Die Autoren möchten die Montpellier Rio Imaging (MRI)-Plattform, wo die Übernahmen wurden durchgeführt, zu bestätigen. Sie danken Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot und Virginie Georget für ihre Hilfe in verschiedenen Teilen des Protokolls. Diese Arbeit wurde von der Fondation la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745) unterstützt gießen.

Alle Tier-Verfahren in diesem Protokoll sind die strikte Einhaltung der Richtlinien der Richtlinie vom 24. November 1986 (86-609/EEC) European Community Council. Haus die Mäuse in der Gruppe, so dass Nahrung und Wasser ad libitum. Pflegen sie in einer kontrollierten Umgebung (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% Luftfeuchtigkeit) mit einem 12 Std.: 12 h Licht: Dunkel-Zyklus (Licht an um 7.00 Uhr). 1 Kultur von murinen Primärzellen:. Embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) <ol><li> Autoklav dünnen Pinzette sowie gebogene Pinzette und Schere sezieren. Bewahren Sie in einem sterilen Behälter. Sterile D-PBS (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung). Vorbereitung abgeschlossen MEFs Medium: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / F12 mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), 1 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,5 mM 2-Mercaptoethanol ergänzt und warm bei 37 ° C </li><li> Euthanize eine schwangere Maus (13,5 Tage nach coitum (dpc)), Durch zervikale Dislokation. Entfernen Sie die Gebärmutterhörner von der Maus mit 90% EtOH desinfiziert. Unter einer sterilen Haube und sauber, legen die Hörner mit den Embryonen in 37 ° C vorgewärmt D-PBS. Die Hörner, Ort öffnen die Embryonen in einem 100 mm sterile Kunststoffpetrischale, reinigen Sie sie aus der Nabelschnur Material und waschen Sie sie mit warmem D-PBS, um den Blutüber entfernen. Unter einem Fernglas, entfernen des Embryos Gliedmaßen, die inneren Organe und der obere Teil des Kopfes, welche die Gehirn. </li><li> In einer neuen Petrischale, die Hackfleisch Embryonen in sehr kleine Stücke mit einer sterilen chirurgischen Klinge Schere oder (zumindest für 1 min). Im Fall von Embryonen verschiedener Genotypen, vorsichtig sein, jeden einzelnen Embryo in Petrischalen gelegt und halten den Schwanz oder die oberen Kopf für die Genotypisierung. </li><li> Bedecken Sie den Embryo mit 1x Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin, 1 mM EDTA). Inkubation für 30 min bis 1 h in einem 37 ° C Inkubator. 10 ml KomplettMEFs mittel-bis Trypsin-Reaktion zu stoppen. Pipette auf und ab, um alle Aggregate zu entfernen. Lassen Sie sich die Zellsuspension in ein 50 ml-Röhrchen (gefüllt mit Komplettmedium) für 10 min zentrifugiert und der Überstand für 5 Min. bei 300 × g bei Raumtemperatur. Das Pellet in Vollmedium (6 ml für 1 Embryo). Lebensfähige kernhaltigen Zellen können mit Trypanblau gezählt werden blau (Etwa 5 x 10 6 Zellen können von einem Embryo zu erwarten). Plate 3 ml pro 60 mm Petrischale. </li><li> Ändern Sie das Medium am nächsten Tag und damit die Zellen wachsen, bis die Gerichte werden konfluent. Viele Zelltypen zu erkennen, sondern nur Fibroblasten Subkultur überleben. </li><li> Teilen Sie die Zellen und es ihnen ermöglichen, in 35 mm-Schalen mit Glasboden (wichtig für Zeitraffer-Experiment) wachsen, bis 50-70% Konfluenz für die Transfektion. Test auf Mykoplasmen und Maus Pathogene. </li></ol> 2. Kultur Adaptations im Fall von Neuronen <ol><li> Am Tag vor der Kultur, Fell 35 mm Glasboden-Petrischalen mit Poly-L-Lysin (200 ul von 0,1 mg / ml) unter einer sterilen Haube und sauber, und lassen Sie über Nacht. </li><li> Am nächsten Morgen gründlich mit sterilem reinem Wasser, zweimal für 5 Minuten und einmal 45 Minuten bis 1 Stunde. Ersetzen mit 2 ml DMEM plus 10% FBS-Medium und halten in einem 37 ° C-Inkubator. </li><li> Dissect Embryonen bei 18,5 dpc. Unter