Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse GM096076 vom NIH AREA-Programm unterstützt.

Ein. Vorbereiten Flies für Dissection <ol><li> Anesthetize gesunde Fliegen des gewünschten Genotyps (zum Beispiel Ausdruck einer GFP-markierten Protein), die weniger als eine Woche alt sind. Wählen 10-15 große Weibchen mit abgerundeten cremefarbenen Bauch. </li><li> Übertragen Sie die ausgewählten Fliegen und ein paar (3-5) Männchen in ein Fläschchen mit neuen leicht enthefte Essen und ermöglichen die Fliegen für zwei Tage bei 25 ° C zu mästen Siehe Weil et al. 6 für Details von Drosophila Vorbereitung. Mast die Fliegen sicher, dass eine Vielzahl von Stufen, speziell Stufen 8-12, wird für Bildgebung. Schlecht gemästet oder unfattened fliegt enthalten in der Regel nur sehr frühen Stadien (1-6) und reife (Stufe 14) Oozyten. </li></ol> 2. Vorbereitung der Oozyten for Imaging Mit einem Upright Compound Microscope <ol><li> Bereiten Sie eine Standard-Objektträger aus Glas mit der Anbringung zwei Deckgläschen auf den Objektträger, ca. 1 cm Abstand, mit Silikon greasE. Verwenden Sie nur wenig Fett, um eine gute Abdichtung zwischen dem Deckglas und Rutsche zu gewährleisten. Drücken Sie fest auf jede dem Deckglas wird das Fett dünn und gleichmäßig verteilt. Fügen Sie einige Halocarbonöl 27 (Sigma) an der Verbindungsstelle zwischen den Deckgläsern und Rutsche. Sie werden als Abstandshalter dienen, um zu verhindern verletzt isolierte Eizellen in den nachfolgenden Schritten. Nr. 1,5 Deckgläser funktionieren gut, mit einer durchschnittlichen Dicke (0,16-0,18 mm), die der späten Phase Eizellen übereinstimmt. </li><li> Platz 2-3 Tropfen Halocarbonöl 27 auf der Oberfläche eines Deckglases 22 mm 2. Um die gesündesten Eizellen zu erhalten, wird eine einzelne Frau aus der Lebensmittel-Fläschchen mit Pipettieren mit dem Mund entfernt und vorsichtig hinterlegt in der Halocarbonöl ohne vorher betäubende. </li><li> Mit scharfen Pinzette (wie Dumont # 5), Pin die Fliege gegen die Deckglas und ziehen Sie die Spitze des Bauches. Entfernen der Eierstöcke, indem sie entlang der Oberfläche des Deckglases unter dem Öl. Dies fördert adhesion der Oozyten dem Deckglas. </li><li> Gently necken neben der Eierstöcke, auf der Suche nach Eizellen, die mindestens Stufe 10B des Oogenese sind. Oozyten in dieser Phase kann durch die Suche nach Ei Kammern in dem die Oocyte einnimmt mindestens 50-60% des Gesamtvolumens des Eikammer identifiziert werden. An diesem Punkt in Oogenese haben die Follikelzellen, die über der Oozyte geworden säulenförmig, und umgeben die Oozyte allseitig mit Ausnahme eines kleinen Bereichs, wo Verbindungen mit den Nährzellen bleiben. Verwenden Sie die Pinzette einzelnen Oozyten aus dem Ovariole Mantel zu entfernen. </li><li> Fortzufahren, mit 1-3 Weibchen, bis 5-8 unbeschädigten Oozyten auf dem Deckglas isoliert worden sind. Entfernen Sie alle unbrauchbar Gewebe. </li><li> Vorsichtig invertiert das Deckglas mit den Eizellen auf die vorbereiteten so ein, dass die Eizellen zwischen den beiden Abstandshaltern positioniert sind. Drücken Sie nicht auf den invertierten Deckglas, das die Eizellen beschädigen. Falls erforderlich, fügen Sie eine kleine Menge von Halocarbonöl ter Kanten des &quot;Sandwich&quot;, um den Raum zu gewährleisten gefüllt ist. (Optional:. Lassen slide rest für ein paar Minuten, um zur Beilegung des Deckglases zu ermöglichen) Der Schlitten ist nun bereit für die Bildgebung. </li></ol> 3. Vorbereitung der Oozyten for Imaging Mit einem Inverted Compound Microscope <ol><li> Eizellen