Name: ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment
Uploaded: 2016-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment at JoVE.com

This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Alle Tierversuche wurden nach University of Wisconsin durchgeführt - Madison und Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien (University of Wisconsin - Madison Assurance Anzahl A3368-01). 1. Auswahl Frauen für Eiersammlung über Interrupted Mating HINWEIS: IVF-basierte Protokolle stützen sich auf die Extrusion von reifen Eizellen von Frauen durch manuellen Druck 9. Vorherige Protokolle haben Frauen direkt aus den Tanks oder in Paar Paarungen ohne die Weibchen unterziehen Ei Freisetzungsverhalten verwendet, aber nur ein kleiner Bruchteil dieser Frauen (etwa 20% oder weniger, abhängig von der Zebrabärbling Linie) ergeben extrudiert und kompetente Eier auf manuellen Druck. In einem verbesserten Verfahren, sind Frauen vorsortiert zur Eiablage durch direkte visuelle Beobachtung, durch sofortige Unterbrechung der Paarung gefolgt. Dieses Verfahren ist sehr effektiv, da fast alle Frauen dieser unterbrochenen Paarung Schritt Ausbeute extrudiert und kompetente Eier vorgewählten durchbei manueller Druck. <ol><li> Am Nachmittag vor dem Experiment, Paarung Paare des gewünschten Zebrabärbling-Stamm in Standard Zebrabärbling Paarungs Boxen eingerichtet. Halten Männchen in der gleichen Kammer wie Weibchen noch physisch von ihnen getrennt, entweder durch einen Gegenfeld Teilung oder durch das männliche unter einer Eiablage Einsatz platzieren und das weibliche Inneren des Einsatzes. </li><li> Der Morgen des Experiments, entfernen Sie die physischen Partition, sowohl die männlichen und weiblichen innerhalb der gleichen Eiablageeinsatz platzieren, so dass Paarung beginnt. </li><li> Sichtprüfung Tanks Paarung-Paaren Extrusion von Eiern während der natürlichen Paarung zu erkennen. Bei den ersten Anzeichen von Eier Extrusionen, getrennte männliche und weibliche unterbrochen Zucht. Nach der Trennung von Männern, halten die vorgewählten Weibchen entweder einzeln oder im gleichen Behälter gepoolt. Verwenden Sie mehrere Weibchen in Abhängigkeit von der Anzahl der Embryonen gewünscht (in der Regel 50 bis 150 Eier / weiblich). </li></ol> 2. Vorbereiten einer Sperma-Lösung HINWEIS: IVF rElies über die Exposition von reifen Eizellen zu einer Samen Lösung. Diese Lösung kann unbehandelt sein diploiden Zygoten zu erzeugen (was auf HS2 Behandlung werden tetraploiden Embryonen) oder UV-behandelt, haploid Zygoten zu erzeugen (die bei der HS2 Behandlung homozygot diploiden Embryonen werden). Vorherige Spermien Vorbereitungsprotokollen schlug die Verwendung von Kapillarrohren milt aus dem Analbereich von lebenden Männchen zu sammeln, aber dies war ein unwirksames Verfahren , da nur ein kleiner Bruchteil der Männchen milt 9 ergab. Das Protokoll unten dargestellt stützt sich stattdessen auf die Spermienvorbereitung von geschert seziert Hoden, die zuverlässigere Ergebnisse liefert. <ol><li> Bereiten Hank-Lösung vor der Zeit als Vormischung Lösung von Hank, umfassend alle Komponenten (Lösungen 1, 2, 4 und 5) mit Ausnahme des Natriumbicarbonat-Lösung (Lösung 6). Bereiten Lösung 6 frische und fügen Sie zu der Vormischung den Morgen des Experiments (Tabelle 1). Um Hanks &#39;Lösung (endgültige Lösung machen, bereiten Morgen desIVF-Verfahren), kombinieren 990 ul Hanks Premix und 10 ul der frisch 6 hergestellten Lösung. </li><li> Euthanize Männchen durch Überbelichtung als 0,016% ige Lösung in Wasser konditioniert zu Tricaine. <ol><li> Bereiten Sie Tricaine als 0,2% Stammlösung in Wasser (Puffer auf pH 7,0 mit 1 M Tris pH 9,0) und halten bei 4 ° C. In 8 ml Tricaine Stammlösung pro 100 ml Wasser in einem Becher, und ein Netz verwenden, um die Männer zu der Tricaine Lösung zu übertragen. </li><li> Verwenden das Äquivalent von Hoden für ein Männchen pro Gelege benötigt in einem Volumen von Hank-Lösung befruchtet werden