einer sterilen Haube und sauber, legen die Hörner mit den Embryonen in kaltem sterilem HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) in 100 mm Petrischale. Neugeborenen Welpen können auch anstelle von Embryonen, um die Lebensdauer des Dammes zu erhalten, und um weitere Nachkommen zu erzeugen, insbesondere im Falle von transgenen Tieren, die schwierig zu erhalten sein können verwendet werden. In einzelnen Petrischalen, nehmen Sie jede Embryo oder Neugeborenen und schneiden den Kopf mit einer Schere. Halten Sie den Kopf durch das Einfügen einer gebogenen Pinzette in die Augen, schneiden Sie die Haut und öffnen Sie vorsichtig das weiche Schädel von der Rückseiteder Kopf, bis die Augen, auf jeder Seite des Kopfes. Schneiden Sie die Sehnerven und Hirnstamm, entfernen Sie das Gehirn, und steckte es in eine neue Petrischale mit HBSS. Unter einem Stereoskop, entfernen Sie alle Hirnhäute mit zwei dünnen Pinzette. Trennen den Hippocampus, den Kortex oder einem anderen Teil des Gehirns abhängig von der Struktur zu untersuchen. </li><li> Tauchen Sie den sezierten Hirnstruktur in 4,5 ml kaltem HBSS zuvor vorbereitet in 15-ml-Röhrchen und auf Eis zu halten, bis die Verdauung mit Trypsin. 0,5 ml von 2,5% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 15 min bis 20 min. Spülen Sie die Trypsin 3x mit HBSS, äußerst vorsichtig, um die Hirnteile nicht verdaut zu verwerfen. </li><li> Resuspendieren in 500 ul (Hippocampus) auf 1 ml (Cortex) DMEM plus 10% FBS und und abpipettieren mehrmals mit einer 1 ml-Mikropipette mit einer 1 ml-Spitze ausgestattet ist, dann mit 1 ml plus 200 ul Spitzen ausgestattet, bis es keine sichtbaren Aggregat. </li><li> Verteilen 100-200 ul Zellsuspension in jede 35 mm Glas bottom Schale mit DMEM plus 10% FBS und lassen die Neuronen haften bei 37 ° C für mindestens 3 Stunden. Ersetzen durch vorgewärmte Neuron Vollmedium (Neurobasalmedium, ergänzt mit 250 uM L-Glutamin und NS21, hergestellt wie in Chen et al. Beschrieben 19) und lassen bei 37 ° C, um neuronale Wachstum zu ermöglichen. Transfektion die Neuronen bei 5 bis 14 Tagen in vitro (div) (die Effizienz der Transfektion höher nach ein paar div aber synaptischen Verbindungen besser 7-10 div etabliert sind). </li></ol> 3. Transfektion von EGFP-Konstrukt G3BP1 Transfizieren der Zellen mit einem Vektor, der die cDNA des Proteins von Interesse (jede Komponente des DMS) mit einem fluoreszierenden Marker (GFP, YFP, etc.) fusioniert, unter Verwendung von 3 ug gereinigte Plasmid pro 35 mm-Schale. <ol><li> Transfektion die MEFs mit einem handelsüblichen Verfahren, nach dem Protokoll des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). </li><li> Transfektion die Neuronen mit einem Calcium-Phosphat-Methode von Xia et al 20 Kurz angepasst.: <ol><li> Bereiten Sie die Lösungen: DMEM-Wasch: DMEM mit 25 mM KCl; Transfektionslösung: DMEM-Wasch aus 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl 2 10 mM, Phenol-Rot); und Schock Lösung: HeBS 1x, 1x DMKY und DMSO 2% (v / v); und halten sie bei 37 ° C </li><li> Entfernen Sie die Medien aus den Neuronen, Filtrat, und halten Sie sie bei 37 ° C Waschen mit DMEM-Wasch dann mit Transfektionsmediums ersetzen und bei 37 ° C zu halten während der Herstellung der Calciumphosphat-Plasmid-DNA ausfällt. </li><li> In einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, fügen (in dieser Reihenfolge) Braun Wasser (Endvolumen 50 &amp;mgr; l), 5 &amp;mgr; l 2,5 M CaCl 2, und 3 &amp;mgr; g Plasmid-DNA. Lassen Sie diese Mischung auf 50 ul HeBS 2x bereits in einem Rund Polypropylen-Röhrchen eingeführt. Mischen Sie den Schlauch durch die Drehung zusammen mit dem Ablegen. Den Niederschlag Form bei Raumtemperatur während 30 min. </li><li> Fügen Sie den precipitate tropfenweise auf die Nervenzellen und lassen bei 37 ° C während 30 bis 50 min. </li><li> Ersetzen