werden seziert im Wesentlichen wie in Abschnitt 2 beschrieben, außer dass kleine Petrischalen mit Glasboden Einsatz (MatTek, 35 mm) werden anstelle der Deckgläser verwendet. Es ist nicht notwendig, die Probe zu bedecken, und nach der Sektion, Gewebe können direkt in den Gerichten abgebildet werden, sondern muss darauf geachtet werden, um sicherzustellen, werden die Eizellen bleiben bedeckt mit Öl und dürfen nicht austrocknen. </li></ol> 4. Live-Imaging <ol><li> Bringen Sie eine Eizelle in den Fokus unter Verwendung von DIC oder Phasenkontrast-Optik und untersuchen die Eizelle auf Anzeichen von Schäden, wie Austreten von Zytoplasma oder Vorwölbung der Follikelzellen. Nur Bild Eizellen, die gesund und unbeschädigt erscheinen. </li><li> Streaming kann direkt ohne die Notwendigkeit für GFP-Markierungen überwacht werden, da Dotter Vesikel im Zytoplasma autofluoreszierenden 7 sind. Dieses Signal kann im Bereich von FITC Rahmen erfasst werden aber wahrscheinlich erfordern höhere Verstärkungseinstellungen als die für GFP-markierten Proteinen verwendet. </li><li> Die besten Bilder der Streaming werden aus optischen Schnitte, die knapp unterhalb der Oberfläche der Oocyte, die gegen das Deckglas / Petri Glas aufliegt sind erhalten. Hier die Eizelle ist leicht abgeflacht, so dass für eine bessere Fokusebene. Bilder können bei 200X erfasst werden - 1.000 X. Mit der hier beschriebenen Anordnung, sollte die Luft Ziele verwendet werden, da das Deckglas bildet eine Barriere zwischen der Eizelle und objektiv. Dies ist optimal, weil es stark minimiert Drift und Bewegung der Probe. </li><li> Sobald ein Bereich von Interesse ist im Fokus, schalten Sie die brighfield Optik und wechseln konfokale Bildgebung. Mit der schnellen Scan / Vorschau-Funktion der Software, stellen Sie konzentrieren und gewinnenwie nötig. </li><li> Einstellungen für die Aufnahme wird von Mikroskop zu Mikroskop variieren, aber die allgemeinen Parameter sind wie folgt: Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von ~ 488 nm und einer Emissionswellenlänge von ~ 515 nm. Einrichten Z-Achse erfasst, so dass die Z-Achse konstant bleibt, mit einer Verzögerung von 10 Sekunden zwischen den Frames. Erfassen einer Testsequenz von 5-10 Frames um sicherzustellen der Oozyt stationär ist und der Fokusebene angemessen ist. </li><li> Eine typische Zeitspanne Sequenz zwischen 20 einzufangen - 50 Frames und kann sofort nach Fertigstellung, um die Videoqualität zu beurteilen überprüft werden. Das Verfahren kann für andere Zellen im Schieber wiederholt werden, oder zusätzliche Weibchen können wie erforderlich zerlegt werden. </li></ol> 5. Fehlersuche und häufig auftretende Probleme <ol><li> Drift - Bei Verwendung eines aufrechten Mikroskop, Zellen können manchmal aufgrund der Verbreitung von Öl treiben. Dies kann durch Verwendung nur soviel Öl, um den Bereich unter dem Deckglas abzudecken minimiert werden. Sollten die Probleme fortbestehen, weniger Silikon-gRease anzubringen Abstandshalter auf die Folie. </li></ol> Hinweis: Einige konfokalen Softwarepakete ermöglichen cell tracking, aber im Allgemeinen ist es besser, Bildgebung treiben Eizellen verzichten und stattdessen ein anderes Exemplar. <ol start="2"><li> Keine Anzeichen von Streaming - Wenn Streaming ist nicht ersichtlich, ist es wahrscheinlich auf eine von zwei Ursachen: entweder die Brennebene für die Bilderfassung nicht korrekt ist (in der Regel zu tief in das Innere der Oozyte) oder der Eizelle ist beschädigt. Zeit und Praxis minimieren können sowohl Fehler. </li></ol>

