Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse GM055360 zu SLB und U54HD068157 zu RGM unterstützt. JMB wurde von der T32 Genetik Ausbildungsförderung an der Universität von Pennsylvania (GM008216) unterstützt.

Die STA-PUT-Protokoll in drei Stufen: 1) aus dem Gerät und Reagenzien Set, 2) Herstellung der Zellsuspension aus ganzen Hoden, und 3) für Zellen, Sedimentation und Fraktionssammlung. Wenn von einem Team von zwei Forschern durchgeführt wird, nimmt das Protokoll 8 Stunden im Durchschnitt. 1. Einrichten der STA-PUT-Apparat (Abbildung 1) *** STA-PUT-Geräte sollten im 4 ° C großen Kühlschrank oder einem kühlen Raum, der auch einen Fraktionssammler aufnehmen kann gestellt werden, wenn das Verfahren der Sammlung wird bevorzugt. <ol><li> In der Nacht vor (oder zumindest ein paar Stunden vor) Sie das Verfahren durchzuführen, waschen alle Geräte (vor allem die Glaswaren und Schläuche) und sterilisieren mit 70% Ethanol. Lassen Sie Geräte vollständig trocknen, bevor die Montage der Vorrichtung, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Befestigen Sie die beiden L 2 Zylindern (1B und C) und die Zelle Laderaum ( <strong&gt; 1A) auf der oberen Plattform und verbinden alle mit zwei kleinen Schlauchstücke mit Schlauchschellen. Klemmen Sie alle Röhren geschlossen. Verschließen Sie den Auslauf auf der rechten höchstens 2 L Zylinder. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Rührstab in der Zelle Ladekammer (Abbildung 1A) und eine größere Rührstab in der am weitesten links L 2 Zylinder (1B), die die 2% BSA enthalten wird. </li><li> Legen Sie die 2 L Sedimentation Kammer auf der Plattform (1D). Legen Sie die Metallprall (1F) direkt auf die Öffnung in der Unterseite der Sedimentation Kammer (1D). Dies ist kritisch, da die Ablenkplatte verhindert Verwirbelung der Flüssigkeit und der Zerstörung der Zell Gradienten während Fraktionssammlung. Setzen Sie den Deckel auf der Oberseite der Kammer Sedimentation. </li><li> Nach der Anwendung einer sehr kleinen Menge von Vakuumfett auf den Schliff des Dreiwegehahn (Fig. 1G), spannen das Sperrventil zum Boden des SEdimentation Kammer, welche die Glasschliffe der Hahn und der Sedimentation Kammer. </li><li> Verbinden des Mobilladekammer (1A) auf der rechten Auslass des Absperrventils mit Schlauch. Schließen Sie den Wasserhahn. </li><li> Befestigen Sie die Zellfraktionierung Schlauch an der linken Ausgang der Hahn. Die Fraktionierung Schlauch umfasst eine Rohrstück mit einer Glaspasteurpipette mit dem offenen Ende verbunden ist. Ein Stück der kleineren Bohrungsschlauch ist mit dem schmalen Ende der Glaspipette befestigt. Der schmale Pipetten die Strömung der Zellsuspension während Fraktion sammeln. Klemmen Sie dieses kleine Rohr ganz unten. </li><li> Herstellung von 2 L Krebs (1x) puffern den Tag des Experiments (Tabelle 1). Dann bereiten 550 ml 2% BSA in 1x Krebs, 550 ml 4% BSA in 1x Krebs, und 50 ml 0,5% BSA in 1x Krebs. Filtern und zu kühlen, diese Lösungen auf 4 ° C </li><li> Gießen Sie die 4% BSA-Lösung in die richtige L 2 Zylinder (1C) und der 2% BSALösung in der linken Zylinder L 2 (Fig. 1B). Stellen Sie sicher, es gibt keine großen Blasen in der Rohrleitung, die diese Zylinder verbindet. </li><li> Gießen Sie Krebs-Puffer in die Zelle Ladekammer und füllen Sie den Schlauch Anschluss dieses Kammer mit der Sedimentation Kammer, um sicherzustellen, gibt es keine großen Luftblasen, da diese das Gefälle zu stören. Quetschen oder schnippte den Schlauch hilft sanft um die Blasen zu entfernen. Sicherzustellen, dass alle von dem Krebs-Puffer ist in dem Rohr und in der Zellkammer. </li><li> Lassen Sie eine kleine Menge von Krebs-Puffer in die Sedimentation Kammer strömen und dann abtropfen lassen fast alle den Puffer in die Zelle Fraktionierung Schlauch, um die Röhre zu füllen und entfernen Sie alle großen Blasen. </li><li> Setzen Sie den Fraktionssammler direkt unter der Sedimentation Kammer. Stellen Sie sicher, dass alle Bruchrohre vorhanden sind und mit Plastikfolie abgedeckt, um eine Kontamination zu verhindern. </li></ol> 2. Trenn spermatogenen Zellen aus Voll Hoden <ol&gt; <li> Dissect Hoden ab ca. 12 erwachsenen Mäusen (vorzugsweise mindestens acht Wochen alt) und in Krebs-Puffer bei Raumtemperatur zu waschen Sie die Gefährdungs ​​Material. Dieses Protokoll demonstriert beinhaltet die Verwendung von Labormäusen und wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Universität von Pennsylvania Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss ausgeführt. </li><li> In 45 mg Kollagenase zu 50 ml Krebs-Puffer in einem konischen Rohr rechts, bevor Sie beabsichtigen, die Samenkanälchen hinzufügen. Ermöglichen diese Lösung zu erwärmen auf 33 ° C für wenige Minuten. Split gleichmäßig in zwei 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Entkapseln die Hoden in einer separaten Platte mit 8 ml Krebs-Puffer, das Verwerfen der Tunica albuginea und Lösen der Samenkanälchen. Die Tunica albuginea ist die dünne Membran, die die Samenleiter umgibt. Die Röhrchen sollten leicht lösen sich von der Tunica albuginea. Um dies zu tun, einen Einschnitt in der Tunica albuginea, halten Sie diese Membran mit einem pair der Zange, und drücken Sie die Tubuli aus und weg von der Membran mit einer anderen Pinzette. </li><li> 4 ml