mit Schock-Lösung für 1 min, dann mit DMEM-Wasch spülen und schließlich die Wiedereinführung vorkonditioniert Medium. Halten der Zellen bei 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Visualisierung von G3BP Enthält SGs Versammlung und Dynamics <ol><li> Ersetzen Sie das Medium der Zellen, die Phenol-Rot von Phenolrot-freiem Medium enthält. </li><li> Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit Fluoreszenz für die Akquisitionen ausgestattet. Schalten Sie die Mikroskopsysteme: Quecksilberlampe, Computer und Laser. Wärmen Sie die Kammer auf 37 ° C mindestens 20 min vor Beginn der Akquisitionen. </li><li> Die Überexpression von G3BP induziert die spontane Bildung einer Art von SGs. Die Zellen können daher für die Montage der SGs 24 Stunden direkt nach der Transfektion ohne Stressinduktion beobachtet werden. Alternativ können Stress induziert werden, um weitere induzieren die von SGs. In 0,5 mM Natriumarsenit und Sternet die Übernahme kurz nach der Zugabe der Verbindung (Granulat wird gut innerhalb 1 Stunde gebildet werden.) </li><li> Öl in der Immersionsobjektiv (40X oder 63X verwenden Ziele) und installieren Sie die Petrischale vor dem Ziel, in der 35 mm angepasst Mikroskop Halter stabilisiert Halter auf der Bühne. Überprüfen Sie, dass das Gericht ansonsten flachen die Akquisitionen verändert werden. Einschalten des Fluoreszenzlichts nach der entsprechenden Fluorophors und visualisieren transfizierten Zellen. Schalten Fluoreszenz sobald eine Zelle von Interesse ist im Bereich um die Bleich und Zytotoxizität zu minimieren. </li><li> In der &quot;erwerben Reiter&quot;, wählen Sie die Laser in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge des Tags Fluorophor (488 nm in unserem Protokoll, das EGFP-markierten G3BP verwendet), und wählen Sie den Emissionslänge angepasst für den PMT (Photomultiplier). Stellen Sie die Laserleistung (in der Regel nicht mehr als 10%), um Rauschen und Übersättigung sowie Toxizität zu minimieren, und stellen Sie den Gain-und Offset, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verändern.Schnelle Scannen (1000 Hz), um die Dauer der Laser Exposition (Linie 2 Durchschnitt, Rahmen Durchschnitt 1) ​​zu minimieren. Wenn gewünscht, stellen Sie die Parameter für die Z-Stapel in der Lage sein, um das Bild in 3D (Z ein Schritt von 1 um ist in der Regel gut mit Zellen) zu rekonstruieren. Bestimmen Sie das Zeitintervall zwischen jedem Erwerb: kleinere Intervalle erlauben, eine kohärentere Film zu erhalten, aber dies kann Photobleaching und Toxizität (ein Intervall von 20 Sekunden wurde in den beschriebenen Experimenten verwendet) zu induzieren. Dauer der gesamten Anschaffungs je nach Belastung variieren. Viele G3BP haltigen SGs sehr schnell unter Arsenit Behandlung gebildet und sind gut sichtbar nach 1 Stunde der Behandlung: in diesem Fall, wählen Sie die Zellen schnell zu filmen und starten Sie die Akquisitionen direkt nach dem Stress, mit einer Gesamtdauer von Akquisitionen von 15 - 20 Minuten weitgehend ausreichend, um die Montage mehrerer SGs zu beobachten. </li><li> Speichern Sie die Bilder und rekonstruieren die Stapel-und Film mit ImageJ Software. </li></ol>

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	<li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+granules:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability.">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+the+Tao+of+RNA+triage.">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules.">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li><li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein.">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li><li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein:+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1.">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li><