Die Standardprobenvorbereitung erschwert es, bei Röntgenbeugungsexperimenten von Mikrokristallen ein gutes Signal-Rausch-Signal zu erreichen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Quellen von hintergrundgeformten Kristallen kontrolliert zu reduzieren. Der Einsatz von Stanzgefrierrobotern und KryoTEM-Gittern bietet eine robuste Plattform für die wiederholte Manipulation der Mikrokristalle, die Reduzierung des umgebenden Flüssigkeitsvolumens und eine schnelle Vitrifizierung der Probe.
Die Geschicklichkeit, die für den Umgang mit Gittern erforderlich ist, ähnelt der für die traditionelle Kristallernte. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Bestimmung der anfänglichen Blotting-Parameter mit der Kristallisationslösung, die der Schlüssel zur Reduzierung des Probenverbrauchs ist. Um zu beginnen, richten Sie den automatisierten Tauchfroster gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kühlen Sie ihn.
Kurz vor Gebrauch entladen Sie die cryoTEM-Gitter für 25 Sekunden mit einem Strom von 15 Milliampere und einem Druck von 0,39 Millibar und halten dann die Glühentladungsgitter in einer abgedeckten Petrischale. Stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit der Probenkammer auf 90% und die Löschzeit auf fünf Sekunden ein. Stellen Sie sicher, dass der Tauchfroster so eingestellt ist, dass die Probe nach Abschluss des Löschvorgangs automatisch eingetaucht ist.
Öffnen Sie die Dichtung des Kristallisationsbrunnens und des Reservoirs. Fügen Sie schnell zwei bis fünf Mikroliter der Reservoirlösung in den Kristalltropfen hinzu, um das Volumen des Tropfens zu erhalten. 10 Mikroliter der Reservoirlösung zur späteren Verwendung in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen geben und den Brunnen wieder veralten, um zu verhindern, dass der Kristallisationstropfen austrocknet.
Verwenden Sie die Tauchgefrierzzette, um ein einzelnes Glühentladungsgitter auszuwählen und das Gitter im Instrument zu laden, wobei die Kohlenstoffseite vom Löscharm abwandt. Drehen Sie die Zette, die das Gitter hält, so, dass die Carbonseite dem Löscharm zugewandt ist. Verwenden Sie eine 2,5-Mikroliter-Pipette, um zwei Mikroliter Reservoirlösung auf die nicht unterstützende Seite des KryoTEM-Gitters aufzutragen.
Drehen Sie das Gitter mit der Vom Löscharm weggerichteten Kohlenstoffseite und tragen Sie die Reservoirflüssigkeit vorsichtig auf die Kohlenstofffilmträgerseite des Gitters auf. Initiieren Sie den Blotting-Prozess und beobachten Sie die Flüssigkeit, die von der Kohlenstoffoberfläche gezogen wird, bis die Welle des Knallens über die Oberfläche des Gitters sichtbar ist. Wenn die Popping-Welle nicht sichtbar ist, erhöhen Sie die Löschzeit um ein bis zwei Sekunden, bevor sich der Löscharm aus dem Raster zurückzieht.
Legen Sie die Kristallisationsplatte unter das Lichtmikroskop und positionieren Sie das Ziel gut im Sichtfeld. Legen Sie ein frisches Glühentladungsgitter in den Tauchgefrierschrank und tragen Sie die Reservoirflüssigkeit wie zuvor gezeigt auf die nicht stützende Seite des Gitters auf. Drehen Sie das Gitter mit der Carbonfolienträgerseite zum Probenanschluss des Tauchgefrierschranks.
Schälen Sie die temporäre Versiegelung von der Kristallisationsplatte und verwenden Sie die pipetten gesetzte Pipette, um den Kristallisationstropfen wiederholt sanft anzusaugen. Zwei Mikroliter der abgesaugten Mikrokristallaufschlämmung in den Tauchfroster übertragen und die gesamte Probe auf die Kohlenstoffseite des KryoTEM-Gitters auftragen. Initiieren Sie das Blotting und beobachten Sie die Welle des Knallens, dann leiten Sie sofort das Eintauchen ein.
Übertragen Sie das Gitter schnell vom flüssigen Ethan in die gitterbox, die in flüssigen Stickstoff getaucht ist. Ziehen Sie nach dem Ablöschen und Einfrieren des Gitters das eingetauchte Gitter aus dem flüssigen Ethan zurück, indem Sie den Tauchfroster zurücksetzen. Entfernen Sie die Zette, die das Gitter aus dem Tauchgefrierschrank hält, und legen Sie das Gitter unter das Lichtmikroskop.
