Diese Arbeit wurde vom NIH R01 HG002995 unterstützt &quot;TILLING der Zebrafisch-Genom: ein Reverse Genetics Approach&quot; zu CBM.

Teil A: Sperm Freezing-Lösungen 1. Ginsberg Fisch Ringers (Stellen frische alle 3 Tage, Ginsburg, 1963) Hinweis: Reihenfolge der Zugabe ist WICHTIG Ausfallen verhindern In 450 ml sterile ddH2O auflösen: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Dann fügen Sie: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Bringen Endvolumen von 500 ml mit sterilem ddH2O und lagern bei 4 ° C. 2. Freezing Medium (Machen Sie täglich frisch) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> Ohne Methanol <ul><li> Ginsburg Fisch Ringers 10 ml (Raumtemp.) </li><li> Magermilchpulver 1,5 g </li></ul></li><li> Mit Methanol Hinweis: Reihenfolge der Zugabe ist WICHTIG Ausfallen verhindern <ul><li> Ginsburg Fisch Ringers 9 ml (Raumtemp.) </li><li> Methanol 1 ml </li><li> Magermilchpulver 1,5 g </li></ul> Nach der Montage Einfrieren Medien, gut mischen für 20 min. auf Orbitalschüttler oder Wippe. Vor der Verwendung aliquoter in 1 ml Eppendorf-Röhrchen, die Vermeidung Oberfläche Blasen. </li></ol> Teil B: Materialien für die Spermien Einfrieren benötigt Materialien für die Spermien Einfrieren benötigt <ol><li> 10 pl Einwegpipetten (Fisherbrand cat # 22-358697) </li><li> 250ml Becher für Fische Wasser mit MESAB / Tricaine </li><li> Uhrgläser (Pyrex cat # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (oder gleichwertig) und Tipps </li><li> Sponge Fisch Halter (männlich halten, während Quetschen) </li><li> Präpariermikroskop mit über Bühnenbeleuchtung </li><li> Flache Pinzette (zB Millipore Typ) </li><li> 2.0ml Kryoröhrchen (Corning cat # 430488) </li><li> 10X10 Cryoboxen (Nalgene cat # 03-337-7AA) </li><li> Styropor-Container mit ~ 15 cm, fein zerkleinert trockene ice1 gefüllt </li><li> 15 ml konische Röhrchen (Falcon # 352099) </li><li> Dewar mit flüssigem Stickstoff </li><li> Lange Zangen (zB CMS Fisher Health Care cat # 10-316B) </li><li> Kryo- </li><li> Schmutzwassertank für Männer </li><li> Ein Eppendorf-Röhrchen mit dem Einfrieren Medien ohne Methanol gefüllt </li><li> Ein Eppendorf-Röhrchen mit dem Einfrieren Medien mit Methanol gefüllt </li><li> Cryofreezer (z. B. Taylor-Warton K-Serie) </li></ol> 1 Ein einfaches Verfahren zur Herstellung von fein zerkleinertem Trockeneis ist, um es in ein Handtuch wickeln und pulverisieren sie mit einem Hammer. Eine effizientere Methode ist es, eine Trockeneis Mühle, z. B. Clawson Modell RE-2 verwenden. Teil C: Sperm Freezing-Methode <ol><li> MARK Kapillarröhrchen: Vor Beginn, markieren Sie die 10 &amp;mgr; l Kapillarröhrchen mit einem Labor Stift auf dem Niveau von 3,33 ul (dh 16,7 mm von unten, siehe Abb. 1.1.). </li><li> Betäuben MALE: Platz männlich (s) in Becherglas mit MESAB / Tricaine in Fischwasser (Rezept in &quot;Der Zebrafisch Book&quot;) verwässert </li><li> Trockenfisch: Einmal betäubt, Lift Fisch aus der Narkose mit einem Plastiklöffel und sanft Blot Fisch trocken auf einem Papiertuch, wobei besonderes Augenmerk auf das Trocknen der Bauchseite. Wasser aktiviert Spermien so ist es wichtig, gründlich rund um die Kloake trocken. Position Fisch auf Schwammhalter, Bauchseite nach oben (Abb. 1.2). Wenn Region um Afterflosse ist noch feucht, sanft mit einem trockenen Kimwipe. Achten Sie darauf, nicht quetschen Spermien vorzeitig! </li><li> Ort markiert Kapillare in Gummi Mund pipettieren Adapter, der mit Kapillaren enthalten ist. Der Adapter ist ein Gummischlauch, dass ein Mundstück an einem Ende und einem Kapillarenhalter auf der anderen Seite hat. Alternativ kann die Kapillare zu einem 50 ul Hamilton Spritze über ein kurzes Stück Tygon-Schlauch der entsprechenden Durchmesser angeschlossen werden. </li><li> Platz männlich unter den Anwendungsbereich und setzen die urogenitalen Eröffnung durch vorsichtiges Verbreitung der Bauchflossen auseinander mit dem Ende der Kapillare. </li><li> COLLECT SPERM: Expel Spermien durch leichtes Streicheln der Seiten des Fisches mit glatten Pinzette (zB Millipore), oder durch leichtes Drücken den Seiten des Fisches zwischen Zeigefinger und Daumen. Sammeln Spermien in Kapillare, wie es ist ausgeschlossen mit sanftem Sog (Abb. 1.2). Vermeiden Fäkalien, die mit Spermien ausgeschlossen werden kann. </li><li> NORMALIZE Samenzellenvolumens