li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+G3BPs:+tissue+specific+expression,+chromosomal+localisation+and+rasGAP(120)+binding+studies.">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li><li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#945;+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress.">PKC&#945; Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp:+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization.">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li><li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+helicase+VIII:+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein,+an+element+of+the+ras+transduction+pathway.">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li><li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha,+entry+to+cytoplasmic+stress+granules,+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs.">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li><li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+(G3BP)+is+a+modulator+of+USP10,+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease.">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li><li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP.">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li><li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+G3BP1,+the+stress+granules+assembly+factor,+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons.">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression.">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li><li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult.">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li><li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly.">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase/ERK-Dependent+Mechanism.">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li><li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2&#945;+phosphorylation.">Large G3BP-induced granules trigger eIF2&#945; phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die wichtigsten Schritte im Protokoll betreffen die Transfektion und insbesondere der Zeitraffer-Akquisitionen, die sorgfältig, um weiter unten die Zytotoxizität überwacht werden müssen. Kultur von Primärzellen ist nicht eine schwierige Teil, solange sterilen Bedingungen eingehalten werden und Vorsicht, um Schäden während der Präparation und Zelldissoziation Schritte zu verhindern. MEFs kann in frühen Passagen eingefroren werden. Neuron Transfektion mit Calciumphosphat wurde gezeigt...

Stress Granulate (SGs) nicht membranöse zytoplasmatischen Foci als zelluläre Schutz Reaktion auf Umweltstress, z. B. erhöhte Temperatur, oxidativer Stress, Hypoxie, osmotischen Schock, UV-Bestrahlung, Glukoseentzug oder virale Infektion 1 gebildet. Sie können chemisch durch Behandlung mit Verbindungen wie Natriumarsenit, die oxidativen Stress auslöst, induziert werden. SGs akkumulieren installiert Übersetzung verhaftet Messenger ribonucleoprotein (mRNPs)-Komplexe 2, Maskierungs mRNAs von der Translationsmaschinerie und deren Montage kann durch die Phosphorylierung von eIF2a (eukaryotische Initiationsfaktor α 2) ausgelöst werden. SGs sind dynamische Strukturen, die Komponenten mit den Polysomen und andere Granulate, wie die P-Gremien auszutauschen. Sie bilden eine &quot;Triage-Zentrum&quot;, wo mRNAs werden sortiert und entweder für Übersetzung, Reinitiierung, Abbau oder Verpackung in stabilen, nicht-polysomaler mRNPs 3 verarbeitet. Die Montage ist schnell SGs but ist es ein schleichender Prozess mit Anfangs zahlreiche kleine Aggregate, die in größere Körnchen zusammenwachsen. Die Verwendung von chemischen Inhibitoren, die stören oder Mikrotubuli stabilisieren zeigt, dass das Mikrotubulus-Netzwerk für SG Dynamik einschließlich Montage und Demontage Koaleszenz Verfahren