Krebs-Puffer, die die Tubuli zu jeder konischen Röhrchen mit 25 ml Kollagenase-Lösung und Inkubation unter Schütteln bei 33 ° C für 10 min. Am Ende sollten die Tubuli ein &quot;Spaghetti-like&quot; Aussehen haben. </li><li> Lassen Sie die Röhrchen für ca. 5 Min. auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. Gießen Sie den Überstand und waschen 2x in 25 ml Krebs-Puffer (bei Raumtemperatur), so dass die Röhrchen auf den Boden der Röhre jedes Mal zu begleichen. Lassen ~ 5 ml Krebs-Puffer in jedes Röhrchen. </li><li> Beim Waschen, fügen Sie 30 mg Trypsin zu 50 ml Krebs-Puffer in einem Falcon-Röhrchen rechts, bevor Sie beabsichtigen, die Samenkanälchen hinzufügen. Ermöglichen diese Lösung zu erwärmen auf 33 ° C für wenige Minuten. Split gleichmäßig in zwei 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> 25 ml Trypsin-Lösung zu jedem der beiden Rohre, die die Tubuli. In 3 ug DNAse (1 μg/10ml) in jedes Röhrchen zu Zelle verhinderns aus verklumpen. Inkubiere unter Schütteln bei 33 ° C für 10 min. </li><li> Verwenden Sie eine breite Bohrung Pipette, um die Lösung, die die Tubuli agitieren, in und aus dem Pipettieren sie ca. 10x. Die Lösung sollte beginnen, mehr wie eine Einzelzellsuspension zu suchen. </li><li> Inkubiere unter Schütteln bei 33 ° C für weitere 10 min. Verwenden Sie eine breite Bohrung Pipette, um die Tubuli in eine Einzelzellsuspension zu zerstreuen, in und aus dem Pipettieren sie ca. 25x. Wenn Sie immer noch eine Menge von Tubuli oder Zellklumpen, zerstreuen mehr mit der Pipette und / oder fügen Sie eine weitere 3 ug DNAse zu jedem Rohr (Doppelausgangskonzentration). </li><li> Filtern der Einzelzellsuspension durch ein 100 &amp;mgr; m-Mesh-Zellsieb (eine für jedes Rohr von 30 ml Zellsuspension). Vereinige die Zellsuspensionen und zählen die Gesamtzahl der Zellen (sollte zwischen 7-8 × 10 8 Zellen). *** VERBOTEN MEHR ALS 800 Millionen Zellen auf der Steigung. </li><li> Basierend auf der Zellzahl in Schritt 2.10 erhalten, das Pellet appropriate Volumen von gefilterten Zellen bei 450 rcf für 5 Minuten und wäscht mit 30 ml Krebs-Puffer. Wiederholen. 22 *** Normalerweise Hoden wird mehr als 800 Millionen Zellen ergeben, aber nicht mehr als diese Anzahl von Zellen zu laden. </li><li> Die Zellen vorsichtig in 25 ml 0,5% BSA enthält, zwischen 2,5 und 5 ug DNAse (je nach dem Grad der Zell-Verklumpungen) ohne Blasen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen, die nicht verklumpen. Filtern Sie die Einzelzellsuspension durch ein 100 um Maschen Zellsieb. Die Zellen sind nun bereit, zu laden. Gut mischen vor dem Laden durch Umdrehen des Röhrchens ein paar mal. </li></ol> 3. Handy laden und Sedimentation <ol><li> Sicherstellen, dass der Hahn geschlossen ist, aber in der Lage, durch die Flüssigkeit aus der Zellkammer (1A) in die Absetzkammer (1D) fließt. </li><li> Schalten Sie beide Rührstab Platten auf einer niedrigen Einstellung (ca. 70 min), damit die Rührstäbe, um kontinuierlich zu bewegen, aber langsam. </li><li> Gießen Sie die Zellsuspension in die Zellkammer (Abbildung 1A), und öffnen Sie den Wasserhahn, so dass die Zellen fließen langsam in die Sedimentation Kammer bei einer Rate von 10 ml / min (1D). Schließen Sie den Wasserhahn. Durchflussmenge kann durch Markieren Volumen Abständen auf der Sedimentation Kammer bestimmt werden. </li><li> Pour 5 ml 0,5% BSA-Lösung in die Zellkammer anschließen und in der Sedimentationskammer mit einer Rate von 10 ml / min. Schließen Sie den Wasserhahn. Dieser Schritt wird die Zellen aus der Zellkammer waschen. Wiederholen 4x. </li><li> Vorbereitung der Gradient: Öffnen der Klammern zwischen der Zellkammer (1A) und zwei 2 l Zylinder (1B und C), und beginnt, die Flüssigkeit in der Absetzkammer mit einer Rate von 40 ml / min (Fig. 1D) Drain sofort. Die Durchflussmenge so dauert es ca. 20-30 Minuten, bis die BSA-Gradienten in der Sedimentationskammer laden. Eine dünne Schicht von Zellen ungestört oben auf die LiegeBSA-Gradienten sichtbar sein soll. Nachdem die meisten der BSA geladen ist, schließen Sie den Wasserhahn und schalten Sie ihn in die Position, dass die Flüssigkeit aus der Sedimentation Kammer in die Fraktionierung Rohr ablaufen wird. </li><li> Schalten Sie die Platten für Aufsehen. </li><li> Lassen Sie die Zellen für eine Stunde und 45 Minuten sedimentieren. Bitte nicht stören DAS GERÄT während dieser Zeit. Jede mechanische Bewegung könnte den Verlauf zu stören. </li></ol> 4. Fraktionierung und Analyse der Fraktionen *** Wie Sie die folgenden Schritte durchführen, achten Sie darauf, um den Verlauf zu stören. Wenn die BSA-Gradienten gestört ist, wird das Verfahren nicht funktionieren! <ol><li> Sobald die Zellen sedimentiert, langsam abfließen 50 ml von der Sedimentation Kammer in eine 50 ml konischen Röhrchen und beiseite stellen. Diese Fraktion enthält in der Regel unerwünschte Zellklumpen und Trümmer. </li><li> Befestigen Sie die Rohrbruchteil auf die Fraktion Sammler. *** Es ist auch möglich, um die Fraktionen mit der Hand zu sammeln, wenn ein Bruch collector ist nicht verfügbar. </li><li> Sammeln Fraktionen: Die Durchflussrate mit dem Hahn, so dass 10 ml (Füllung ein Sammelrohr) wird alle 45 Sekunden gesammelt. </li><li> Verschließen Sie die Fraktionssammelrohre und Spin für 5 min bei 450 rcf bei 4 ° C Überstand abgießen vorsichtig resuspendieren Zellen im verbleibenden Flüssigkeit und Zellen auf Eis halten. </li><li> Nachdem alle Fraktionen gesammelt werden, mikroskopisch analysieren die Fraktionen für die verschiedenen Zellpopulationen. Verschiedene Zelltypen können auf der Grundlage der Zellgröße und Zellkernmorphologie 8,15 unterscheiden. Fig. 2 zeigt &quot;repräsentative Ergebnisse&quot; für die drei gepoolten Fraktionen, die (a) und somatische Zellen und meiotische Spermatogonien angereichert sind, (b) runden Spermatiden und (c) verlängert und Brenn Spermatiden. <ul><li> Typ A Spermatogonien sind 12-14 um ca. im Durchmesser und haben runde Kerne, die homogen in der Chromatin-Zusammensetzung sind. </li><li> Typ B Spermatogonien sind 8-9 um ca. Durchmesser und haben round Kerne, die dichter Heterochromatin an der Kernperipherie zu zeigen. </li><li> Pre-Leptotän Spermatozyten sind 7.5-8.2μm ca. Durchmesser von weniger als Cytoplasma Typ B-Spermatogonien und haben Kerne, die ähnlich denen in Typ B-Spermatogonien aussehen. </li><li> Leptotän primären Spermatozyten sind um ca. 10.08. Durchmesser und haben Kerne, die ähnlich denen der vorge Leptotän Spermatozyten aussehen, scheinen aber dichter Chromatin in der Kernmembran zu erhalten. </li><li> Zygotän primären Spermatozyten sind ca. 10-12 um. Durchmesser und haben Kerne, die ähnlich denjenigen der primären Spermatozyten Leptotän aussehen. </li><li> Pachytän Spermatozyten sind überall um ca. 12-18. im Durchmesser und bestehen aus einer dünnen Rand Zytoplasma rund um einen großen Zellkern. Mehr Klumpen von dichten Chromatins im Zellkern zu erkennen. </li><li> Runden Spermatiden sind ca. 10 um. Durchmesser und einen runden Kern mit einem dicht Färbung Chromozentrum in der Mitte. </li><li> RestKörper ~ 6,5 &amp;mgr; m im Durchmesser, sind rund, und keinen Kern. </li><li> Dehnen und Brenn Spermatiden sind ähnlich groß wie runden Spermatiden, aber haben eine einzigartige, sichelförmigen Kern. </li></ul><ol><li> Beginnen Sie mit der Fraktion 15 und alle fünf Fraktionen bis zu 85 zu analysieren. Normalerweise werden Fraktionen unter 15 gemischt und zu klumpig sein und Fraktionen über 85 werden nur wenige bis gar keine brauchbare Zellen enthalten. </li><li> Um eine Fraktion zu analysieren, nehmen 5UL von Flüssigkeit aus dem Fraktionssammelrohr (einmal Zellen nach Zentrifugation resuspendiert wurde) und in den 5 ul 8% Formaldehyd in Krebs-Puffer. Ermöglichen die fixierten Zellen bei Raumtemperatur für fünf Minuten sitzen. </li><li> Hinzufügen von 5 ul 0,1% Triton und DAPI (5 μ / ml Krebs-Puffer) zu den fixierten Zellen. Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur 5 min stehen lassen. </li><li> Platz 10 ul der resultierenden Lösung auf eine Folie, Deckel mit einem Deckglas und Analyse mit einem Fluoreszenzmikroskop, um die Reinheit jeder Fraktion zu bestimmen. </li><li> Kombinieren Fraktionen, die in Größe und Kernmorphologie sind (siehe &quot;Repräsentative Ergebnisse&quot;), um die folgenden Populationen von Zellen zu schaffen: Meiose und somatischen diploiden Zellen, runden Spermatiden, und Kondensations / Verlängern Spermatiden. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Spermatogenesis.">Mammalian Spermatogenesis.</a> Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).</li><li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche.">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).</li><li>Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+in+vitro+culture+to+in+vivo+models+to+study+testis+development+and+spermatogenesis.">From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis.</a> Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146, 519-532 (2011).</li><li>Easley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+haploid+spermatogenic+cells.">Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells.</a> Cell Rep. 2, 440-446 (2012).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li><li>Miller, R. G., Phillips, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients.">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enrichment+of+undifferentiated+GFR+alpha+1++spermatogonia+from+immature+rat+testis+by+magnetic+activated+cell+sorting.">Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting.</a> Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).</li><li>Bellve, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).</li><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations.">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li><li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis.">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li><li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro,+short-term+culture+method+for+mammalian+haploid+round+spermatids+amenable+for+molecular+manipulation.">An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation.</a> Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren. Dieses Protokoll demonstriert beinhaltet die Verwendung von Labormäusen und wurde in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt. Tiere in diesem Protokoll verwendet werden, unter der Leitung und Genehmigung von der Universität von Pennsylvania Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC Protokoll # 804284) gehalten.