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	<li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis.">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li><li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+Drosophila+oogenesis:+Live+imaging+of+egg+development.">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li><li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ovarian development Drosophila melanogaster. , (1970).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 1-70 (1993).</li><li>Serbus, L. R., Cha, B. -. J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes.">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging.">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).</li><li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes.">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>R&#246;per, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components.">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li><li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+the+ER+and+Exu:+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations.">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li><li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium.">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li></ol>

Ich habe nichts zu offenbaren.

Drosophila Oozyten sind ein vielseitiges Modellsystem für die Bewältigung einer Vielzahl von Fragen im Zusammenhang mit der Funktion und Organisation von Zellen und Zellbestandteilen. Ein vollständiges Verständnis der Funktion von Proteinen erfordert die Überwachung der beiden räumlichen und zeitlichen Aspekte von Protein Verhalten. Advances in beiden bildgebenden Systemen und den genetischen Werkzeuge zur Verfügung, Drosophilists machen es möglich, auch kleine Labors, um hohe Bildqualität Experimente in lebenden Eizellen durchzuführen. Hier skizziere ich ein Protokoll, das Verhalten von GFP-markierten oder autofluoreszierende Proteine ​​und Strukturen während der mittleren bis späten Oogenese, die in Verbindung mit einer Vielzahl von genetischen Hintergründen verwendet werden kann, um Protein-Funktion untersuchen zu analysieren. In diesem Protokoll beschreibe ich den Prozess, durch den Eizellen für die Bildgebung und die grundlegenden konfokalen Einstellungen, die Übernahme von Zeitraffer-Video von fluoreszierenden Proteinen und Strukturen ermöglichen wird vorbereitet sind. Zusätzliche details auf Oozyte Herstellung sind von Weil et al. 6 Eine große Vielzahl von Flug-Stämmen exprimierenden Proteine, die endogen sind über Exon-Trapping markiert sind 8 und unendlich Proteinvarianten können entworfen werden und wieder eingeführt, um Fliegen. In Zusammenarbeit mit lebendem Gewebe, ist die Gesundheit der Proben von größter Bedeutung. Egg Kammern von Stufe 10B Oogenese im Wesentlichen autonom 11 abzuschließen, wodurch sie ideal für kurzfristige Bildgebung. Es muss in mehreren wichtigen Schritte unternommen werden, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten. Beim Präparieren ist es wichtig, Ovarien und Oozyten so wenig wie möglich zu manipulieren, und die Menge an Zeit zwischen Dissektion und der Fertigstellung der Bildgebung zu minimieren. Idealerweise sollte eine kleine Dissektion Sender im gleichen Raum mit dem konfokalen Umfang beherbergt angeordnet sein und nur wenige Kammern Ei zu einem Zeitpunkt abgebildet werden sollte. Die Zahl hier (5-8 empfohlen) Sorgt dafür, dass Dissektion minimiert wird bei gleichzeitiger Maximierung der Wahrscheinlichkeit der Erlangung Bilder von guter Qualität. Ich empfehle Aufnahme eine kurze Serie von Bildern, um die Bildqualität zu beurteilen und bestätigen, dass Capture-Einstellungen optimiert werden, vor der Aufnahme eine längere Zeitspanne Sequenz. Die meisten Software ermöglicht Einzelbildern gespeichert werden, und diese Bilder dann in einer Vielzahl von Wegen mit ImageJ 12 oder andere Software analysiert werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Halocarbonöl 27 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8773-100ML </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF Forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-00 </td><td></td></tr><tr><td> Silikonfett </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z273554-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Glass-bottom Petrischalen </td><td> MatTek </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of gfp-labeled proteins in drosophila oocytes