erforderlich sind. Die dynamische Anordnung von SGs auch durch Aggregation von spezifischen RNA-bindenden Proteinen (RNA-BP) wie TIA-1 (T-Zell-Antigen-Innen 1) und gefördert TIAR (TIA-1-verwandtes Protein), die in der Lage sind, zu dimerisieren und zu fördern Polysom ​​Demontage und das Routing von mRNAs in SGs 4. G3BP (RasGAP SH3-Domäne-bindendes Protein) ist ein solches RNA-BP, die SGs lokalisiert, wenn die Zellen mit Arsenit oder Hochtemperatur betont, und die Überexpression von dephosphoryliert G3BP können SGs Anordnung 5 induzieren. G3BP ist eine evolutionär konservierte RNA-BP, die zunächst durch die Interaktion mit einem Ras-GTPase-aktivierendes Protein gekennzeichnet war (p RasGAP120 6); aber diese Wechselwirkung wurde vor kurzem überarbeitet 7. Die Familie G3BP zwei Mitglieder bei Säugetieren, G3BP1 (als G3BP genannt) und G3BP2 8. Beide Proteine ​​co-lokalisieren in SGs, wenn die Zellen auf Stress 9 unterzogen. Den kanonischen RNA-Erkennungsmotiv (RRM) mit konservierten RNP1 und RNP2 Motive: G3BPs umfassen eine N-terminale Domäne NTF2 vorgeschlagen, um ihre Lokalisation und Oligomerisierung, gefolgt von Prolin-reiche (PxxP) Motive zu beeinflussen, dann C-terminalen Motive mit RNA-Bindung verbunden durch eine Arginin-Glycin reichen (RGG) Feld gefolgt. Interessanterweise ist die Analyse der verschiedenen Teile des Proteins durch Konstruktion verschiedener Domänen EGFP fusioniert zeigte, dass die NTF2-ähnliche Domäne und die RNA-Bindungsdomäne waren die effizient SGs rekrutiert, was auf die Bedeutung der Eigenschaften der Dimerisierung und RNA-Bindung in die Montage der SGs. Diverse Modelle haben unterschiedliche Funktionen von Proteinen in vitro G3BP 10-13 offenbart.Unterbrechung G3BP in Mäusen haben die Bedeutung dieses Proteins in der Entwicklungs Wachstum und Überleben 14, sowie eine wichtige Rolle für G3BP in das zentrale Nervensystem (ZNS), von Ataxie und Defekte in der räumlichen Arbeitsspeicher 15 gekennzeichnet dargestellt. G3BP Mangel führt zu veränderten neuronalen Plastizität und Calcium-Homöostase und stellt eine direkte Verbindung zwischen SG Bildung und neurodegenerative Erkrankungen 15. Es ist daher wichtig, um die Dynamik der SGs in primären Zellen wie Neuronen zu studieren. Dieses Protokoll bietet einen einfachen Weg, um die Montage von G3BP1 haltigen SGs in primären Zellen unter Arsenit Behandlung zu beobachten. Es kann verwendet werden, um DMS Anordnung unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, zum Beispiel verschiedene Arten von Spannungen werden. Es kann auch zu anderen Granulaten oder anderen Bestandteilen der SGs angepasst werden. Tatsächlich konzentriert sich dieses Protokoll auf G3BP1, aber es gibt andere Stress Granulat Marker wie TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein-Syndrom) 16, TDP-43 (transaktiven Reaktion DNA-bindendes Protein 43) 18 17 oder Staufen. Insbesondere Proteine ​​wie TIA-1 / R sind wie G3BP, Keim RNA-bindende Proteine, die SGs Montage induzieren kann, wenn überexprimiert wird, auch wenn die verschiedenen geformt SGs in Funktion, Regulation und zugehörigen Transkripte unterscheiden. Transfektion von Fluorophor-markierte Version eines dieser Schlüsselkomponenten oder Nucleatoren von SGs können, um bestimmte Bild SGs Montage und Dynamik durchgeführt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
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			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21331</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Trypsin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass bottom B-35</td>
			<td style="width:153px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">627860/627861</td>
			<td>Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HeBS</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21103</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">DU-110-A</td>