entsprechend 100 &amp; mgr; l pro Männchen (zB Hoden von 10 Männern in 1 ml Hanks-Lösung gesammelt, 10 Kupplungen mit 100 ul / Kupplungs zu befruchten). </li><li> Bestätigen Sie die Euthanasie durch die Einstellung der Kiemenbewegungen für 15 Minuten. Nach Euthanasie, entfernen Sie die Männchen aus dem Becher mit einem Löffel. Spülen Sie die Männchen kurz mit klimatisiertem Wasser und trocknen Sie sie leicht, indem sie kurz an verschiedenen Standorten eines platzierenPapierhandtuch. </li></ol></li><li> Zum Entfernen der Hoden, erste decapitate eingeschläfert Männchen mit Dissektionsscheren oder einer Rasierklinge und einen Längsschnitt machen entlang der Bauch mit Sezieren scissors.Under ein Binokular mit einer reflektierten Lichtquelle, entfernen Sie die inneren Organe mit Pinzette. Ziehen Sie jede der Hoden Massen aus mit einer Pinzette und legen Sie sie in der Mikrozentrifugenröhrchen Hank-Lösung enthält. HINWEIS: Testes kann als jede der zwei länglichen Strukturen aus durchscheinendem Aussehen neben den Körperwänden und die in der Nähe der Kloake konvergieren gefunden identifiziert werden. Testes kann 2-3 min auf einer Petri-Plattenoberfläche nach der Sektion bleiben und vor ihnen in der Hank-Lösung setzt. </li><li> Lassen Sie die Spermien in die Lösung durch Scherung der Hoden mit einem schmalen Spachtel und / oder vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten 5-6 mal die Hoden in Lösung mit einem 1000 ul-Spitze Mikro, während der Luftblasenbildung zu vermeiden. Lassen Sie die Hoden Trümmer siedeln. </li><li> Lagern Sie die Samenlösung in Eis, wo er seine Potenz für bis zu 2-3 Stunden zu halten. Wenn Sie fortfahren, um UV-Behandlung von Spermien Lösung wird die Lösung in eine saubere Mikrozentrifugenröhrchen hinter die Stücke von Hoden verlassen. </li></ol> 3. UV-Behandlung HINWEIS: UV-Behandlung wird verwendet, Sperma-DNA, um zu vernetzen sie inaktiv im Embryo zu machen. Dieser Schritt wird nur verwendet, wenn gynogenetischen haploid oder homozygot gynogenetischen diploiden Embryonen zu erzeugen. Sperm Lösung für UV-Behandlung sollte aus Stücken von Hoden (Schritt 2.4), als große Stücke können die Spermien von der UV-Behandlung getrennt werden abzuschirmen. <ol><li> Übertragen Sie die Spermienlösung auf eine saubere, trockene und einer Vertiefung Glasplatte auf einem Eis Bett sitzen (zB Eis in einer Petrischale). Verwenden Sie bis zu 1 ml Spermienlösung pro Glasplatte gut. </li><li> Setzen Sie die Samenlösung UV durch die Vertiefung Glasplatte unter einer UV-Lampe auf dem Eis Bett platzieren. Behandeln Sie die Samenlösung für 90 Sekunden mit einem 115 V (60 Hz, 0.68A) UV-Lampe bei einem 19 cm (7,5 Zoll) Abstand. Mit dem Ende einer Pipettenspitze, vorsichtig mischen die Lösung alle 30 Sekunden während der UV-Behandlung (eine saubere Pipettenspitze alle 30 sec verwenden). </li><li> Mit einem sauberen Pipettenspitze und Mikropipette, übertragen Sie die behandelten Samen Lösung auf ein neues Reaktionsgefäß. Lagern auf Eis, bis sie benötigt für die IVF (nicht mehr als 2-3 Stunden von der Extraktion). </li></ol> 4. Manuelle Extrusion von reifen Eizellen HINWEIS: Frauen durch Unterbrechung der natürlichen Paarungen erhalten werden leicht Eier unter Narkose und manuellen Druck nachgeben. Während dieses Verfahrens Tricaine Behandlung sorgfältig gesteuert werden sollte, Überbelichtungen zu vermeiden, die Wiederherstellung der Weibchen zu verhindern. <ol><li> Anesthetize Weibchen durch Lichteinwirkung zu Tricaine Lösung: Transfer Frauen mit einer Netto-Lösung in klimatisiertem Wasser zu Tricaine (hergestellt durch Zugabe von 8 ml Tricaine 0,2% Stammlösung zu 100 ml konditionierten Fischwasser) für ca. 2-5 min, bis der Fisch Anschlag Kiemenbewegung. </li> &lt;li&gt; Sobald eine weibliche Kiemenbewegung stoppt, verwenden Sie einen Löffel zu sammeln und sie kurz in klimatisiertem Wasser spülen. Immer noch mit dem Löffel, um den Fisch zu bewegen, trocknen Sie es leicht, indem