auf 3,3 ul: Wenn das Volumen des Spermas erreicht oder überschreitet Stift Zeichen auf Kapillare (dh 16,7 mm oder größer), dann fahren Sie mit Schritt 8 fort. Wenn Spermien Volumen nicht erreicht Zielvolumen, dann normalisieren Volumen Stift markieren Einsatz des Freeze-Medium ohne Methanol (Abb. 1.3). Mindestbetrag von Spermien, die akzeptabel ist, hängt mit der Qualität der Spermien. Gute Spermien ist weiß und undurchsichtig. Schlechte Spermien sieht wässrig. In der Regel übernehmen wir als Minimum: 1 ul gute Spermien (oder 1 / 3 target) und 2 ul schlechte Spermien (oder 2 / 3 target). Volume ist nun auf 3,3 ul normalisiert. </li><li> ADD Gefrierschutzmittel für Spermien: Suck bis Einfriermedium mit MEthanol zum orangefarbene Markierung (ca. Gesamtvolumen beträgt jetzt 20 ul;. Abb. 1,4). Expel Spermien und Frostschutzmittel-Gemisch auf die saubere Fläche von einem Uhrglas, wobei besonderes Augenmerk auf nicht vorstellen Blasen. Vorsichtig durch Auf-und Abpipettieren ~ 4 mal (zu vermeiden Einführung von Blasen) zu mischen. </li><li> PLACE 10 &amp;mgr; l Sperma in je 2 Kryoröhrchen: Je 10 ul der Spermien: Gefrierschutzmittel Lösung in den unteren zwei getrennte Kryoröhrchen, dass alle relevanten Informationen (Abb. 1,5) markiert worden sind. Umzug schnell, Kappe Fläschchen und legen Sie sie in den Boden der Raumtemperatur 15 ml Falcon-Tubes-one-Kryoröhrchen / Rohr. Cap Falcon-Röhrchen und setzen Sie das Paar Kryoröhrchen-haltigen Falcon-Röhrchen in zerkleinertem Trockeneis. </li><li> FREEZE Spermien für 20 MIN. Auf Trockeneis: Trockeneis sollte in feiner Pulverform, nicht Pellets werden. Die Rohre sollten in das Trockeneis eingesetzt tief genug, dass nur ihre Mützen (Abb. 1.6) zeigen werden. Um den Überblick über Rohre in Trockeneis zu halten, geben Sie jedem Paar Falcon-Tubes eine Zahl von 1-20 (geschrieben an den Kappen) und notieren Sie die Zeit, die sie gehen in die Trockeneis. </li><li> PLACE Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff:. Nach der Spermien wurde auf Trockeneis für 20 min eingefroren, übertragen Sie sie auf einem flüssigen Stickstoff-haltige Dewar. Sperma ist hier bis zum Zeitpunkt, in flüssigem Stickstoff Gefrierschrank gelagert. Beim Platzieren in den Gefrierschrank Boxen, Platz Gefrierfach in einem Bad aus flüssigem Stickstoff, so dass Proben nicht erwärmen. Verwenden Sie lange Metall-Zange Röhrchen aus Dewargefäß erholen und Griff mit Kryo. Alternativ können Kryoröhrchen direkt aus Trockeneis überführt werden in die Tiefkühltruhe, wenn der Gefrierschrank Box gehalten wird eingetaucht in flüssigem Stickstoff in einem Styropor-Behälter. </li><li> Shop Kryoröhrchen langfristig in einer kryogenen flüssigen Stickstoff Gefrierschrank. Zur Aufrechterhaltung Lebensfähigkeit von Spermien, ist es wichtig, dass Fläschchen gespeichert sind eingetaucht in flüssigem Stickstoff. In unserer Erfahrung, verlieren Fläschchen in der Gasphase gespeichert Lebensfähigkeit im Laufe der Zeit. Schnelligkeit ist wichtig! Die Zeit zwischen dem Hinzufügen der Gefrierschutzmittel und Platzierung Spermien Fläschchen in Trockeneis (dh die Schritte 6-10) sollte nicht mehr als 30 Sekunden sein. </li></ol> Teil D: In-Vitro-Fertilisation Methode unter Einsatz von Kryokonservierte Sperm Wir finden, dass dies am besten mit zwei Personen. Eine Person drückt Eier von Weibchen während die andere Person taut der Spermien. <ol><li> Legen Sie ein Wasserbad auf 33 ° C. </li><li> Entfernen Sie aus flüssigem Stickstoff Gefrierschrank und Transfer-Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff-haltigen Dewargefäß erst unmittelbar vor der Schneeschmelze. </li><li> Squeeze Eier vom Weibchen in 35-mm-Petrischale aus Kunststoff. Wenn möglich, versuchen zu 3 Gelege zu erhalten und vereinigen sich zu einem Gericht. Wenn Sie nicht bekommen kann drei gute Kupplungen innerhalb von 1 min Ihrer ersten Kupplung, dann gehen Sie zu Schritt 4 (ein guter Kupplung ist ausreichend). Definition des guten Kupplung:&gt; 150 gleichmäßig gut aussehende Eier (dh gelblich, ohne weiße Rückstände Anzeichen für Degradation). Keep Schüssel abgedeckt, während Spermien aufgetaut. </li><li> Entfernen Fläschchen aus flüssigem Stickstoff und Kappe entfernen. Schnell tauchen Fläschchen ~ 1 / 2 Weg ins 33 ° C Wasserbad für 8-10 sek. </li><li> Schnelles Hinzufügen von 