			<td>Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">P-110-BUF</td>
			<td>Very thin, tips 0,1 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Small scissors</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">CM-85-BS</td>
			<td>Can be useful to remove hippocampi</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyplus transfection JetPEI reagent&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Ozyme</td>
			<td style="width:119px;">101-10</td>
			<td>MEFs transfection, follow the forward protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:153px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of g3bp stress granules dynamics in live primary cells

SGs in Zellen durch Immunfärbung von spezifischen Proteinkomponenten oder polyA + mRNAs visualisiert werden. SGs sind sehr dynamisch und die Untersuchung ihrer Montage und Schicksal ist wichtig, um die zelluläre Reaktion auf Stress zu verstehen. Der Mangel an Schlüsselfaktoren der SGs wie G3BP (RasGAP SH3-Domäne Binding Protein) führt zu Entwicklungsstörungen bei Mäusen und Veränderungen des zentralen Nervensystems. Um die Dynamik von SGs in Zellen aus einem Organismus, man kann Kultur primären Zellen zu untersuchen und folgen Sie der Lokalisierung eines transfizierten markierten Komponente der SGs. Wir beschreiben Zeitraffer-Experiment zu beobachten G3BP1 haltigen SGs in embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF). Diese Technik kann auch verwendet werden, um G3BP enthaltenden DMS in lebenden Neuronen zu untersuchen, die von entscheidender Bedeutung ist, wie es vor kurzem gezeigt, dass diese SGs sind beim Einsetzen von neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit, gebildet werden. Dieser Ansatz kann auf jeden anderen Zellkörper und Granulat Proteinkomponente angepasst und durchmit transgenen Tieren, so dass die Live-Studie von Granulaten Dynamik zum Beispiel in der Abwesenheit eines spezifischen Faktors dieser Granulate.

Stress Granulatbildung in der Reaktion der Zellen auf Stress wichtig, was eine zelluläre Adaption mit Übersetzung ins Stocken geraten, bis die Belastung behoben ist, der Verhinderung der Apoptose assoziiert sind. Dieser Test ermöglicht es, die SGs in primären Zellen zu untersuchen, indem Sie die Lokalisierung von Schlüssel SGs Proteinkomponenten (Abbildung 1). G3BP, ein Schlüsselfaktor für SGs Montage ist derzeit eher diffus im Zytoplasma von kultivierten Neuronen oder MEFs (2A a...

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Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Stress-Granulat (DMS) sind zytoplasmatische RNA Granulat installiert Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) und in der zellulären Antwort auf verschiedene Belastungen wichtig enthalten. Dynamik der SGs können in lebenden Zellen durch die Visualisierung der Lokalisation einer markierten Komponente von SGs in transfizierten primären Zellen nach Stress verfolgt werden.

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Aufrufe.  Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535.  Stress-Granulat (DMS) sind zytoplasmatische RNA Granulat installiert Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) und in der zellulären Antwort auf verschiedene Belastungen wichtig enthalten. Dynamik der SGs können in lebenden Zellen durch die Visualisierung der Lokalisation einer markierten Komponente von SGs in transfizierten primären Zellen nach Stress verfolgt werden. 

Serie: Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Ein schnelles Verfahren für die Visualisierung von Live-immobilisierten Hefezellen

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Nutzung von Live Imaging Track Kerne während Myoblast Differenzierung und Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...