Wir danken Harald Hutter und Helena Decker für die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts. Wir danken auch Reg Sidhu von Leica Microsystems für seine technische Kompetenz. Diese Arbeit wurde von der National Sciences and Engineering Council of Canada, Award # 327100-06, und der Simon Fraser University Faculty of Science unterstützt.

Teil 1: Transfektion von Neuronen mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Gerätesatz-up: Ratte oder Maus Hippocampus-Neuronen sind nach Kaech und Banker, 2006 kultivierte [4]. Die typischen Zelldichte für Transfektionen verwendet beträgt 250.000 cells/6-cm Gericht. Erforderliche Reagenzien und Geräte umfassen 50 mM Kynurensäure, regelmäßige Benchtop Rohrhalter, Tisch-Kühler (am besten Lipofectamine Reagenz kalt zu halten), Lipofectamine Reagenz, MEM, Mikrozentrifugenröhrchen, micropipetters und einer sterilen Pinzette. Vorgehensweise: <ol><li> Für jede Transfektion Label zwei 1,5 ml-Röhrchen, einer der Plasmid-DNA, einer der Transfektionsreagenz enthalten enthalten. Die folgenden Inkubationen können bei Raumtemperatur ablaufen. <ol><li> Kombinieren 1,0 ug von Plasmid-DNA mit 100 ul MEM in einem Röhrchen (ohne Zusätze jeglicher Art; MEM braucht nicht auf eine Temperatur von pH äquilibriert werden). </li><li> Kombinieren 6,0 ul Lipofectamine mit 100 ul MEM in den anderen 1,5 ml Tube. <ol><li> Keine Anpassungen für doppelte Transfektionen benötigt werden, obwohl die Lipofectamine: DNA-Verhältnis in solchen Fällen halbiert werden. Das Verhältnis von Lipofectamine: DNA ist noch innerhalb des Herstellers Vorschlag. Am besten ist es 0,5-1,0 pg für jedes Plasmid-Test für eine optimale Expression. </li><li> Zur Wahrung der Haltbarkeit des Lipofectamine Reagenz, sollte es aus dem Kühlschrank für so kurze Zeit wie möglich entfernt werden und in ein Tisch-Kühler, wenn nicht in Gebrauch ist. Insgesamt benötigte Zeit aus dem Kühlschrank sollte auf ein Minimum reduziert werden. </li></ol></li></ol></li><li> Die Röhrchen für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie die DNA-in-MEM-Lösung in die Lipid-Röhre, und vorsichtig mit Pipette mischen, dann inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 25 Minuten vor Flipping Deckgläser mit 60 ul 50 mM Kynurensäure zu excitoxic Schäden an der Schale von kultivierten Neuronen zu minimieren. <ol><li> Sorgfältig Flip Deckgläser Fuß-side-up mit einer sterilen Pinzette und so zu arrangieren, sie sich nicht überlappen. Achten Sie darauf, das Neuron-beschichteten Oberfläche des Deckglases oder der Glia-beschichtete Oberfläche der Schale kratzen. </li></ol></li><li> Nehmen Sie ca. 0,5 ml Medium aus dem 6-cm-Spiegel und vorsichtig mit DNA-Mix in Rohr, den Transfer der DNA-Lösung zurück in die Schüssel tropft gleichmäßig auf die Oberfläche des Mediums. </li><li> Nicht Wirbel, sondern schieben Sie Teller hin und her in eine Richtung, dann stoppen und wiederholen in senkrechter Richtung zur gleichmäßigen Verteilung der DNA-Lipofectamine Komplexe. Inkubieren für 90 Minuten in der Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Flip Deckgläser Fuß-side-down, und vereinbaren, so dass sie sich nicht überschneiden. Lassen Ausdruck für die gewünschte Zeit vor, in der Regel über Nacht auf 48 Stunden. </li></ol> Teil 2: Live Darstellung von GFP-markierten dichten Kern Vesikel in kultivierten Hippocampus-Neuronen Gerätesatz-up: <ol><li> Imaging lebender Zellen erfordert ein Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera ausgestattet, verwenden wir ein Leica DMI 6000B inversen Mikroskop mit der Leica variable, Leuchtstofflampe ausgestattet. Ebenfalls erforderlich ist ein bildgebendes Kammer mit Temperaturregler und eine objektive Heizung. Wir nutzen die Warner Instruments RC-21BR für einen 18-mm Deckglas darüber hinaus eine Plattform