70 ul Raumtemperatur Hanks zu Fläschchen und mischen durch Auf-und Abpipettieren. Unmittelbar nach Eier hinzufügen und vorsichtig mischen mit Pipettenspitze. </li><li> Ohne Verzögerung, aktivieren Spermien und Eier durch Zugabe von 750 ul Fisch Wasser. Swirl zu mischen. Inkubieren 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 5 min, füllen Teller mit Fisch Wasser und inkubieren Schale bei 28 ° C. Nach 2-3 Stunden, zu zählen und zu übertragen fruchtbaren Embryonen bis 100mm Gerichte (50/dish). Graf unbefruchtete Eier, so dass die Befruchtung Frequenz bestimmt werden kann. </li><li> Passen Sie gut auf die Larven! Für die ersten 5 Tage, ändern Wasser täglich und entfernen abgestorbene Embryonen. Legen Sie nur Larven, die Schwimmblase haben in den Kindergarten am Tag 5. </li></ol> Teil E: Repräsentative Ergebnisse Wir haben dieses crypreservation Methodik, um eine Bibliothek von 8600 eingefrorenen Spermien Proben für TILLING zwischen den Jahren 2001 und 2003 zu machen. Wir haben 106 dieser Proben aufgetaut und bestimmt ihre Fruchtbarkeit. Die Fruchtbarkeit ist das Verhältnis von lebensfähigen Embryonen in einem in-vitro-Fertilisation durch die Gesamtzahl der Eier, die mit dem gefrorenen Sperma befruchtet wurden unterteilt produziert. Fresh (non cryporeserved) Spermien typischerweise&gt; 95% Fruchtbarkeit; kryokonservierten Spermien hat viel niedriger Fruchtbarkeit: durchschnittlich 29% (n = 106 Flaschen). Das Fläschchen-to-Fläschchen Variabilität in der Fruchtbarkeit ist groß und reicht von weniger als 1% auf bis zu 62%. Diese Variabilität ist durch die großen Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung in Abb. dargestellt. 2. Doch in 106 Spermaproben aufgetaut bis heute haben wir nur einmal 0% Fruchtbarkeit bei beiden Samenproben erfahrenen und es versäumt, die entsprechenden TILLING Mutation zu erholen. Mit dem Auftauen Spermien Fläschchen aus unserer Bibliothek im Laufe von mehreren Jahren (2001-2008) haben wir festgestellt, dass die durchschnittliche Fruchtbarkeit von Sperma-Proben mit dieser Methode eingefroren bleibtüber die Zeit stabil (Abb. 2). Die durchschnittliche Fruchtbarkeit der gefrorenen Sperma-Proben im Jahr 2001 wieder aufgetaut war 23,5% (basierend auf 11 Spermaproben) und in 2008 betrug 25% (basierend auf 21 Spermaproben). Eine Reihe anderer Forscher sind jetzt mit diesem Sperma Einfrieren Protokoll in ihren Labors. Einige haben gute Erfolge mit Geburtenraten und Probe zu Probe Variabilität ähnlich dem, was wir beobachtet haben, berichtet. Andere haben angeblich nicht, um dieses Protokoll in ihren Händen arbeiten. Wir glauben, dass wahrscheinlichen Quellen von Problemen sind: <ol><li> Die Nichtbeachtung der genauen Kryoröhrchen oder konische wir in das Protokoll vorgeschlagen haben zu verwenden, was zu einer unterschiedlichen Geschwindigkeit der Abkühlung, wenn in Trockeneis; </li><li> Andernfalls gepudert Trockeneis verwenden, was zu einer sub-optimalen Kühlrate; </li><li> Mit männlicher Fische mit schlechter Fruchtbarkeit: Sie sollten mindestens 1 ul der Spermien von einem einzigen Männchen bekommen. Sie können auch testen, männliche Fruchtbarkeit, indem Sie eine in-vitro-Fertilisation mit frischem Sperma, dies kann jedoch irreführend sein, weil es sehr wenig frisches Sperma braucht, um nahezu 100% der Fruchtbarkeit bekommen. </li><li> Mit minderer Qualität Eier in den in-vitro-Fertilisation. Mit alles andere als perfekt Kupplungen führt immer zu nahe bei 0% Fruchtbarkeit, auch von Samenproben, die tatsächlich gute Fruchtbarkeit (basierend auf die Fruchtbarkeit der doppelten Durchstechflasche). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Spermien Einfrieren Methodik. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Kryokonservierte Spermien Fruchtbarkeit bleibt stabil über die Zeit. Prozent Fruchtbarkeit ist die Anzahl der lebensfähigen Embryonen in einem in-vitro-Fertilisation durch die Gesamtzahl der Eier, die mit dem gefrorenen Sperma befruchtet wurden unterteilt produziert. &quot;N&quot; bezieht sich auf die Zahl der kryokonservierten Spermien Fläschchen, deren Fruchtbarkeit wurde in das entsprechende Jahr getestet. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Da jedes Spermium Durchstechflasche ist aus einem anderen Männchen, Fläschchen-to-Fläschchen Variabilität beobachtet.

