Wir sind dankbar, S. Arber für die mGFP Mäusen und an die Mitglieder des Zervas Labor, die kritisch die Zeitung lesen und leistete technische Hilfe. A. Brown wurde von einem Brain Science Kaplan Sommer Graduate Research Award unterstützt. E. Normand wurde von einem Brain Science Program Graduate Research Award unterstützt. Diese Arbeit wurde auch von Startup-Forschungsmittel (MZ) finanziert.

Tamoxifen Vorbereitung und orale Gabe Procedure (E8.5) <ul><li> Bereiten Sie eine 20 mg / ml Stammlösung von Tamoxifen durch Auflösen von Tamoxifen in vorgewärmte Maisöl. </li><li> Inkubieren Sie die Lösung bei 37 ° C für 2 Stunden auf einem Kolbenpendel und Wirbel intermittierend. </li><li> Schützen Sie die Tamoxifen Lager vor Licht, Lagerung bei 4 ° C, und die Verwendung von bis zu 1 Monat. </li><li> Für das Schicksal Mapping-Experimente, stellen Sie eine Zucht Paar bestehend aus einem Swiss Webster weiblich (Wildtyp; gekauft Taconic) und ein Männchen, sowohl ein Gen spezifischen Creer T-Allel und ein Reporter-Allels. Zu Demonstrationszwecken haben wir mit Wnt1-créer T; mGFP Männer (Ellisor 2009). </li><li> Überprüfen Swiss Webster Frauen jeden Morgen für das Auftreten eines Vaginalpfropfes. Bestimmen Sie den Morgen (0900) des Tages ein Vaginalpfropf als 0,5 Tage post-Koitus zu sehen ist und berechnen Sie das Datum der Tamoxifen-Administration auf diesem Ausgangspunkt basiert. (Für dieses Experiment embryonalen Tag 8.5 verwendet wurde). </li><li> Verwenden Sie eine 1 ml Spritze mit einer Tierfütterung Nadel (20G x 1-1/2) zu erarbeiten 200 ul der Tamoxifen-Stammlösung (4 mg Tamoxifen). </li><li> Fest begrenze die Zeit schwanger Swiss Webster Weibchen durch Ergreifen der Nacken und Rücken, den Kopf fixieren und umdrehen, so dass die Bauchseite nach oben zeigt. </li><li> Halten Sie den Schwanz zwischen die Finger frei, um den Körper in einer geraden Linie zu halten. </li><li> Legen Sie die Fütterung Nadel in den Mundwinkel und sanft in die Nadel auf dem Dach des Mundes. </li><li> Drehen Sie die Nadel so, dass es parallel zum Körper ist, während gleichzeitig Kippen der Kopf nach hinten um den Hals gerade zu halten. </li><li> Führen Sie die Nadel durch die Speiseröhre in Richtung Magen. Achten Sie darauf, nicht in die Luftröhre gelangen. Wenn es Widerstand an der Nadel, das Tier Würgereflex eingreift, oder ob die Maus Kämpfe umgehend entfernen Sie die Nadel und versuchen, die Sonde wieder. </li><li> Sobald die Fütterung Nadel in den Bauch, die Verwaltung der Tamoxifen in den Magen und gibt die Frau zu Hause Käfig bis zum Zeitpunkt der Dissektion. </li></ul> Kraniotomie: <ul><li> Intrakardial perfuse der erwachsenen Schicksal abgebildet Maus mit 4% PFA und entfernen Sie den Kopf mit einer Schere durch einen Schnitt durch die Wirbelsäule gerade über die Schultern. </li><li> Run mit einem Skalpell entlang der dorsalen Mittellinie des Kopfes (rostral nach kaudal), um durch die Kopfhaut geschnitten und setzen den Schädel. </li><li> Mit dem Skalpell schaben überschüssiges Gewebe oder Muskel an der Seite und hinteren Teil des Schädels. </li><li> Mit