Diejenigen, die Spermatogenese studieren verlassen sich auf Tiermodelle für die Spermatogenese Zellproben, wie eine zuverlässige Zellkultursystem noch nicht zur Erzeugung spermatogenen alle Zelltypen 3 existieren. Obwohl spermatogenen Zellen leicht aus ganzen Hoden gesammelt, führt nur eine gemischte Bevölkerung. Dies stellt ein Problem für diejenigen, die auf bestimmte Subtypen dieser Zellen, wie meiotischen Zellen, runden Spermatiden, und Kondensations Spermatiden studieren möchten. Drei verschiedene ...

Säugetier Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, der Differenzierung in den Samenkanälchen der Hoden ein in mehreren Stufen erfolgt. Kurz gesagt, wie Stammzellen-Spermatogonien, die in der Nähe des Epithels der Samenkanälchen Kluft wohnen und differenzieren sich in Spermatozyten, die dann meiotischen Teilungen zu unterziehen. Nach Abschluss der Meiose ist die resultierenden haploiden Zellen oder runden Spermatiden, Spermiogenese unterziehen, eine Differenzierung, die den Abbau von Zytoplasma und Verdichtung der Kern beinhaltet. Spermatiden schrittweise ein Flagellum und Dehnung und Kondensation des Kerns unterzogen, wodurch verlängert und dann Kondensieren Spermatiden sind. Die Endprodukte sind Spermatozoen, die in das Lumen des Tubulus und schließlich in den Nebenhoden, wo sie weiter reifen freigesetzt. Da der Prozess der Spermatogenese sieht spezielle hormonelle und Molekularbedingungendie Hoden, eine zuverlässige in vitro-Kultursystem für den gesamten Prozess der Spermatogenese wurde noch nicht entwickelt worden ist 2,3. Kultur Methoden für die Erstellung von &quot;Ur-Keimzellen-ähnlichen Zellen&quot; und haploid, &quot;rund Spermatide-ähnliche Zellen&quot; aus Stammzellen entwickelt worden, aber diese Methoden sind noch nicht in der Lage, eine große Anzahl dieser Zellen zu erzeugen und nicht zu später spermatogenen Zelle erzeugen 4,5 Typen. Glücklicherweise unterscheiden sich die Spermatogenese Zelltypen deutlich in der Größe, die für eine aus ganzen Hoden mit einer Flüssigkeit Gradienten getrennt werden, erhalten Einzelzellsuspension ermöglicht. Die STA-PUT-Methode, hier gezeigt, verwendet einen linearen Gradienten BSA und einfache Sedimentation spermatogenen Zellen zu trennen, basierend auf Größe und Masse 9.6. Die STA-PUT-Methode hat mehrere Vorteile gegenüber den anderen beiden am häufigsten verwendeten Methoden, um spermatogenen Zelltypen zu trennen: FACS und Elutriation 10-13. Die STA-PUT Gerät erfordert only mehrere Stücke von Glaswaren spezialisiert in einem kalten Raum oder großer Kühlschrank montiert. Somit ist es weniger teuer als die Verwendung eines Zellsortierer oder eine Elutriator. Die STA-PUT Verfahren ergibt höhere Mengen an Zellen pro Zelltyp und Testis, als durch FACS in einer vergleichbaren Zeitspanne sortiert werden, wobei die Reinheit jeder Zellpopulation ist nicht so hoch wie die mit FACS-11 erhalten. Zellsortierung Verwendung magnetische Kügelchen (magnetisch aktivierten Zellsortierung, MACS) wurde kürzlich erfolgreich für die Anreicherung von Spermatogonien aus einer gemischten Zellpopulation Hoden beschäftigt, aber es ist derzeit für die Trennung Spermatozyten oder Spermatiden aufgrund mangelnder Kenntnisse der entsprechenden Oberfläche Marker 14 ungeeignet ist. Ein zusätzlicher Vorteil der STA-PUT Verfahren über FACS oder MACS ist die Fähigkeit, lebensfähige Zellen für die nachfolgende Kultur zu isolieren, weil im Gegensatz zu den meisten FACS Protokolle sie keine DNA oder andere Arten der Färbung erforderlich. Für Studien, die l erfordernarge Ausbeuten der Spermatogenese Zelltypen bei ~ 90% Reinheit, ist der STA-PUT eine ideale Methode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