sie es kurz und wiederholt an mehreren Stellen eines Papiertuch legen, ist es dann trocken mit 10 cm Durchmesser Petrischale auf einem sauberen, übertragen. Nähern Sie sich dem Fisch mit dem Löffel in der von vorne nach hinten Richtung, um zu verhindern möglicherweise die Kiemen operculum zu beschädigen. </li><li> Verwenden Labortücher oder Weichgewebe, um sanft weiter die Afterflosse Bereich trocknen, keine Freigabe Eier zu verhindern, vorzeitig durch Wasser aktiviert wird. Dämpfende die Finger leicht mit Wasser (zu vermeiden, dass sie zu Fischschuppen kleben), legen Sie einen Finger einer Hand auf dem Rücken des weiblichen als Unterstützung, und mit einem Finger der anderen Hand mit leichtem Druck entlang der Bauch der Frau, bis Eier extrudiert werden. </li><li> Verwenden Sie einen schmalen Spachtel, um die Eier weg von den weiblichen Körper. Legen Sie die Frauen zurück in einen Tank mit klimatisiertem Wasser für die Wiederherstellung. <br/&gt; Hinweis: Sobald Eier extrudiert werden, während das Weibchen auf einer Seite ihres Körpers liegen wird, kann sie zu erhalten zusätzliche Eier gewendet und der Prozess auf ihrer anderen Seite wiederholt werden. Um sicherzustellen, vollständige Genesung des weiblichen, gelten nur sanfte manuelle Druck auf den Bauch, und führen Sie den Vorgang von Kiemenbewegungsanschlag zurück zu Wasser in weniger als 2 min. </li><li> Aktivieren (mit Wasser Exposition) und befruchten (mit Sperma Lösung zusätzlich) Eier gleichzeitig und innerhalb von 90 Sekunden nach der Extrusion (siehe Abschnitt 5). </li></ol> 5. In - vitro - Fertilisation HINWEIS: Zebrabärbling Befruchtung in natürlichen Kreuze ist extern, abhängig von der gleichzeitigen Freisetzung und Aktivierung durch Wasser von Eizellen und Spermien während der Paarung. In-vitro-Fertilisation Mimetika dieser Prozess durch die Eier zu Spermienlösung in Anwesenheit von Wasser ausgesetzt wird. Wasservolumen ist ursprünglich klein (1 ml), um die effektive Spermienkonzentration zu erhöhen. Von Spermien Bindung erfolgt innerhalb von 15-20 sec 10 &lt;sup /&gt;, und Wassermenge kann dann erhöht werden. Chorion Heben trägt weiter dazu die enge Synchronisation der Kupplung durch das Fenster für die Kompetenzbegrenzung für die Spermien 11,12 Bindung. Die daraus resultierenden Embryonen weisen daher weitgehend gleichzeitige Zellteilung Zyklen während der frühen Furchungsstadien. <ol><li> 100 l Spermienlösung (entsprechend dem Äquivalent von Hoden von einem männlichen - siehe Teil 2) auf die Kupplung von extrudierten Eier auf einer Petrischale. Vorsichtig schwenken verwendet, um die Pipettenspitze die Spermien-Lösung unter die Eier hinzufügen zusammen, um die Spermien und Eier zu mischen, sicher die Spitze von der Oberfläche der Petrischale nicht heben sein Ei Schäden zu vermeiden. </li><li> Sofort die Eier aktivieren durch Zugabe von 1 ml embryonalen Medium (E3) Lösung (konditioniertes Wasser ist auch akzeptabel, als Ersatz für die E3 in Teile 5 bis 7) und wieder sanft Eier und Sperma mit der Pipettenspitze durch vorsichtiges Schwenken mischen. Starten Sie eine Timer-Timing in Bezug auf die Befruchtung zu initiieren. </li&gt; <li> Bei 1 MPF im Volumen von 1 ml, überfluten die Platte mit E3. Bevor wir fortfahren, lassen Sie ungestört bis 10-12 MPF Eiaktivierung zu ermöglichen, einschließlich der vollständigen Chorion Expansion. </li></ol> 6. Hitzeschockbehandlung HINWEIS: Ein Hitzeschock im frühen Embryo angewendet hemmt centriole Vervielfältigung, was zu einer unvollständigen Ergänzung Centriolen während der anschließenden Zellzyklus 2 Spindelbildung zu fahren. Das Fehlen von Spindel wiederum zu der fehlenden Bildung Furche 13. <ol><li> Nach der Expansion der Chorion (10-12 MPF), gießen Sie die Embryonen aus der Petrischale in ein Teesieb. Spülen Sie die Petrischale mit einer Waschflasche mit E3, um unter Verwendung irgendwelcher restlichen Embryonen im Teesieb zu sammeln. </li><li> Setzen Sie den Teesieb mit