Pinzette, Punktion des Schädels an der Mittellinie nur rostral der Riechkolben und ein kleines Loch in die Spitzen der feinen Schere unterzubringen. </li><li> Legen Sie die feinen Schere in dieses Loch und einen Einschnitt medial nach lateral etwa die Länge der Riechkolben. Dieser Schnitt wird der Schädel an der Kreuzung der nasalen Knochen und Stirnbeins brechen und bieten einen guten Zugang zur Schere. </li><li> Schneiden Sie entlang der Pfeilnaht in den Schädel (dorsalen Mittellinie) Achte darauf, die Schere Tipps vom Gehirn, um eine Beschädigung des darunter liegenden Gewebes Winkel zu halten. </li><li> Fassen Sie den Schädel mit einer Pinzette und abziehen des Knochens entlang der medialen Einschnitt in das Gehirn freizulegen. Der Schädel kann abplatzen in kleine Stücke schneiden oder brechen weg in größere Abschnitte. Fahren Sie mit der Pinzette auf alle frontal, parietal, interparietalen und occipitale zu entfernen. </li><li> Crack the Knochen einschließen des paraflocculi (befindet sich entlang der Seitenkanten des Gehirns auf der Ebene des Kleinhirns) durch Kneifen der sphärischen Knochen auf jeder Seite. Ziehen Sie sich die Knochen. </li><li> Drehen Sie den Kopf auf den Kopf (dorsal Seite nach unten) und die Verwendung der Zange auf die Hirnnerven sever und lassen das Gehirn aus dem Schädel. </li></ul> Ganze Berge Mikroskopie: erwachsenen Gehirn <ul><li> Beurteilen erwachsenen Gehirn für GFP Markierung mit einem fluoreszierenden Binokular. </li><li> Transfer Gehirn eine Petrischale mit PBS und fotografieren mit PictureFrame oder andere geeignete Software. </li></ul> Ganze Berge Mikroskopie: E12.5 Embryos <ul><li> Beurteilen whole mount Embryonen für GFP Markierung mit einem fluoreszierenden Binokular. </li><li> Übertragen Sie diese, dass GFP positive durch whole mount in eine Petrischale mit PBS und fotografieren mit PictureFrame oder andere geeignete Software. </li><li> Verwenden einer Pinzette zu kneifen Sie ein kleines Stück des Schwanzes von jedem Embryo, statt jedes Stück in einem PCR-Röhrchen und Genotyp des Gewebes mit Hilfe der PCR (Ellisor 2009) für beide Allele, um Ergebnisse über ganze Berg Analyse gesehen zu bestätigen. </li></ul> Micro-Dissektion und Explantation Vorbereitung des ventralen Mittelhirns von E12.5 Embryonen <ul><li> Nach Dissektion der uterinen Kette und identification des Schicksals-mapped Embryonen durch ganz-mount Fluoreszenz-Embryonen zu eiskalten sterilen PBS in einer Zellkulturschale. </li><li> Mit einer feinen Schere, entfernen Sie das Kopfteil des Embryos Schneiden quer, kaudal Rhombomer 1. </li><li> Dann entfernen Sie den rostralen Teil des Kopfes mit einem koronalen Schnitt durch das Zwischenhirn. Dies legt ein Rohr-ähnliche Struktur, in der der 4. Ventrikel durch die mesenzephalen Vesikel bilden ein Bindeglied zwischen dorsalen und ventralen Gewebe. </li><li> Schieben Sie die Schere Tipps in den 4. Ventrikel und snip entlang der dorsalen Mittellinie, kaudal rostral, die vollständige Öffnung der Röhre, die Schaffung eines &quot;open-book&quot; Vorbereitung. Die ventralen