Heizung geändert (Kat. # PH2) und Temperaturregler (Kat. # TC324B). Die Kammer enthält keine offenen Ports, eine Modifikation, enthalten bei der Bestellung der Kammer werden kann. Eine objektive Heizung wird dringend empfohlen, zur Aufrechterhaltung der Temperatur des Deckglases und minimieren Veränderungen im Fokus aufgrund von Temperaturschwankungen. Die Bilder werden mit einem Hamamatsu Orca-ER mit Metamorph (Molecular Devices) Software einschließlich der &quot;Streaming&quot;-Modus des Erwerbs drop-in erworben. Note-Wir verwenden keine der Klimakammer, dass das gesamte Mikroskop umschließt. Dieser Zusatz ist teuer und nicht notwendig für die kurzfristige Bildgebung beschrieben. </li><li> Andere Geräte und Reagenzien sind frisch zubereitet leben Bilderzeugungsmediums (1X Hanks mit Ca 2 + und Mg 2 +, 0,6% Glucose und 10 mM HEPES), zusätzliche 18-mm Deckgläser, sterilen Pinzette, nicht-sterilen Pinzette, Kimwipes, Vakuumfett und einer Spritze (ohne Kanüle oder mit modifizierten breite Injektionsnadel), mit dem Fett gelten. </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Bereiten Sie frische Live-Imaging-Medium (1X Hanks mit Ca 2 + und Mg 2 +, 0,6% Glucose und 10 mM HEPES). Wir bereiten in der Regel zu einem Zeitpunkt und zu speichern 50mls bei 4 o C, wenn nicht in Gebrauch ist. Am besten ist es, genügend vorbereitet für nicht mehr als eine Woche nach dem anderen. Etwa 5-10 ml pro Schale von Neuronen verwendet. </li><li> Starten Mikroskop, Kamera, Leuchtstofflampe, und Bildaufnahme-Software. Auch das Gerät einzuschalten, um die Kammer-Plattform und Ziel-Heizungen. </li><li> Bereiten Sie das vorstelleng Kammer. <ol><li> Die Warner Kammer enthält ein Teflon-Einsatz für die Montage von Deckgläsern. Für eine einfache Handhabung, Kennzeichnung der einen Seite des Einsatzes &quot;top&quot; mit einem Permanent-Marker. </li><li> Tragen Sie einen Ring von Fett in die Nut rund um das Loch in der Seite der Kammer mit der Aufschrift &quot;top&quot;. Vermeiden Sie die Verwendung überschüssiger, wie es die Kammer betreten und reduzieren den beobachtbaren Bereich. </li><li> Mit einer Pinzette, legen einen sauberen, unbenutzten 18-cm Deckglas auf die &quot;top&quot; Seite der Kammer, sanften Druck auf das Deckglas an den Kanten zu einer Abdichtung innerhalb des vertieften Nut der Kammer zu schaffen. </li><li> Schalten Sie die Kammer über und wenden Sie einen ähnlichen Ring von Fett in die Nut auf der gegenüberliegenden (unten) Seite der Kammer. </li><li> Legen Sie die vorbereiteten Kammer-Unterseite nach oben, auf dem Deckel eines 50-ml-Röhrchen, die einen idealen Raum Halter ist. </li><li> Add 750 ul der bildgebenden Medium in die Kammer. Dies ist eine übermäßige Menge, aber das Fett sollte das Medium verhindern das Überlaufen von und die Überschüsse werden zur Vermeidung von Blasen eingeklemmt, wenn die Zelle bedeckt Deckglas aufgebracht wird. </li><li> Pflegen Sie die vorbereitete Kammer in der Gewebekultur-Inkubator bis sie benötigt. Längerer Inkubationen sollten ~ 1 Stunde vermieden werden, da die bildgebenden Medium verdampfen und Änderung der Zusammensetzung werden. </li></ol></li><li> Führen Sie die letzte Kammer Montage-und Live Cell Imaging. <ol><li> Bewegen Sie die vorbereitete Kammer und eine Schüssel mit transfizierten Deckgläser aus dem Inkubator in der Gewebekultur Kapuze. </li><li> Die endgültige Kammeranordnung sollte rasch erfolgen, um sicherzustellen, dass die Zellen in Medium und bei 37 ° C kontinuierlich eingetaucht bleiben. