </li><li> Vor jeder Bedingung, von der experimentellen Geruch (Wasser oder Essig) abbiegen und visuell &quot;ziehen&quot; die Fliege in die Wolke durch oszillierende eine kleine vertikale Streifen an der Position der Fahne. Dieser nutzt die leistungsstarke Streifen Fixierung Verhalten der Fliegen [4] beobachtet. </li><li> Nun, da die Fliege orientiert die Fahne ist, entfernen Sie die oszillierenden Streifen und Gegenwart der folgenden Beispiel-Visual Bedingungen: i) einen hohen Kontrast Panorama Streifen mit Wasserdampf (Abb. 1A); ii) einheitlichen Hintergrund mit Wasserdampf (Abb. 1B); iii) mit hohem Kontrast Panorama Streifen mit Geruch Dampf (Abb. 1C); iv) einheitliche Hintergrund mit Geruch Dampf (Abb. 1D). Erwerben Sie Video als in 2.3. Ein Beispiel Experiment haben die fließenden Reihenfolge: i) 22. Eingangsdiagnostik Spin; ii) 5 Sekunden plume Streifen Schwingung; iii) 22. Zustand Paar Nr. 1; iv) 5 Sekunden plume Streifen Schwingung; v) 22. Zustand Paar Nr. 2 . </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/old/1110_2009_1_22_1/Fig 1.png" alt="Abbildung 1" width="600" height="195" /> Abbildung 1 Teil 1 erläutert, wie die OMT-Videobilder zu optimieren. Das Videobild sollte einen klaren Blick auf das beleuchtete Fliege auf einem dunklen schwarzen Hintergrund. Allzu helle Bilder können durch die Reduzierung Hintergrund Störungen, die Verringerung der Intensität der IR-LEDs, oder durch Ausschalten der Raumbeleuchtung verbessert werden. Wenn die Fliege nicht richtig beleuchtet ist, kann die Anpassung der Fokus der IR-LEDs oder die Modulation der Intensität der IR-LEDs das Problem zu beheben. Die Teile 2 und 3 beschreiben einfache Experimente durchzuführen, um den ordnungsgemäßen Betrieb eines OMT zu überprüfen. In allen Fällen sollte eine Fliege visuell &quot;gezwungen&quot; werden (via optomotorischen Antworten), um mehrere Umdrehungen in der Arena zu drehen, um eine reibungslose und vollständige Beweglichkeit zu gewährleisten. In Teil 2 eine Fliege ist gefordert, einen Geruch Feder auf seinen eigenen finden. Um die Fliege in dem Experiment beteiligt zu halten, um die Wirkung von Restgeruch Freisetzung zu reduzieren und fliegt von Pflege eine einzige Position während des gesamten Versuchs zu halten, ist es sinnvoll, optisch drehen die Fliege für ein paar Sekunden zwischen den Versuchen. Eine Fliege sollte nie lokalisiert eine Wasserdampf-Fahne zu einem erheblichen Grad, und sollte immer einen Geruch zu lokalisieren plume in die Gegenwart reichen Panorama visuelle Hinweise. In Teil 3 eine Fliege ist visuell direkt in einen Duft plume gezerrt und aufgefordert, seine Position innerhalb der Rauchfahne gegen eine Vielzahl von stationären visuellen Hintergrund zu halten. Wenn die Fliege in eine Wasserdampf-Fahne gezogen wird, sollte es schnell abwenden. Wenn die Fliege in einen Geruch Fahne gezogen wird, und es gibt genügend visuelle Hinweise, um robuste Tracking zu vermitteln, wird das Haar in der Wolke verbleiben.

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J Exp Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J Neurosci Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>G&#246;tz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Course-control,+metabolism+and+wing+interference+during+ultralong+tethered+flight+in+Drosophila+melanogaster.">Course-control, metabolism and wing interference during ultralong tethered flight in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 128, 35-46 (1987).</li></ol>

Die Bildaufnahme für dieses System nutzt eine günstige firewire board Kamera und Software in Matlab geschrieben. Klare Bilder sind von entscheidender Bedeutung für den Erhalt von genauen Daten Spuren. Die oben beschriebenen Strategien sind nützlich für die Reinigung Bilder in diesem System. Andere Video-Tracking-Verfahren für dieses System wurden 1 beschrieben. Darüber hinaus könnte das System leicht modifiziert, um Echtzeit-Video-Tracking erweitert werden. Das Beispiel experimentelle Protokolle hier ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Firewire camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1394store.com</td>
<td>Fire-I board camera BW</td>
<td>4.3mm lens no IR coating</td>
</tr>
<tr>
<td>IR LEDs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Black spray paint</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rustoleum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Flat black</td>
</tr>
<tr>
<td>Black flock paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edmund Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Panel system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3</td>
</tr>
<tr>
<td>Matlab 2006a</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Image acquisition toolbox</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visually mediated odor tracking during flight in drosophila

Fliegende Insekten benutzen visuelle Hinweise, um ihre Position in einem Wind-Strom zu stabilisieren. Viele Tiere zusätzlich track Gerüche in den Wind. Als solche visuellen Stabilisierung der Wind Tracking direkt Hilfen in Geruch Tracking-Systems. Aber olfaktorischen Signale direkt beeinflussen visuelle Nachverfolgung Verhalten unabhängig von Wind cues? Darüber hinaus haben die jüngsten Fortschritte in der olfaktorischen Molekulargenetik und Neurophysiologie Roman quantitative Verhaltensanalysen motiviert, das Verhalten Einfluss von (zB) genetisch inaktiviert spezifischen olfaktorischen Aktivierung Schaltungen zu beurteilen. Wir modifizierten ein magnetisches Tether System ursprünglich für Vision Experimente durch die Ausrüstung der Arena mit schmalen Laminar-Flow-Geruch Federn entwickelt. Hier haben wir auf Experimenten, die durchgeführt werden, nachdem eine Fliege angebunden werden und kann in der Lage, in der magnetischen Arena navigieren zu konzentrieren. Wir zeigen, wie man Video-Bilder für Messkörper Winkel optimiert, wie man Stallgeruch Tracking Richter zu erwerben, und wir zeigen zwei Versuche, um den Einfluss von visuellen Hinweisen auf den Geruch Tracking zu untersuchen.

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Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Hier beschreiben wir, wie Sie die erworbenen Video-Bild für eine olfaktorische magnetisch-Leine (OMT) Geräte zu optimieren. Wir beschreiben auch zwei Beispiele für experimentelle Protokolle für die Untersuchung visuell-olfaktorischen Fusion.

Visuell vermittelte Odor-Tracking während des Fluges in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

visually-mediated-odor-tracking-during-flight-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Hier beschreiben wir, wie Sie die erworbenen Video-Bild für eine olfaktorische magnetisch-Leine (OMT) Geräte zu optimieren. Wir beschreiben auch zwei Beispiele für experimentelle Protokolle für die Untersuchung visuell-olfaktorischen Fusion.

Serie: Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Forschung

Biologie

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

A Magnetic Tether System zur visuellen und olfaktorischen Mediated Flight Control in Drosophila Untersuchen

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...