Mittelhirn wird nun medial ausgesetzt werden, während die beiden dorsalen Hälften des Mittelhirns seitlich befinden wird. </li><li> Entfernen Sie alle verbleibenden nicht-neuronalen Gewebe unterhalb des ventralen Mittelhirns, damit das Gewebe um mehr flach legen. Wenn nötig, machen Kerben in den rostralen und kaudalen Aspekte, so dass die dorsale &quot;Flügel&quot; der Explantation wird flach als auch. Das Explantat sollte nun ein &quot;Schmetterling, in denen die dorsalen Mittelhirn stellt die Flügel, und Rhombomer 1 den Schwanz ähneln. </li><li> Zur weiteren Isolierung des ventralen Mittelhirns für FACS-Analyse oder Zellkultur-Experimenten, entfernen Sie die seitliche (dorsal) des Gewebes. </li></ul> Repräsentative Ergebnisse: In diesem GIFM Experiment werden Wnt1-exprimierenden Zellen dauerhaft und heritably während der Embryogenese durch die Gabe von Tamoxifen bei E8.5 zu Wnt1-CreERT markiert; mGFP Embryonen. Anschließend werden diese markierten Zellen visualisiert via ganze Berg Fluoreszenz und Abschnitt Immunhistochemie zu bestimmen, wie Wnt1-abgeleiteten Zellen zu neuralen Strukturen beitragen über die Entwicklung. Whole mount Fluoreszenz beruht auf der Membran gebundene GFP-Komponente des mGFP Reporter und bietet somit zelluläre Informationen sowie eine übergreifende Sicht auf Wnt1-derived neuronalen Projektionen. Zum Beispiel mit Tamoxifen Verwaltung an E8.5, Wnt1-CreERTmGFP Embryonen bei E12.5 zeigen GFP-Fluoreszenz in erster Linie im Mittelhirn, posterior Hinterhirn und Rückenmark (Abbildung 1A). Bei hoher Vergrößerung sind feine neuronalen Projektionen zu sehen innervieren das Mittelhirn, Körper Wand, des Körpers, und kraniofaziale Region. In diesem Entwicklungsstadium ist der Embryo durchsichtig und internen GFP Kennzeichnung ist leicht zu erkennen. Doch wie das Gehirn entwickelt, verschleiert die Dichte von reifem Gewebe GFP-Fluoreszenz aus internen Hirnstrukturen. Deshalb mit Tamoxifen Verwaltung an E8.5, ist nur geringe GFP-Markierungen in der überlegenen colliculi der Erwachsenen durch whole mount-Fluoreszenz (Abbildung 1C, Einschub) beobachtet. Darüber hinaus sind einige axonale Projektionen zu sehen Coursing entlang der ventralen Oberfläche des Rautenhirn (nicht dargestellt). Im Gegensatz dazu, wenn Tamoxifen bei E9.5 verabreicht wird, tritt erhebliche GFP-Markierungen in der gesamten unteren Vierhügel (Abb. 1B, Einschub). Dieser Anstieg der ganze Berg Fluoreszenz kann darauf hindeuten, dass Wnt1-exprimierenden Zellen an E9.5 mehr wesentlich zur oberflächlichen Regionen der dorsalen Mittelhirn oder zu erweitern mehr Prozesse in dieser Region als Wnt1 exprimierenden Zellen aus E8.5. Egal, spiegelt dieser Unterschied in whole mount Fluoreszenz der dynamischen Natur der Wnt1 Expression während der Entwicklung und zeigt, wie GIFM verwendet werden, um unterschiedliche Zellpopulationen aus dem Embryo folgen in den reifen Erwachsenen werden. Mit Immunhistochemie, Schicksal abgebildet Gewebeschnitte von Wnt1-CreERT; mGFP Tiere sind auf zellulärer Ebene analysiert. Antikörper gegen GFP und β-Galactosidase (β-gal) in