den Embryonen in einem Becherglas in einem vorgeheizten Bad mit E3 bei 28,5 ° C. Pre-äquilibrieren den Becher und E3 in das Wasserbad Temperatur, und stellen Sie sicher, dass genügend E3 ist, so dass alle Embryonen in den TeeSchmutzfänger werden dem Medium ausgesetzt. </li><li> Bei 22 MPF, entfernen Sie das Teesieb aus dem Wasserbad 28,5 ° C, es kurz auslöschen auf ein Papiertuch, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen, und legen Sie sie in einem ähnlich vorgewärmte E3 Becherglas in einem Wärmebad bei 41.4 ° C. </li><li> Bei 24 MPF, übertragen Sie den Teesieb im Wasserbad auf der E3 zurück bei 28,5 ° C nach kurzer Blotting. Mit 29 MPF, eine Waschflasche mit E3 verwenden, um die Embryonen aus dem Teesieb auf einer 10 cm Petrischale zu übertragen. </li></ol> 7. Auswahl für Embryonen mit einem Ein-Zyklus Cytokinesis Stall <ol><li> Während der Zeitperiode 35-45 MPF, unter einem Binokular mit einer Lichtquelle übertragen, wählen Sie jene Embryonen, die symmetrische Spaltung in die 2-Zell-Stadium durchlaufen, und die daher befruchtet werden. Entfernen Embryonen, die keine Zellspaltung durchlaufen. </li><li> Weiterhin die befruchtete Embryonen beobachtet, für die normale Zellteilung während des ersten Zellzyklus ausgewählt und während der Sekundeond Zellzyklus (50-65 MPF). </li><li> Sortier Embryonen gemäß den folgenden Kategorien (2C): 4 - Zellen ( &quot;no Stall&quot;, in der 2: 2 - Standard - Anordnung für ein 4-Zellen - Embryo); 3-Zellen ( &quot;partial Stall&quot;, in einer abweichenden 2 kleinere Zellen: 1 große Zellenanordnung); und 2-Zellen ( &quot;blockiert&quot;, Embryonen zeigen eine Ein-Zellzyklus-Verzögerung in einer 1: 1-Anordnung identisch zu der eines 2-zellige Embryos). Sortieren Sie die ins Stocken geraten Embryonen in eine frische Petrischale. HINWEIS: In diesem Stadium Embryonen in der 2: 2-Anordnung entsprechen denen weder Blastomere dem während der zweiten Zellzyklus eine Zellteilung Stall unterzogen; Embryonen in aberranter 2 kleinere Zellen: 1 große Zellenanordnung entsprechen denjenigen in dem Hitzeschock eine Zellzyklus-Strömungsabriß während des zweiten Zellzyklus in einer Blastomere verursacht aber nicht die andere; und Embryonen &quot;ins Stocken geraten&quot; in einer 1: 1-Anordnung entsprechen denen, wo während des zweiten Zellzyklus beide Blastomeren die gewünschte Zellteilung unterzogStall. Stalled Embryonen Zellspaltung während der folgenden Zellzyklusperiode (65-80 MPF) wieder aufnehmen. Die Anordnung von Blastomeren kann variabel sein, aufgrund der unvollständigen Hinweise aus der vorherigen Zellzyklus der Spindel 2,14 zu stabilisieren, aber die meisten Embryonen wird ein relativ normales blastula bilden , die normale Entwicklung unterzogen werden kann. </li><li> Lassen Embryonen in der Petrischale, mit einem Limit von 80 Embryonen pro 10 cm Platte zu entwickeln. Bei 24 HPF, beachten Sie die Embryonen zu bestimmen , ob sie eine normale Morphologie charakteristisch für diploide oder homozygot diploiden Embryonen 6 (normale Ausmaß der Achse Verlängerung (3A, 3C)) haben, im Gegensatz zu reduzierten Achserweiterung und erhöhte Körperstärke charakteristisch für Haploiden (3B)), und / oder beurteilen Diploidisierung mit genetischen Markern Pigment bei 36 MPF, wie golden oder Albino und andere solche Assays (Abbildung 3 und siehe unten) 2,6,9. </li&gt; <li> Entfernen Sie alle Embryonen, die eine haploide Morphologie zu haben scheinen, oder dass lysiert haben oder andere grob abnormal Mängel aufweisen. HINWEIS: Falls gewünscht, lassen Embryonen bis 5 Tage nach der Befruchtung zu entwickeln, während sie weiterhin lysiert oder grob abnorme Embryonen auf einer täglichen Basis zu entfernen und Zugabe von frischem E3 das Medium zu aktualisieren. HINWEIS: Die überlebenden Embryonen können auch nach dem Schwimmblase Inflation auf 5 Tage gezüchtet werden, indem man zu einer Brüterei System übertragen und unter Standardbedingungen Fütterung. </li></ol>