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette vorsichtig entfernen Sie eine Deckglas aus den transfizierten Gericht, berühren den Rand des Deckglases einen Kimwipe sich zu ziehen Wachstumsmedium. </li><li> Legen Sie das Deckglas Neuron-side-down auf die vorbereitete Kammer. Tippen Sie auf eine Seite des Deckglases, um das Fett erste und Druck ausüben um die Ränder der Deckgläschen flach ohne Einschluss von Luftblasen zu bringen. Überschüssiges Imaging Medium austreten, wie erwartet. </li><li> Wischen Sie überschüssiges bildgebenden Medium, aber darauf achten, nicht die Deckgläser aus der Position schieben. </li><li> Bewegen Sie die Kammer auf die vorgewärmten Plattform Heizung und befestigen Sie die Kammer statt. </li><li> Übertragen Sie die Kammer auf die Bühne. </li><li> Zur Reduzierung der Ausbleichung und photoxicity, passen Sie die Lampe mit dem Mindestbetrag von Intensität notwendig, um transfizierte Zellen zu finden. </li><li> Finden Sie eine Zelle von Interesse mit einem niedrigen Vergrößerung Öl-Objektiv (40x). Es ist vorteilhaft, um eine geplante Suchmuster-Stick, um eine maximale Deckglas Abdeckung zu gewährleisten und um redundante Bildaufnahmen, zB oben links Deckglas, Scannen nach oben und unten arbeiten, um das Recht zu vermeiden. </li><li> Wechseln Sie zu einem hohen Vergrößerungen Öl-Objektiv (60-100x) einmal einen gewünschten Bereich gefunden wurde. </li><li> Verwenden Sie &quot;stream Übernahme&quot; oder eine vergleichbare Funktion Ihres Bildbearbeitungs-Software, ein Video von fluoreszenzmarkierten Protein Dynamik aufzuzeichnen. </li><li> Nehmen Sie ein Phasenbild und andere begleitende Bilder (z. B. lösliche GFP) für die spätere Analyse und Präsentation. </li><li> Speichern Sie alle Bilder, bevor Sie das Deckglas weiter und die Aufzeichnung der nächsten Video. </li><li> Typischerweise 3-5 Videos von einem Deckglas wird als erfolgreich angesehen. Phototoxizität und allgemeine Zelle Gesundheit sollte im Auge behalten werden als Transport in geschädigten Zellen reduziert wird. Zell-Gesundheit kann durch Beobachtung mit Phasenmikroskopie überwacht werden. Typischerweise Aufnahmen sind für ca. 30 Minuten pro Deckglas durchgeführt. </li></ol></li></ol> Teil 3: Repräsentative Ergebnisse: Live Cell Imaging Beobachtungen bestehen typischerweise aus Videos (auch als &quot;Stapel&quot; von Bildern bekannt), die Bewegung der Fluoreszenz-markierten Organellen zeigen im Sichtfeld (Abbildung 1A). Begleitende jedem Video werden häufig unterstützende Bilder, die Ausrichtung des Sichtfeldes zeigen in Bezug auf die Zellkörper, Niveau der Proteinexpression und / oder die Gesundheit der Zelle. Videos von Verkehr zu quantitativen Analyse durch Transformation werden kymographs (Abbildung 1B) unterzogen. Kymographs sind Bilder, die Partikelbewegung zeigen in der Gegenüberstellung Linien-Scans, wo jedem Zeitpunkt durch eine Spalte in der Kymographion vertreten ist. Abbildung 2 zeigt, wie zwei Teilchen, die sich in entgegengesetzter Richtung in einem Kymographion vertreten sind. Eine weitere Analyse der kymographs können Informationen über Teilchenstrom, Geschwindigkeit, Auflagenhöhe, Umkehrungen und stationäre Partikel. <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> Abbildung 1. Representative Live Cell Imaging Beobachtungen. (A) Ausgewählte Bilder aus einem Video des mCherry-tagged Tissue Plasminogen Activator (TPA) zu transportieren. Einzelne Teilchen bewegen in der anterograde (grüne Pfeile) und retrograde (rote Pfeile) Richtungen angegeben sind. (B) Kymographs illustrieren TPA-mCherry Bewegung in denAxon. Horizontale Linien in kymographs stellen stationäre Objekte, während diagonale Linien Organellen weg von (positive Steigung) oder in Richtung (negative Steigung) der Zellkörper zu vertreten. Die langen, grünen und roten Pfeile zeigen die Läufe entsprechend der Partikel in (A). Änderungen im Verkehr durch die Mikrotubuli depolymerisierenden Reagenz, Nocodazol, ist auch mit einem Kymographion dargestellt. Beachten Sie die Reduzierung der beweglichen Organellen durch das Fehlen von diagonalen Linien.