Verbindung mit einer Vielzahl von Gewebe spezifische Biomarker verwendet werden, um die feinen Skala zellulären Beitrag der Wnt1 Linie auf neuronale Strukturen und Zelltypen zu bestimmen. Mit Tamoxifen Verwaltung an E8.5 und Gewebe-Analyse bei E12.5-, Doppel-positive Zellen (GFP + und β-gal +) sind über das Mittelhirn und Hinterhirn mit Projektionen Coursing durch die ventrale Mittelhirn (Abbildung 1B) beobachtet. Im erwachsenen Gehirn, gibt der Wnt1-Linie bei E8.5 deutlichen Anstieg zu vielen Mittelhirn Strukturen einschließlich der oberen und unteren Colliculi sowie in der Nähe von dopaminergen Zellpopulationen des ventralen Tegmentum und der Substantia nigra (1D) (siehe Auch Zervas 2004). Im Gegensatz dazu gibt die Wnt1-Linie bei E9.5 deutlichen Anstieg um minderwertige colliculi sowie Neuronen in der Nähe von dopaminergen Zellpopulationen (Abb. 1F). <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 repräsentative Ergebnisse für Wnt1-Schicksal-Mapping.: Beispiele für Ganzkörper-Halterung und Immunzytochemie Ergebnisse in Wnt1-CreERT; mGFP Embryonen und erwachsenen Gehirn Schicksal abgebildet (markiert) an E8.5 (AD)und E9.5 (EF). A. Wnt 1-Creer; mGFP Embryonen bei E12.5 zeigen GFP-Fluoreszenz in erster Linie im Mittelhirn (Mb), posterior Hinterhirn (Hb) und des Rückenmarks (Sp). B. Markierte Zellen visualisiert und analysiert werden auf zellulärer Ebene durch Immunhistochemie wie auf dieser 1-mu m dicken optischen Schnitt (40fach Objektiv, z-series-Akquisition) gezeigt. Nuclear β-Galactosidase (nβ-gal) Antikörpermarkierung (rot) und GFP Antikörpermarkierung (grün) zeigt das Schicksal-mapped Zellen im ventralen Mittelhirn gezeigt. Hier werden rekombinierten Zellen doppelt positiven (nβ-gal + / GFP +) wegen der Art der bedingten mGFP Reporter. C. Whole-mount florescence Mikroskopie zeigt schwache GFP-Fluoreszenz in den Superior Colliculus (SC) der erwachsenen (kleines Bild). Die Beurteilung der Wnt1 Linie an E8.5 an adulten gekennzeichneten Felder mit geringer Vergrößerung (5x)-Mikroskopie zeigt, dass die Wnt1 Linie Anlass zu Mittelhirn Strukturen einschließlich der superior (SC) und inferior (IC) Colliculi (C). D. A 40x, 1 mm optischer Schnitt aus dem ventralen Mittelhirn in der Nähe von dopaminergen Neuronen mit nβ-gal +-Zellen und eine reiche GFP + axonalen Plexus entnommen. E. Markierung an E9.5 Ergebnisse in wesentlichen GFP-Markierungen, die leicht in den Colliculus inferior des Mittelhirns durch whole mount Fluoreszenz (kleines Bild) zu beobachten ist. Die Wnt1 Linie an E9.5 an adulten Abschnitte (β-gal +, rot) markiert ist im Colliculus inferior (dorsal-posterior Mittelhirn) konzentriert wie bei geringer Vergrößerung (5x)-Mikroskopie (E) zu sehen. F. A 40x, 1 mm optischer Schnitt aus dem ventralen Mittelhirn in der Nähe von dopaminergen Neuronen mit nβ-gal +-Zellen und eine reiche GFP + axonalen Plexus entnommen. Wnt1-derived Neuronen an E8.5 E9.5 Vergleich gekennzeichnet sind, schrittweise von ihrem Beitrag zur dorsalen Mittelhirn beschränkt, während die Wnt1 Linie weiterhin einen Beitrag zur ventralen Mittelhirn.