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	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+and+induction+of+alternate+clevage+patterns+through+inhibition+of+centrosome+duplication+in+the+early+zebrafish+embryo.">Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).</li><li>Zhang, X., Onozato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrostatic+pressure+treatment+during+the+first+mitosis+does+not+suppress+the+first+cleavage+but+the+second+one.">Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one.</a> Aquaculture. 240, 101-113 (2004).</li><li>Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hydrostatic+pressure+on+microtubule+organization+and+cell+cycle+in+gynogenetically+activated+eggs+of+olive+flounder+(Paralichthys+olivaceus).">Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus).</a> Theriogenology. 68, 873-881 (2007).</li><li>Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-intrinsic+mechanisms+modulate+centrosome+integrity+during+fever.">Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever.</a> Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).</li><li>Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).</li><li>Blanco-Vives, B., S&#225;nchez-V&#225;zquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronisation+to+light+and+feeding+time+of+circadian+rhythms+of+spawning+and+locomotor+activity+in+zebrafish.">Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).</li><li>Dekens, M. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).</li><li>Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).</li><li>Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sperm+entry+site+during+fertilization+of+the+zebrafish+egg:+localization+of+actin.">The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin.</a> Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).</li><li>Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+a+sperm+meets+an+egg:+block+to+polyspermy.">When a sperm meets an egg: block to polyspermy.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defending+the+zygote:+search+for+the+ancestral+animal+block+to+polyspermy.">Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).</li><li>Rappaport, R., Rappaport, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cleavage+furrows+by+the+mitotic+spindle.">Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle.</a> J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).</li><li>W&#252;hr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos.">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).</li><li>Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+maternal-effect+gene+cellular+atoll+encodes+the+centriolar+component+Sas-6+and+defects+in+its+paternal+function+promote+whole+genome+duplication.">The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication.</a> Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).</li><li>Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+Y,+W,+and+Z+sex+chromosomes+in+Xenopus+tropicalis.">Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).</li><li>Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish.">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112, 311-319 (1986).</li><li>Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-effect+gene+futile+cycle.is+essential+for+pronuclear+congression+and+mitotic+spindle+assembly+in+the+zebrafish+zygote.">The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote.</a> Development. 130, 3907-3916 (2003).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).</li></ol>