Die Drosophila Eizelle wurde als vielseitiges System für die Untersuchung grundlegender Fragen wie Zytoskelett-Funktion, Zellorganisation und Organellen Struktur und Funktion etabliert. Die Verfügbarkeit verschiedener GFP-markierten Proteinen bedeutet, dass viele zelluläre Prozesse in lebenden Zellen im Laufe von Minuten oder Stunden, und unter Verwendung dieser Technik überwacht werden können, sind Prozesse wie RNP Transport, epithelialen Morphogenese und Geweberemodellierung sehr ausführlich beschrieben worden in Drosophila Oozyten 1,2. Die Fähigkeit, Video-Bildgebung mit einem reichen Repertoire an Mutanten kombiniert durchführen können eine enorme Vielfalt von Genen und Prozesse in unglaublicher Detail untersucht werden. Ein solches Beispiel ist das Verfahren der ooplasmic Streaming, die in der Mitte der Oogenese 3,4 einleitet. Diese kräftige Bewegung der zytoplasmatischen Vesikeln Mikrotubuli und Kinesin-abhängigen 5 und bietet eine nützliche system für die Untersuchung von Zytoskelett-Funktion in diesen Stadien. Hier stelle ich ein Protokoll für die Zeitspanne Bildgebung von lebenden Eizellen mit praktisch jeder konfokale Mikroskopie Setup.

Imaging von GFP-markierten Proteinen wird davon abhängen, wie stark das markierte Protein exprimiert wird. A Mid-Stage Eizelle Ausdruck Retikulon-like 1 (Rtnl-1), Exon mit GFP 8,9 getaggt produziert starkes Signal. Rtnl-1 scheint co-lokalisieren mit den langen Mikrotubuli, die während ooplasmic Streaming 10 (Abbildung 1A). Rtnl-1 ist ein guter Marker für die Beobachtung Streaming und ist auch ein Indikator der Mikrotubuli Organisation im späten Stadium Oozyten. Ooplasmic Streaming in einem Wildtyp Eikammer ist offensichtlich so stark bemerkbar Bewegung autofluoreszierenden Eigelb Vesikel, wenn ein Capture Rate von einem Frame alle 10 Sekunden (Abbildung 1B). Eine maximale Projektionsfläche von fünf Rahmen erzeugt werden, um den Weg des sich bewegenden Vesikel markieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> Abbildung 1. Live-imaging sowohl autofluorescent und GFP-markierten Strukturen. A) Ein einzelnes Zeitraffer-Bild von einer Stufe 11 Eizelle Ausdruck Rtnl1-GFP bei 400X. Rtnl1-GFP Fasern bewegen sich mit einer wellenförmigen Bewegung in Streaming Oozyten. B) Ein fünf Rahmen maximalen Projektion einer Stufe 10B Eikammer in dem die Vesikel autofluoreszierenden Dotter alle 10 sec abzubildenden für 50 Sekunden insgesamt wurden, bei 400-facher Vergrößerung. Maßstab = 30 um

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Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Ein Protokoll für die Live-Darstellung von GFP-markierten Proteine ​​oder autofluoreszierenden Strukturen in den einzelnen<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten beschrieben.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

11.2K Aufrufe.  Vassar College. Ein Protokoll für die Live-Darstellung von GFP-markierten Proteine ​​oder autofluoreszierenden Strukturen in den einzelnen Drosophila Oozyten beschrieben.

Serie: Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in