<ol>
	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

Alle Autoren trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit und sind alphabetisch aufgelistet. Der Beitrag jedes einzelnen ist offensichtlich durch seine Teilnahme an der Video-Artikel.

Die GIFM System, das wir haben gezeigt, kann ein breites Spektrum von Fragen in einer Vielzahl von zellulären Prozessen zu beantworten. Zum Beispiel können Mäuse mit unterschiedlichen Cre-Treiber entwickelt, verwendet werden, um jeden Zelltyp, Gewebe-oder genetische Linie des Interesses Ziel sein. Darüber hinaus, weil Tamoxifen jederzeit embryonalen oder postnatale Zeitpunkt verabreicht werden kann, kann Rekombination, alle relevanten Entwicklungsstadium ausgerichtet sein. Die räumliche und zeitliche Steuerung dies...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

Fate Karten sind durch Markierung und Verfolgung von Zellen in vivo zu bestimmen, wie Vorläuferzellen zu bestimmten Strukturen und Zelltypen in Entwicklungsländern beitragen und adulten Gewebe erzeugt. Ein Fortschritt in diesem Konzept ist G enetic ich nducible F aß M apping (GIFM), verbindet die Genexpression, Zell-Schicksal, und Zelle Verhaltensweisen in vivo, um das Schicksal Karten auf genetische Abstammung zu erstellen. GIFM nutzt X-créer Linien, in denen X ist ein Gen oder eine Gruppe von Gen-regulatorischen Elementen, die räumliche Ausdruck eines veränderten Bakteriophagenprotein, Cre-Rekombinase (Creer T) verleiht. Creer T enthält eine geänderte e strogen r eceptor Ligandenbindungsdomäne die Creer T macht sequestriert im Zytoplasma in Abwesenheit des Medikaments Tamoxifen. Die Bindung von Tamoxifen Releases Creer T, die in den Zellkern und vermittelt Rekombination zwischen DNA-Sequenzen von loxP-Stellen flankiert transloziert. In GIFM, Rekombination tritt typischerweise zwischen einem loxP flankiert Stop-Kassette vor einem Reportergen wie GFP. Mäuse gezüchtet werden, um entweder eine Region-oder Zelltyp-spezifische créer und eine bedingte Reporter Allel enthalten. Unbehandelte Mäuse müssen nicht markiert, da die Stop-Kassette in den Reporter verhindert die weitere Transkription des Reportergens. Wir verwalten Tamoxifen durch orale Gabe zu timed-trächtige Weibchen, die zeitliche Steuerung der Creer T Freisetzung und die anschließende Translokation in den Zellkern Entfernen der Stop-Kassette aus dem Reporter bietet. Nach Rekombination ist die Reporter-Allels konstitutiv und heritably ausgedrückt. Die Veranstaltungsreihe markiert Zellen, so dass ihre genetische Geschichte unauslöschlich wird aufgezeichnet. Die rekombiniert Reporter dient somit als High-Fidelity-genetische Abstammung Tracer, der, einmal auf, von der Gen-Expression zunächst zur Creer T-Laufwerk entkoppelt ist. Wir wenden GIFM in der Maus eine normale Entwicklung und ermitteln den Beitrag der genetischen Abstammungslinien zu erwachsenen Zelltypen und Geweben zu untersuchen. Wir verwenden auch GIFM auf Zellen mutierten genetischen Hintergründen folgen, um ein besseres Verständnis komplexer Phänotypen, die hervorstechenden Merkmale des menschlichen genetischen Erkrankungen imitieren. Dieses Video Artikel führt Forscher durch experimentelle Methoden erfolgreich anzuwenden GIFM. Wir demonstrieren die Methode mit unseren gut charakterisiert Wnt1-créer T; mGFP Mäusen durch die Gabe von Tamoxifen bei embryonalen Tag (E) 8,5 über orale Gabe von dissection bei E12.5 und Analyse von Epifluoreszenz Stereomikroskopie gefolgt. Wir zeigen auch, wie die Mikro-sezieren Schicksal abgebildet Domains für Explantation Vorbereitung oder FACS-Analyse und sezieren Erwachsenen Schicksal-mapped Gehirne für ganze Berg Fluoreszenz-Imaging. Gemeinsam ermöglichen diese Verfahren Forscher auf kritische Fragen in der Entwicklungsbiologie und Krankheitsmodelle Adresse.

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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetische Inducible Fate Mapping (GIFM) markiert und verfolgt Zellen mit feinen räumlichen und zeitlichen Steuerung<em&gt; In vivo</em&gt; Und erläutert, wie sich Zellen aus einer bestimmten genetischen Linie auf die Entwicklung und adulten Geweben beitragen. Hier zeigten die Techniken erforderlich, um das Schicksal Karte E12.5 Mausembryonen für epifluoreszenten und Explantation Analyse.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K Aufrufe.  Brown University. Genetische Inducible Fate Mapping (GIFM) markiert und verfolgt Zellen mit feinen räumlichen und zeitlichen Steuerung In vivo Und erläutert, wie sich Zellen aus einer bestimmten genetischen Linie auf die Entwicklung und adulten Geweben beitragen. Hier zeigten die Techniken erforderlich, um das Schicksal Karte E12.5 Mausembryonen für epifluoreszenten und Explantation Analyse.

Serie: A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

A Magnetic Tether System zur visuellen und olfaktorischen Mediated Flight Control in Drosophila Untersuchen

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

A Practical Guide to Phylogenetics für Nichtexperten

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...