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Kritische Schritte Es ist wichtig, unter den Bedingungen einer wirksamen in-vitro-Fertilisation zu arbeiten. Um eine gute Versorgung mit reifen Eier (Schritt 1) ​​zu gewährleisten, Frauen setzen für die Paarung sollte nicht wurden in Paarungs Kreuze für mindestens 5 Tage festgelegt und sollte gravide erscheinen. Während Unterbrechung der Zucht, kann ein Beobachter 15-30 Tanks ausreichend für das erste Auftreten von natürlichen Ei Extrusion überwachen. Unterbrechung der Paarung sollte...

Dieses Protokoll ermöglicht die Manipulation von Ploidie in Zebrabärbling - Embryonen, beispielsweise bei der Erzeugung von homozygoten gynogenetischen Diploiden von gynogenetischen Haploiden (Abbildung 1) oder die Herstellung von tetraploiden. Dies wird durch Induzieren einer Verzögerung in Zytokinese erreicht genau einem Zellenzyklus entspricht (2A, 2B). Der Schlüssel von einem Zyklus Verzögerung in cytokinesis wird durch Behandlung mit Hitzeschock erreicht. Das Standardprotokoll von Hitzeschock (HS) , wie ursprünglich von Streisinger und Kollegen beteiligt einen Temperaturimpuls während des Zeitraums 13-15 MPF, was zu einer Ein-Zyklus der Zellteilung Strömungsabriß während des ersten Zellzyklus - 1. Die Effizienz dieses Protokolls wurde durch Scannen der frühen Zellzyklen mit einem gleitenden Zeitfenster von Hitzeschockbehandlung vor kurzem verbessert. Dieser Scan einen späteren Zeitpunkt für einen Wärmeschock, noch innerhalb des ersten Zellzyklus (22-24 MPF), die zu einer höheren Rate von embr identifiziertenYos mit einem Zellteilungsströmungsabriß one-Zyklus, der in diesem Fall 2 mit der zweiten Zellzyklus wirkt. Die Beobachtung , dass experimentelle Manipulationen während des ersten Zyklus Zelle mit der Zellteilung in der zweiten Zellzyklus stören und DNA - Gehalt Vervielfältigung verursachen wurde auch bei anderen Fischarten 3,4 berichtet worden. Wir bezeichnen diese modifizierten Protokoll als Heat Shock 2 (HS2 - der Begriff &quot;2&quot; anzeigt, dass der Wärmeimpuls zu einem späteren Zeitpunkt erfolgt als die Standard HS-Methode, und dass der Zellzyklus-Verzögerung durch HS2 tritt während der zweiten Zellzyklus ). Diese Studien zeigten, dass die Grundlage für die Cytokinese Verhaftung nach Hitzeschock ist die Hemmung der centriole Duplizierung während des Wärmeimpulses, der Spindelbildung und Furche Induktions in der folgenden Zellzyklus wirkt. HS2 Ergebnisse in Ausbeuten von Arrest des Zellzyklus 100% nähert, und die Sätze der Ploidie Vervielfältigung bis zu 4 - mal höher als Standard HS 2. Die Embryonen behandelt Witzha Hitzeschock während Blastomere Zellzyklus viele schädliche Wirkungen zeigen, was darauf hindeutet , dass die Hitzeschock wirkt sich für die Zellteilung 2 mehrere Prozesse erforderlich. Auf der anderen Seite, wenn die Hitzeschock vor der Einleitung des Zellzyklus (Zeitraum 0-30 MPF) angewendet wird, scheint es , Auswirkungen im Einklang mit spezifischen Störungen centriole Doppelarbeit zu haben und scheint nicht andere wesentliche Zellprozesse 2 zu beeinflussen . Diese Studien zeigten, dass die Zeit vor dem Beginn der Blastomere Teilung wird eine Entwicklungsperiode zugänglich Verwendung Heat Shock als Werkzeug zu sein, um spezifisch Ploidie durch centriole Hemmung manipulieren. Die zugrunde liegende Ursache der scheinbaren Selektivität für Hitzeschock auf centriole Vervielfältigung ist nicht bekannt, kann aber auf einen selektiven Abbau von Zentrosomen Substrukturen beobachtet unter Hitzestress in bestimmten Zelltypen, wie beispielsweise Leukozyten 5 bezogen werden. Die zeitliche Synchronisation der embryonalen dewicklung wird durch In-vitro-Fertilisation (IVF) erreicht. Verwendung von unbehandeltem Sperma bei der Befruchtung führt zu diploiden Embryonen, die auf einem Zyklus cytokinesis Stall werden tetraploiden HS2-induziert. Die Verwendung von UV-behandelten Spermien, die Vernetzungen trägt, die ihre DNA zu inaktivieren, die Ergebnisse in gynogenetischen haploiden Embryonen 6, die auf einem Zyklus cytokinesis Stall gynogenetischen diploiden 2 werden-HSII induziert. Aufgrund der daraus resultierenden ganze Genomduplikation sind die letzteren gynogenetischen diploiden über das Genom in jedem einzelnen Locus homozygot. Für Prägnanz