<ol>
	<li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes.">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li><li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol.">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li></ol>

Eine Reihe anderer Forscher sind jetzt mit diesem Sperma Einfrieren Protokoll in ihren Labors. Einige haben ähnliche Fruchtbarkeit und derselben Probe zu Probe Variabilität, die wir beobachtet haben, berichtet. Andere haben angeblich nicht, um dieses Protokoll in ihren Händen arbeiten. Wir glauben, dass wahrscheinlichen Quellen von Problemen sind: <ol><li> Die Nichtbeachtung der genauen Kryoröhrchen oder konische wir in das Protokoll vorgeschlagen haben zu verwenden, was zu einer unterschiedlichen Geschwindigkeit der Abkühlung, wenn in Trockeneis; </li><li> Andernfalls gepudert Trockeneis verwenden, was zu einer sub-optimalen Kühlrate; </li><li> Mit männlicher Fische mit schlechter Fruchtbarkeit: Sie sollten mindestens 1 ul der Spermien von einem einzigen Männchen bekommen. Sie können auch testen, männliche Fruchtbarkeit, indem Sie eine in-vitro-Fertilisation mit frischem Sperma, dies kann jedoch irreführend sein, weil es sehr wenig frisches Sperma braucht, um nahezu 100% der Fruchtbarkeit bekommen. Größer, robust gefärbten Männchen in der Regel mehr geben höhere Qualität der Spermien. </li><li> Mit minderer Qualität Eier in den in-vitro-Fertilisation. Mit alles andere als perfekt Kupplungen führt immer zu nahe bei 0% Fruchtbarkeit, auch von Samenproben, die tatsächlich gute Fruchtbarkeit (basierend auf die Fruchtbarkeit der doppelten Durchstechflasche). </li></ol>

