Diese Arbeit wurde vom NIH R01 unterstützt NS042228 zu MCH Die Olympus FV1000 konfokalen mit einem NIH gemeinsame Instrumente zu gewähren S10RR023717 der UW Zoologisches Institut (PI Bill Bement) erworben wurde. Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.

1. Versammlung der Injektion Dias und Imaging-Folien Injection Folien: <ol><li> Bereiten Sylgard Silikon-Elastomer gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verwenden Sie die Sylgard zu binden drei Standard-Objektträger aus Glas zusammen durch das Stapeln einer Folie auf der Oberseite der Kreuzung der beiden anderen Folien, die side-by-side angeordnet sind an den langen Kanten. Der Oberschlitten schafft eine rechtwinklige Ecke oder &quot;Mauer&quot; zwischen oben und unten gleitet. </li><li> Lassen Sylgard gesetzt Nacht. Diese Folien sind wiederverwendbar. </li></ol> Imaging slide: <ol><li> Wir verwenden Edelstahl rechteckig zugeschnitten auf die gleiche Größe eines Standard-Glasobjektträger (75mm x 25mm x 1mm), so dass die Kammer passt den Diahalter auf dem Mikroskoptisch. Ein 1,5 cm großes Loch in der Mitte des Rechtecks ​​schneiden. </li><li> Bringen Sie eine 22 mm 2 Deckglas auf das Metall Rechteck mit Sylgard. Verwenden Sie gerade genug Sylgard gründlich Deckglasränder. Um das Bild auf einem inversen Mikroskop wird Embryonen auf dieser Deckglas montiert werden und bebildert von der Unterseite. </li><li> Lassen Sylgard gesetzt Nacht. Diese Folien sind wiederverwendbar und gereinigt mit 70% Ethanol zwischen den Anwendungen. </li></ol> 2. Vorbereitung von DNA-Konstrukten Um auszudrücken, ein Transgen in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise wird das Gen von Interesse hinter einer Zell-spezifische Promotor kloniert. Wir verwenden eine cis-regulatorische Element des Zebrafisch-Gen neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 oder die SOX10 Gen (-4.9sox10) 3 zum Ausdruck in sensorischen Neuronen oder Neuralleistenzellen Laufwerk bzw.. Zur Visualisierung Zelle und Membran Dynamik, drücken wir zytoplasmatische oder Membran-lokalisierte Fluorophore. Um das Bild F-Aktin-Verteilung, drücken wir DNA, die das Calponin Homologie Domäne von Utrophin fusioniert mCherry (UtrCH-mCherry). Die UtrCH-mCherry Biosensor-Sonde ermöglicht die Visualisierung von F-Aktin ohne Beeinträchtigung Aktindynamik 1. Wir erzeugen diese DNA-Konstrukte mit dem Invitrogen Gateway-Rekombination-basierte Klonen Strategie 4 und Vektoren in der Zebrafisch Tol2kit 5 vorgesehen. <ol><li> Generieren Expressionsvektor (s) mit Multisite-Gateway-Technologie und Vektoren aus dem Zebrafisch Tol2kit 5. Plasmide enthalten die TOL2 Rückgrat von pT2KXIGDin. </li><li> Purify Plasmid-DNA mit QIAfilter Plasmid Midi Prep Kit (QIAGEN Inc.) und eluieren in sterilem Wasser. DNA muss nicht zur Injektion linearisiert werden. </li></ol> 3. Die Injektion von DNA-Konstrukten <ol><li> Verdünnen Sie die DNA auf eine Endkonzentration von 10-50 pg / ml DNA in 0,2% Phenolrot (für die Visualisierung während der Injektion) in Wasser. </li><li> Fill und kalibrieren Nadel: Back-füllen gezogen Kapillarnadel mit etwa 1 ul DNA-Lösung und setzen Sie sie in den Nadelhalter des Injektionsgeräts (wir verwenden eine Picospritzer). Mit einer feinen Pinzette, brechen die Spitze vor der Nadel, so dass die Spitze Öffnung ca. 10 mm im Durchmesser ist. Messen Sie den Durchmesser des Tropfens in Mineralöl mit einem Okularmikrometer. Stellen Sie den Druck Dauer Einstellung auf ein Tröpfchen von ca. 1 nl Volumen zu bekommen. </li><li> Sammeln Sie 1-Zell-Stadium Embryos in E3 Embryo Medium (5mm NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0). </li><li> Transfer ca. 30-60 Embryonen zur Injektion schieben und die Position der Embryonen in den rechten Winkel Ecke zwischen der oberen und unteren Folien gebildet. Entfernen Sie die meisten der E3 so, dass die Embryonen, um die Folie durch die Oberflächenspannung gehalten werden. </li><li> Verwenden Sie einen gebogenen Sezieren pin Embryonen zu drehen, so wird die Zelle gegen die Wand der Injektion gleiten. </li><li> Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Nadel durch den Embryo Chorion Führung durch das Eigelb und in die einzelne Zelle des Embryos. Inject 0,5-1 nl DNA-Lösung in die Zelle. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen in Petrischalen in E3 und inkubieren bei 28,5 ° C. Falls erforderlich, kann die Entwicklung durch Inkubieren Embryonen bei einer niedrigeren Temperatur verlangsamt werden. </li></ol> 4. Montage Embryonen für die Bildgebung <ol><li> Entfernen Sie das Chorion von Embryonen mit feinen Pinzetten etwa eine Stunde vor Embryonen die gewünschte Alter für die Bildgebung (ca. 14-17 Stunden nach der Befruchtung für unsere Zwecke) zu erreichen. </li><li> Wählen Embryonen mit markierten Zellen mit einem Binokular mit Fluoreszenz ausgestattet. Wir verwenden ein 4X Objektiv (40-facher Vergrößerung) auf einem Nikon AZ100 Umfang wegen seiner Kombination aus großem Arbeitsabstand und starker Vergrößerung. </li><li> Ein Embryo in eine Mikrozentrifugenröhrchen mit etwa 50 ul E3 mit 0,2% Tricaine Betäubung (Konzentration 10X). </li><li> Add 500 ul 1% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in E3 mit 10 mM HEPES (gehalten bei 42 ° C), Verdünnung der Tricaine bis zu einer Endkonzentration von 0,02%. </li><li> Sofortüberweisung der Embryo in einem Agarose-Drop auf dieDeckglas der bildgebenden Dia mit einer breiten Bohrung Glaspipette. </li><li> Bevor die Agarose erhärtet, Position des Embryos, so dass die Region mit markierten Zellen nach unten gegen den Boden Deckglas (dorsal unten für Neuralleistenzellen und dorsolateral bis zum Rückenmark sensorischen Neuronen). </li><li> Montieren Bildgebung Kammer: Coat eine Seite eines Kunststoff-Ring (2 cm Außendurchmesser, 3 mm hoch) mit Silikon Vakuumfett und bringen das Metall Bildgebung gleiten. Coat auf der anderen Seite des Rings mit Fett. </li><li> Füllen Sie die Kammer mit E3 mit 10 mM HEPES und 0,02% Tricaine. Seal der Kammer oben durch die Anbringung eines 22 mm 2 Deckglas nach oben gefettete Oberfläche des Ringes. </li></ol> 5. 4D-Bildgebung von Zell-Verhalten auf dem Olymp FV1000 konfokalen Mikroskop mit IX81 Die Details der Bildaufnahme wird auf die Besonderheiten Ihres Mikroskop-System ab. Hier beschreiben wir die Zeitraffer-Übernahme-Prozess für die Olympus FV1000 konfokalen Mikroskop. Siehe vorherige JoVE Protokoll für Zeitraffer-Aufnahme mit dem Zeiss LSM 510 konfokalen System 6. <ol><li> Legen Sie die Imaging-Kammer in den Diahalter auf dem Mikroskoptisch und konzentrieren sich auf den Embryo mit einem 10X oder 20X Ziel unter Durchlicht. </li><li> Wechseln Sie zu einem 60X Objektiv (NA von 1,2 oder höher) und konzentrieren sich auf markierten Zelle mit Epifluoreszenz. Wir verwenden entweder eine Öl-Immersion (UPLSAPO 60xO NA 1,35) oder Eintauchen in Wasser (UPLSAPO 60xW NA 1,20) Objektiv. </li><li> In der FV-Software (Version 1.7c), auf XY zu wiederholen, um Laser-Scanning zu beginnen. </li><li> Passen Erwerb Einstellungen und Bildaufnahme Kontrollen (Laserleistung, Scan-Geschwindigkeit, HV, Verstärkung und Offset-Werte) zu signalisieren, zu optimieren und dabei Laserleistung auf ein Minimum (25% oder niedriger) zu Gewebeschäden zu verhindern und zu reduzieren Ausbleichen. </li><li> Zum Erwerb einer Z-Serie, stellen Sie den oberen und unteren Grenzen der z-Stack, zusammen mit Schrittweite. Sicherstellen, dass die Tiefe Symbol so engagiert, dass die XY Sweep icon XY und Z hervorgehoben hat. Erfassung starten, indem Sie die XYZ-Sweep-Symbol. </li><li> Zum Erwerb einer Zeitraffer-Serie, das Zeitintervall und Anzahl von Zeitpunkten unter dem TimeScan Rubrik der Übernahme Fenster Einstellungen. Klicken Sie auf das Icon in der Zeit Image Acquisition Control Window, so dass die XY Sweep icon XY (Z) und T hervorgehoben hat. Starten Übernahme durch Klicken auf die XY (Z) T Sweep-Symbol. </li><li> Alternativ kann die TimeController verwendet werden, um die Einrichtung eines Zeitraffer werden. Diese Programmierung ist nützlich bei der Generierung großer Datenmengen, wie sie nicht mehr als Speicherzuweisung. Unter Gerät öffnen TimeController Fenster. Erstellen Sie eine neue Imaging Task. Das Bild-Parameter-Fenster wird geöffnet. Klicken Sie auf den FV Status, um Erwerb Einstellungen zu aktualisieren. Stellen Sie sicher, Speichern und Löschen sind unter der Überschrift Terminate überprüft. Set Ausgang Dateinamen ein und klicken auf OK, um die Einstellungen zu speichern und das Fenster schließen. Verwenden Sie die Loop-Funktion, um das gewünschte Zeitintervall und Anzahl der Zeitpunkte festgelegt. Klicken Sie auf Fertig und Start der Akquisition zu beginnen. Die Pause und Z-Shift-Funktion kann verwendet werden, um während Bildgebung konzentrieren werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Die Figuren und Filme zeigen Beispiele von sensorischen Neuronen und Neuralleistenzellen mit Membran-gezielte Fluorophore oder die Aktin-Biosensor-Sonde markiert. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 Konfokale Bilder (z-Projektionen) einer Tg (ngn1: gfp-CAAX). Transgenen Embryos mit 25 injiziert pg ngn1: mCherry-CAAX DNA. Die mCherry-CAAX Etiketten ein Neuron rot (A) in einem Hintergrund mit allen Rohon-Beard sensorischen Neuronen gekennzeichnet grün (B). C) zusammengefügte Bild der beiden grünen und roten Kanälen. Balken = 50 um. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 Confocal z-Projektionen von Neuronen in Embryonen mit ~ 20 pg ngn1 injiziert:.. MCherry-UtrCH DNA A) Rohon-Beard sensorischen Neurons in 16,5 hpf Embryo. F-Aktin-Signal wird in das Wachstum Kegel (Pfeilspitzen) und in Vorsprüngen entlang neugebildeten Axone stark. B) Neuron in 20 hpf Embryo starke F-Aktin-Signal zeigt in Wachstum Kegel von verzweigten peripheren Axon (Pfeilspitzen) und schwächeres Signal in reiferen zentralen Axone (Pfeile). Balken = 50 um.