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Live Cell Imaging ist eine Herausforderung, aber wirkungsvolle Technik für die direkte Beobachtung von Organellentransports in kultivierten Neuronen. Schwierigkeiten können vor-kommen des Verfahrens mit einer schlechten Neuron Gesundheit, die auf Kultur Komplikationen. Daher sollten Zelle Gesundheit (Beispiele siehe ref. 4) vor und nach der Transfektion durch die Beobachtung der Deckgläser, während in Wachstumsmedium mit einer Gewebekultur Lichtmikroskop beurteilt werden. Der Prozess der Übertragung von Neuron-halt...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

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David Kwinter, Michael Silverman.

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Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

Beobachtung und Charakterisierung dynamischer zellulärer Prozesse liefern wichtige Informationen über die Zellaktivität, die nicht aus statischen Bildern gewonnen werden kann. Vital fluoreszierenden Sonden, besonders grün fluoreszierende Protein (GFP) revolutioniert haben Zellbiologie, die aus der Fähigkeit, spezifische intrazelluläre Kompartimente und zelluläre Strukturen Etikett. Zum Beispiel haben die Live-Darstellung von GFP (und seine spektralen Varianten) Chimären für eine dynamische Analyse des Zytoskeletts, Organellentransports und Membran Dynamik in einer Vielzahl von Organismen und Zelltypen [1-3] erlaubt. Obwohl Live-Bildgebung hat sich verbreitet, dieser Ansatz wirft immer noch viele technische Herausforderungen, vor allem in primären kultivierten Neuronen. Eine Herausforderung ist die Expression von GFP-markierten Proteine ​​in post-mitotischen Neuronen, die andere ist die Fähigkeit, fluoreszierende Bilder zu erfassen bei gleichzeitiger Minimierung der Phototoxizität, Ausbleichen und Wartung allgemein Zelle Gesundheit. Hier bieten wir ein Protokoll, das eine Lipid-basierte Transfektion Methode, die einen relativ niedrigen Transfektionsrate (~ 0,5%) ergibt beschreibt, ist aber ideal für die Abbildung vollständig polarisierte Neuronen. Eine geringe Transfektionseffizienz ist unerlässlich, so dass einzelne Axone und Dendriten im Hinblick auf ihre Orientierung an den Zellkörper charakterisiert werden kann, um die Ausrichtung des Verkehrs, dh anterograde v. retrograde bestätigen. Unser Ansatz zur Bildgebung GFP-exprimierenden Neuronen beruht auf einem Standard-wide-field Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera, Bild-Capture-Software, und ein beheiztes Bildgebung Kammer ausgestattet. Wir haben eine Vielzahl von Organellen oder Strukturen abgebildet werden, zum Beispiel, dense-core Vesikel, Mitochondrien, Wachstum Kegel, und Aktin ohne besondere Optik oder Anregung andere Anforderungen als einer fluoreszierenden Lichtquelle. Darüber hinaus können spektral unterschiedlichen, fluoreszenzmarkierten Proteine, zB GFP und DsRed-markierte Proteine ​​werden in der Nähe gleichzeitig visualisiert werden, um Co-Transport-oder andere koordinierte zelluläre Ereignisse zu charakterisieren. Die Bildgebung hier beschriebene Ansatz ist flexibel für eine Vielzahl von Imaging-Anwendungen und kann durch ein Labor für die relativ geringen Kosten angenommen werden, falls ein Mikroskop zur Verfügung.

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Live Cell Imaging ist von besonderem Nutzen bei der Untersuchung der Dynamik von Organellen Menschenhandel. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Darstellung von Dense-Core-Vesikel in kultivierten Neuronen mit Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll ist flexibel und kann an image anderen Organellen wie Mitochondrien angepasst werden, Endosomen und Peroxisomen.

Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

live-imaging-dense-core-vesicles-primary-cultured-hippocampal

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Aufrufe.  Simon Fraser University. Live Cell Imaging ist von besonderem Nutzen bei der Untersuchung der Dynamik von Organellen Menschenhandel. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Darstellung von Dense-Core-Vesikel in kultivierten Neuronen mit Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll ist flexibel und kann an image anderen Organellen wie Mitochondrien angepasst werden, Endosomen und Peroxisomen.

Serie: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfektion von Neuronen im Hippocampus

Forschung

Biologie

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

Primäre Kultur des Hippocampus-Neuronen von neugeborenen Ratten P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organell-Transport in kultivierten<em&gt; Drosophila</em&gt; Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...