Säugetier Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, der Differenzierung in den Samenkanälchen der Hoden in mehreren Stufen erfolgt. Derzeit gibt es keine zuverlässigen Zellkultursystem, das für die Spermatogenese in vitro Differenzierung, und die meisten biologischen Untersuchungen der Spermatogenese Zellen benötigen Ernte Gewebe aus Tiermodellen, wie Maus und Ratte. Da die Hoden enthält zahlreiche Zelltypen - sowohl nicht-Spermatogenese (Leydig, Sertoli, myeloische und Epithelzellen) und Spermatogenese (Spermatogonien, Spermatozyten, runde Spermatiden, Brenn Spermatiden und Spermatozoen) - Studien über die biologischen Mechanismen der Spermatogenese beteiligt erfordern die Isolation und Anreicherung dieser verschiedenen Zelltypen. Die STA-PUT Verfahren ermöglicht die Trennung einer heterogenen Population von Zellen - in diesem Fall aus den Hoden - durch einen linearen Gradienten BSA. Einzelne Zelltypen mit unterschiedlichen sedimentieren Sedimentationsgeschwindigkeit nach cell Größe und Fraktionen für verschiedene Zelltypen angereichert können gesammelt und in weitere Analysen genutzt werden. Während der STA-PUT Verfahren nicht in hochreiner Fraktionen von Zelltypen, wie z. B. mit bestimmten Zellsortierverfahren erreicht werden ergeben, liefert es eine wesentlich höhere Ausbeute an Gesamtzellen in jeder Fraktion (~ 1 × 10 8 Zellen / Spermatogenese Zelltyp aus einer Anfangspopulation von 7-8 x 10 8 Zellen). Diese hohe Ausbeute Methode erfordert nur Glaswaren spezialisiert und kann in jeder kalten Raum oder großer Kühlschrank durchgeführt werden, so dass es eine ideale Methode für Labors, die nur begrenzten Zugang zu spezialisierten Geräten wie einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) oder Elutriator haben.