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<tr>
<td>10 &mu;l disposable pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-358697</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Watch glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pyrex</td>
<td>9985-75</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 ml cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430488</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 x 10 cryoboxes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>03-337-7AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tongs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Health Care</td>
<td>10-316B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cryofreezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taylor-Warton</td>
<td>K-series</td>
<td>For example</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
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a high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization

Dies ist eine Methode zur Zebrafisch Spermien Kryokonservierung, dass eine Anpassung der Harvey-Methode (Harvey et al., 1982) ist. Wir haben zwei Änderungen an dem ursprünglichen Protokoll eingeführt, dass sowohl die Verfahren zu straffen und zu erhöhen Probe Uniformität. Zunächst normalisieren wir alle Spermien Volumes mit dem Gefrierpunkt Medien, die nicht enthält Gefrierschutzmittel. Zweitens kryokonservierten Spermien in Kryoröhrchen statt Kapillarrohre gespeichert. Die Preise von Spermien Einfrieren und Auftauen (δ ° C / Zeit) sind wohl die beiden wichtigsten Variablen, die in diesem Verfahren zu kontrollieren. Aus diesem Grund sind kein Ersatz für verschiedene Rohre für diejenigen angegeben. Arbeiten in Teams von 2 ist es möglich, die Spermien von 100 Männern pro Team in ~ 2 Stunden einfrieren. Sperma kryokonserviert mit diesem Protokoll hat einen Durchschnitt von 25% der Fruchtbarkeit (gemessen als die Anzahl der lebensfähigen Embryonen in einem in-vitro-Fertilisation durch die Gesamtzahl der Eier befruchtet unterteilt erzeugt) und das Prozent Fruchtbarkeit ist über viele Jahre stabil.

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A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Dies ist ein High-Throughput-Spermien Kryokonservierung Protokoll für Zebrafisch. Sperma kryokonserviert mit diesem Protokoll hat einen Durchschnitt von 25% der Fruchtbarkeit in späteren vitro-Fertilisation und ist über viele Jahre stabil.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

30.8K Aufrufe.  University of California, Davis. Dies ist ein High-Throughput-Spermien Kryokonservierung Protokoll für Zebrafisch. Sperma kryokonserviert mit diesem Protokoll hat einen Durchschnitt von 25% der Fruchtbarkeit in späteren vitro-Fertilisation und ist über viele Jahre stabil.

Serie: A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Forschung

Biologie

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Ein Handbuch Kleine Molecule Bildschirm Nähern Hochdurch Mit Zebrafischembryonen

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...