Passen Sie den Feinfokus an und beurteilen Sie die Dichte der Kristalle über das Gitter. Nachdem Sie das CryoTEM-Gitter in das REM geladen haben, richten Sie die Probe aus und schalten Sie den Elektronenstrahl ein. Bewerten Sie zunächst das gesamte Raster mit einer 45-fachen Vergrößerung und zeichnen Sie das Bild auf, dann erhöhen Sie die Vergrößerung für eine genauere Betrachtung der einzelnen Gitterquadrate, bis die einzelnen Kristalle deutlich beobachtet sind.
Bewegen Sie sich um das Gitter und erfassen Sie die Standbilder, um sicherzustellen, dass die Gitter flach sind und die Kohlenstoffträgerfolie weitgehend intakt ist. Stellen Sie sicher, dass sich zahlreiche Einkristalle mit einem schmalen Halo aus verglaster Flüssigkeit um den Kristall herum befinden und die Löcher im Kohlenstoffträgerfilm sichtbar sind. Stellen Sie bei der Beobachtung und Aufnahme der Bilder des Gitters sicher, dass die großen Bereiche der verglasten Flüssigkeit fehlen, hexagonales Eis oder Oberflächeneis nicht über das Gitter verstreut ist und dass sich die Kristalle nicht überlappen und gleichmäßig über den Trägerfilm verteilen.
Kühlen Sie in einem großen Schaumstoff-Dewar die erforderliche Anzahl von VMXm-Probenhaltern, die in die Probenkartusche geladen sind. Fügen Sie flüssigen Stickstoff über der Probenposition im Probenlader hinzu. Übertragen Sie die Gitterbox mit mikrokristallbeladenen Gittern schnell in die Gitterkastenmulde am Probenlader und schrauben Sie den Deckel leicht ab, um den Deckel locker und drehbar zu halten.
Heben Sie das Gitter aus dem Rasterkasten und drehen Sie das Gitter, um das Gitter flach auf den Probenhalter zu legen. Legen Sie das vorgekühlte circlip-Werkzeug schnell über das Gitter in der Rasteröffnung und drücken Sie die Taste, um den circlip zu installieren. Fügen Sie flüssigen Stickstoff etwa 1,5 Zentimeter über dem Probenhalter hinzu.
Verwenden Sie die VMXm-Probenzette, um den geladenen Probenhalter vorsichtig anzuheben und wieder in die Probenkassette zu legen. Ersetzen Sie den Deckel der Patrone und stellen Sie sicher, dass der Stift auf der Oberseite der Patrone mit dem Loch im Deckel eingreift. Die Rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen von Mikrokristallen, die auf KryoTEM-Gittern hergestellt wurden, zeigten eine minimale Hintergrundstreuung.
Das Gitter war frei von überschüssiger Flüssigkeit und ein schmaler Flüssigkeitshalos wurde beobachtet, der die Kristalle umgab. Die polyedrischen Kristalle wurden sowohl einzeln als auch in Klumpen beobachtet. Etwas größere Insulinkristalle zeigten auch eine gewisse Verklumpung zusammen mit isolierten Kristallen.
Sehr große Mikrokristalle wurden auch erfolgreich auf KryoTEM-Gittern montiert. Die Löcher in der Kohlenstoffträgerfolie waren deutlich sichtbar, was auf eine starke Blottung hindeutet. Viele Proben erforderten eine weitere Optimierung aufgrund der unterschiedlichen Löschzeit und Konzentration der Mikrokristalle.
Die mit Kristallen überlasteten Gitter verringern die Blotting-Effizienz und mehrere Gitter wurden in einem einzigen Beugungsbild aufgezeichnet. Kurze Löschzeit für hochviskose Kristallisationslösungen kann zu einer zu nassen Probe führen. Bei einer Kristallisationslösung mit niedrigerer Viskosität führt eine kurze Löschzeit zum Diebstahl von Mikrokristallen auf einer Seite der Gitter.
Eine optimale Probenvorbereitung ermöglicht es, die volle Leistungsfähigkeit von VMXm auszuschöpfen, um hochwertige Röntgenbeugungsdaten mit höchstmöglicher Auflösung bei hohem Signal-Rausch-Verhältnis zu sammeln. Die Bestimmung des anfänglichen Blottings einer Kristallisationslösung ist der Schlüssel zur Verwendung einer minimalen Probe. Wenn die Probe sehr begrenzt ist, überspringen Sie die Dichtebewertung.
Letztendlich ist es besser, eine verdünnte Probe zu haben. Diese Proben sind nun bereit für Röntgenbeugungsexperimente an der VMXm Beamline, Mikrokristall-Elektronenbeugung oder fokussiertes Ionenstrahlfräsen vor der Mikro-ED.