Die ideale Ergebnis der STA-PUT Verfahren ist ein recht bemerkbar Trennung von Zellen aus den Hoden, basierend auf Zellgröße und Dichte. Während Zellen aus dem Hoden isoliert werden durch die BSA-Gradienten sedimentieren, können mehrere verschiedene Bands von Zellen beobachtet werden. Irgendwelche Klumpen von Zellen dazu neigen, auf den Boden des Gradienten sinken und wird nicht verunreinigen die anderen Fraktionen. Ein wenig weiter oben in der Steigung wird die große somatischen und meiotischen Zellen sein. Weiter...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Die STA-PUT Verfahren ermöglicht die Trennung der verschiedenen Populationen von Zellen spermatogenic basierend auf Größe und Dichte.

Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.5K Aufrufe.  University of Pennsylvania.  Die STA-PUT Verfahren ermöglicht die Trennung der verschiedenen Populationen von Zellen spermatogenic basierend auf Größe und Dichte. 

Serie: Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Zwei Arten von Assays zum Nachweis von Frog Sperm Chemotaxis

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel Bayesian Change-Punkt Algorithmus für genomweite Analyse Diverse ChIPseq Datentypen

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Trennung von embryonalen Maus-Facial Ektoderm und Mesenchym

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Vergleich von Tabakwirtszellprotein Abbaumethoden von Intact Pflanzen oder Blanchieren durch Wärmebehandlung von Extrakten

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...