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

Die optimale Konzentration der injizierten DNA variiert je nach Größe und Stärke der Promotor-Konstrukt und sollten empirisch ermittelt werden. Die Injektion von zu viel DNA kann zu ungesunden Embryonen mit umfangreichen Zelltod führen, während zu wenig in einem sehr kleinen Teil der injizierten Embryonen exprimieren das Transgen führen wird. Die DNA-Expression korreliert mit der Stärke des Fluorophor-Signal, das von Zelle zu Zelle variiert. Während Sortierung Embryonen unter Epifluoreszenz, schließen diejenige...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

Der Zebrafisch ist ein ideales Modell für die Bildgebung Zelle Verhaltensweisen während der Entwicklung in vivo. Zebrafisch-Embryos werden extern befruchtet und damit leicht zugänglich in allen Phasen der Entwicklung. Darüber hinaus ermöglicht die optische Klarheit hochauflösende Bildgebung von Zell-und molekulare Dynamik in die natürliche Umgebung des intakten Embryo. Wir sind mit einem Live-Imaging-Ansatz zur Zelle Verhalten während Neuralleiste Zellmigration und das Auswachsen und Führung des neuronalen Axonen zu analysieren. Live-Bildgebung ist besonders hilfreich für das Verständnis der Mechanismen, die Zellbewegung Prozesse regulieren. Zur Visualisierung Details der Zellbewegung, wie protrusive Aktivität und Molekulardynamik, ist es vorteilhaft, einzelne Zellen markieren. In Zebrafisch, ergibt Plasmid-DNA Injektion eine vorübergehende Mosaik Expressionsmuster und bietet deutliche Vorteile gegenüber anderen Zellmarkierung Methoden. Zum Beispiel, transgenen Linien oft label gesamten Zellpopulationen und damit kann die Visualisierung der feinen Vorsprünge (oder Veränderungen in der molekularen Verteilung) in einer einzelnen Zelle im Dunkeln. Darüber hinaus ist die Injektion von DNA in der Ein-Zell-Stadium weniger invasiv und präziser als Farbstoff Injektionen in späteren Phasen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von einzelnen Entwicklungsländern Neuronen oder Neuralleistenzellen und Imaging ihr Verhalten in vivo. Wir injizieren Plasmid-DNA in 1-Zell-Stadium Embryonen, die in Mosaik Transgenexpression Ergebnisse. Die Vektoren enthalten Zell-spezifische Promotoren, fahren die Expression eines Gens von Interesse in einer Untergruppe von sensorischen Neuronen oder Neuralleistenzellen. Wir geben Beispiele von Zellen mit Membran gezielt GFP oder mit einem Biosensor-Sonde, die Visualisierung von F-Aktin ermöglicht in lebenden Zellen mit 1 bezeichnet. Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

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Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

live-imaging-cell-motility-actin-cytoskeleton-individual-neurons

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Aufrufe.  University of Wisconsin-Madison. Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Serie: Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...