verweisen wir haploiden Embryonen als &quot;Haploiden&quot;, und homozygote gynogenetischen diploiden Embryonen als &quot;homozygot diploiden&quot; zu gynogenetischen. Wenn lebensfähige und fruchtbare können homozygot diploiden verwendet werden steril und tödlich freien Linien zu initiieren. Direkte homozygosity induziert durch HS2 sollte auch leicht in die genetische Analyse oder genetischen Screens eingebaut werden, da homozygot diploiden von Weibchen, die heterozygote Träger von mut sindtionen zeigen Raten von Homozygotie bei hohen und festen (50%) -Verhältnisse 2. Das folgende Protokoll beschreibt Schritte HS2 auszuführen und Ploidie Vervielfältigung mit voller homozygosity induzieren. Für tetraploiden Produktion sollte Spermien Lösung unbehandelt sein. Für homozygote diploiden Produktion, Sperma sollte durch UV-Behandlung inaktiviert werden. Darüber hinaus können auch Identifizierung von homozygoten diploiden verwendet werden, wie in der Diskussion, sichtbaren Pigmentmarkern beschrieben zu erleichtern. Zebrabärbling Kumpel in erster Linie während der ersten 3 Stunden nach Einleitung ihrer Licht - Zyklus 7 und Erwachsene und Eier sind empfindlich auf zirkadianen Rhythmen 8, so dass für die besten Ergebnisse der IVF - Verfahren innerhalb dieser Frist erfolgen soll.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish mating boxes</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>FDA approved (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td><td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td><td>available in ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>Plastic spoon</td><td></td><td></td><td>available in most standard stores</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting forceps</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>available from Fine Science Tools</td></tr><tr><td>Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Reflective light source (LED arms)</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Petri plates 10 cm diameter</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 ml</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Pipette tips 1,000 &amp;micro;l</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Narrow spatula</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>Depression glass plate</td><td>Corning Inc</td><td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>UVP</td><td>Model XX-15 (cat No. UVP18006201)</td><td>available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)</td></tr><tr><td>UV glasses</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Timer stop watch</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Wash bottle</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Tea strainer</td><td></td><td></td><td>available in kitchen stores</td></tr><tr><td>beakers, 250 ml (2)</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>water bath (2)</td><td></td><td></td><td>any maker, with accurary to 0.1 C (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Shel Lab H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O Bath Series)</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 1</td><td>see above</td><td>see above</td><td>8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 2</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.358 g Anhydrous Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.6 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 4</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.72 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; in 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Premix</td><td>see above</td><td>see above</td><td>add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 2;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 4;&amp;nbsp; 86.0 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 6</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.33 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; in 10 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Solution (final solution)</td><td>see above</td><td>see above</td><td>Combine 990 &amp;mu;l of Hank&amp;rsquo;s Premix and 10 &amp;mu;l of freshly made Solution 6 (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; solution)</td></tr></tbody></table>

ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment

Manipulation von Ploidie ermöglicht nützliche Umwandlungen, wie Diploide zu tetraploiden oder Haploiden zu diploiden. Im Zebrabärblingen, insbesondere die Erzeugung von homozygot gynogenetischen diploiden ist in der genetischen Analyse nützlich , weil sie die direkte Herstellung von Homozygoten aus einer einzigen heterozygot Mutter erlaubt. Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes Protokoll für die Duplizierung Ploidie basierend auf einem Wärmeimpuls während des ersten Zellzyklus, Heat Shock 2 (HS2). Durch Hemmung der centriole Vervielfältigung führt dieses Verfahren in einer präzisen Zellteilung Stand während des zweiten Zellzyklus. Die genaue Ein-Zyklus-Teilung Stall, gekoppelt unbeeinflusst DNA Vervielfältigung, ergibt sich ganze Genomduplikation. Protokolle mit diesem Verfahren verbunden sind Ei- und Samensammlung, UV - Behandlung von Spermien, in - vitro - Fertilisation und Wärmeimpuls eine Ein-Zellzyklus - Abteilung Verzögerung und Ploidie Doppelarbeit zu verursachen. Eine modifizierte Version dieses Protokolls könnte angewendet werdenPloidie Veränderungen in anderen Tierarten zu induzieren.

Trotz des Stalles ein Zellzyklus Zytokinese tritt die DNA - Replikation normalerweise in solchen Embryonen, die sich in der Vervielfältigung der DNA - Gehalt des Embryos (Abbildung 1). Das Streisinger Heat Shock - Protokoll (Standard HS) beinhaltet einen Wärmeimpuls während der Zeit von 13 bis 15 Minuten nach der Befruchtung (MPF) und induziert in erster Linie cytokinesis Verhaftung während der ersten embryonalen Zellteilung bei 35 MPF 1,2, während die ab...

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Ein modifiziertes Protokoll zur Ploidie Manipulation verwendet einen Hitzeschock eine Ein-Zyklus-Stall in cytokinesis im frühen Embryo zu induzieren. Dieses Protokoll wird in dem Zebrafisch gezeigt, sondern kann auf andere Arten anwendbar.

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Aufrufe.  University of Wisconsin.  Ein modifiziertes Protokoll zur Ploidie Manipulation verwendet einen Hitzeschock eine Ein-Zyklus-Stall in cytokinesis im frühen Embryo zu induzieren. Dieses Protokoll wird in dem Zebrafisch gezeigt, sondern kann auf andere Arten anwendbar. 

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Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Forschung

Genetik

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Machen Gynogenetic Diploid Zebrafisch von Anfang Druck

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Biologie

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Entwicklungsbiologie

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Trennung von Follikulärzellen und Oozyten in Denrogarischen Follikel von Zebrafischen

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Das Auslösen Zellstress und Tod unter Verwendung von herkömmlichen UV-Laser konfokale Mikroskopie

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Neurowissenschaften

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...