Dieses Protokoll verwendet eine Kombination aus In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie und dient als einfache und effiziente Möglichkeit, eine mRNA und ein Protein gleichzeitig zu analysieren. Dieses Protokoll gilt für Embryonen in verschiedenen Stadien, Gewebeschnitte unterschiedlicher Dicke und verschiedene Organe. Zu Beginn fixieren Sie etwa 10 Embryonen mit 0,5 bis 1 Milliliter frischem 4%-Paraformaldehyd in einem 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen bei vier Grad Celsius über Nacht für 12 bis 14 Stunden.
Die Embryonen werden nach und nach dehydriert, indem sie mit 25, 50 und 75 % Methanol in PBST nacheinander für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur gewaschen werden. Waschen Sie die Embryonen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 100%igem Methanol. Inkubieren Sie die Embryonen in 100%igem Methanol bei minus 20 Grad Celsius mindestens über Nacht, 12 bis 14 Stunden lang.
Rehydrieren Sie die Embryonen nach und nach, indem Sie sie nacheinander fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 75, 50 und 25 % Methanol in PBST waschen. Waschen Sie den Embryo erneut dreimal mit PBST für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur. Verdauen Sie die Embryonen mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K in PBST bei Raumtemperatur und waschen Sie die Embryonen fünf Minuten lang dreimal mit PBST.
Anschließend werden die gewaschenen Embryonen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4%Paraformaldehyd fixiert. Waschen Sie den Embryo erneut dreimal mit PBST, während Sie bei jeder Wäsche fünf Minuten lang inkubieren. Um die Embryonen vorzuhybridisieren, inkubieren Sie sie fünf Minuten lang in einer Vorhybridisierungslösung bei 65 Grad Celsius.
Ersetzen Sie dann die Vorhybridisierungslösung durch die Hybridisierungslösung und hybridisieren Sie mindestens vier Stunden lang vor. Erhitzen Sie die Sonde fünf Minuten lang in der Hybridisierungslösung bei 95 Grad Celsius, bevor Sie sie zu den Embryonen hinzufügen. Entfernen Sie so viel Vorhybridisierungslösung wie möglich, ohne die Embryonen mit der Luft in Berührung kommen zu lassen.
In das Röhrchen, in dem sich die Embryonen befinden, wird die vorgewärmte Sonde in die Hybridisierungslösung gegeben und die Sonde über Nacht für 12 bis 14 Stunden bei 50 bis 70 Grad Celsius hybridisieren lassen. Am nächsten Tag wird die Sondenlösung mit einer Pipette abgesaugt und in einem Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt, damit sie viele Male wiederverwendet werden kann. Waschen Sie die Embryonen mit 100%iger Hybridisierungslösung, gefolgt von sequenziellem Waschen mit 75-, 50- und 25%iger Hybridisierungslösung in der doppelten Konzentration von SSCT für 15 Minuten bei 65 Grad Celsius.
Waschen Sie die Embryonen dann 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius in der doppelten und 0,2-fachen Konzentration von SSCT. Waschen Sie die Embryonen zweimal für 10 Minuten in MABT bei Raumtemperatur. Blockieren Sie die hybridisierten und gewaschenen Embryonen mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit 2%iger Blocklösung-1.
Ersetzen Sie die Blockierlösung-1 durch Antidigoxigenin-Alkalische Phosphatase in einer frischen 2%igen Blockierungslösung-1 und schütteln Sie sie über Nacht 12 bis 14 Stunden bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Embryonen dann viermal in MABT für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Embryonen erneut zweimal in NTMT und entfernen Sie mit einer Pipette so viel NTMT wie möglich aus den Embryonen.
Ersetzen Sie die Embryonen durch das violette alkalische Phosphatase-Substrat BM und färben Sie die Embryonen bei Raumtemperatur im Dunkeln. Sobald sich der Fleck gebildet hat, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zweimal kurz mit NTMT spülen. Nach der In-situ-Hybridisierung werden die Embryonen 20 Minuten lang dreimal mit PBST gespült.
Tauchen Sie die Embryonen über Nacht für 12 bis 14 Stunden bei vier Grad Celsius in 5%ige Saccharose in PBS. Wechseln Sie dann die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in 15%ige Saccharose in PBS und inkubieren Sie sie über Nacht für 12 bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius. Wechseln Sie erneut die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in PBS auf 30%ige Saccharose und inkubieren Sie sie ein bis zwei Tage lang bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie die Embryonen in ein neues Kryomold für Gewebe und füllen Sie es vorsichtig mit einem Medium mit optimaler Schnitttemperatur, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Als nächstes schneiden Sie die Proben mit einem Kryostaten in 12 bis 20 Mikrometer dicke Abschnitte und übertragen die Schnitte schnell auf Objektträger. Lassen Sie die Proben Raumtemperatur erreichen und lagern Sie die Schnitte in einem verschlossenen Objektträgerkasten bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung.
Waschen Sie die Objektträger, die die Abschnitte enthalten, fünf Minuten lang mit PBS. Legen Sie dann die Objektträger in den Puffer und erhitzen Sie die Lösung etwa 20 Minuten lang, um sie nahe der Siedetemperatur zu halten. Lassen Sie die überschüssige Lösung ab und trocknen Sie den Bereich um jeden Abschnitt vorsichtig mit einem Stück Taschentuch ab.
Zeichnen Sie dann mit einem wasserabweisenden Stift einen Kreis um den Abschnitt, um eine hydrophobe Barriere zu bilden, und blockieren Sie den Abschnitt zwei Stunden lang in Sperrlösung-2 bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie die primäre Antikörperlösung pro Objektträger und inkubieren Sie die Objektträger in einer immunhistochemischen Nassbox bei vier Grad Celsius über Nacht. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS, während Sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang inkubieren, und lassen Sie das überschüssige PBS abtropfen.
Anschließend werden die Objektträger mit dem entsprechenden Sekundärantikörper eine Stunde lang bei Raumtemperatur in PBS inkubiert. Waschen Sie die Objektträger erneut dreimal mit PBS, während Sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang inkubieren, und lassen Sie das überschüssige PBS ab. Anschließend wird das Eindeckmedium auf den Objektträger pipettiert und mit einem Objektträgerdeckglas montiert.
Die Expression des 5-HT2C-Rezeptors im Zentralnervensystem wurde in der transgenen foxP2 egfp-caax-Linie nachgewiesen. Die simultane Expression von 5-HT2C wurde in der transgenen Linie zusammen mit foxP2-Neuronen beobachtet, die durch ein fluoresceingrün fluoreszierendes Protein markiert wurden. Die Expression von insm1a, einem Zinkfinger-Transkriptionsfaktor im Rückenmark und in den Motoneuronen des Zebrafisches, wurde in der transgenen Linie nachgewiesen.
Die simultane Expression von insm1a wurde in der transgenen Linie zusammen mit hb9-Neuronen beobachtet, die durch fluorescein grün fluoreszierendes Protein markiert wurden. Zebrafische müssen mit frisch zubereitetem Paraformaldehyd fixiert werden.
