Dieses Protokoll für ein rekombinantes zellfreies Proteinexpressionssystem, allgemein bekannt als pure-System, nutzt Zellkultivierung und Zellreinigung, um die erforderlichen Proteinreinigungen zu rationalisieren. Dies minimiert den Zeit- und Arbeitsaufwand erheblich. Die OnePot-Methode hat sich nicht nur als kostengünstig, sondern auch als zeiteffizient erwiesen.
Es verkürzt die Vorbereitungszeiten von mehreren Wochen auf drei Arbeitstage. Dies macht die ZELLFREIE PURE-Plattform für mehr Labore weltweit zugänglich und hilft, diese wirklich leistungsstarke Plattform für synthetische zellfreie Biologie zu implementieren. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass alle Stämme ihr jeweiliges Protein gut überexprimieren.
Bereiten Sie zunächst die Säule für die OnePot-Proteinreinigung vor, wie im Textmanuskript beschrieben, mit zwei Millilitern Sepharoseharz und laden Sie die Säule dann mit Nickelsulfat auf. Bereiten Sie die Starterkulturen vor, indem Sie 20 Milliliter LB-Medien mit 20 Mikrolitern Ampicillin kombinieren. Fügen Sie 300 Mikroliter des Mediums in 35 Vertiefungen einer sterilen 96 Tiefbrunnenplatte hinzu.
Impfen Sie jeden von ihnen mit seiner jeweiligen Dehnung, mit Ausnahme des Dehnungsfaktors thermo instabil oder EFTU, und versiegeln Sie die Platte mit einer atmungsaktiven Membran. Für die EFTU-Kultur sind drei Milliliter Ampicillin-haltige LB-Medien in einem 14-Milliliter-Kulturröhrchen mit Schnappverschluss zu impfen. Etwa drei Milliliter EFTU-Kultur reichen für eine OnePot-Ausdruckskultur aus.
Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius, während Sie es über Nacht mit 260 Umdrehungen pro Minute schütteln. Am nächsten Tag werden 500 Milliliter LB-Medien und 500 Mikroliter Ampicillin in den sterilen Schalldämpferkolben gegeben. Impfen Sie die OnePot PURE-Kultur mit 1.675 Mikrolitern der EFTU-Kultur und 55 Mikrolitern jeder der Kulturen aus der Tiefbrunnenplatte.
Inkubieren Sie die Kultur für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius mit einem Schütteln von 260 Umdrehungen pro Minute oder bis die optische Dichte der Kultur 0,2 bis 0,3 erreicht. Induzieren Sie die Kultur mit 500 Mikrolitern 0,1 Millimolar IPTG und wachsen Sie für weitere drei Stunden. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius und 3,220 mal G für 10 Minuten und lagern Sie das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung.
Messen Sie am dritten Tag die Mengen an Puffern, die für ihre Reinigung benötigt werden, und fügen Sie TCEP zu allen hinzu, wie im Text angegeben. Lagern Sie die restlichen Puffer ohne TCEP bei vier Grad Celsius für zukünftige Reinigungen. Die geladene Spalte mit 30 Millilitern Puffer A ausgleichen.Nachdem 25 Milliliter Puffer A passiert sind, schließen Sie die Säule von unten.
Tauen Sie die Zellen auf und verwenden Sie eine serologische Pipette, um das Zellpellet in 7,5 Milliliter Puffer A zu resuspendieren.Lyse sie die Zellen mit einer 130-Watt-Sonde. Wenn die Beschallung erfolgreich ist, wird die Lösung dunkler. Achten Sie darauf, die Zellen auf Eis zu halten und die Sonde tief genug zu platzieren, ohne das Röhrchen zu berühren.
Entfernen Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 21,130 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius und halten Sie das Lysat auf Eis. Fügen Sie den Überstand der äquilibrierten Spalte hinzu. Schließen Sie die Säule von oben und stellen Sie sicher, dass keine Leckage vorhanden ist.
Inkubieren Sie die Säule drei Stunden bei vier Grad Celsius unter Rotation mit einem Rohrrotator. Eluieren Sie ungebundene Komponenten aus der Säule und waschen Sie sie mit 25 Millilitern Puffer A.Waschen Sie die Säule mit 25 Millilitern 25 Millimol-Imidazolpuffer. Eluieren Sie die Proteine mit fünf Millilitern 450 Millimolar Imidazol-Puffer und halten Sie die eluierten Proteine jederzeit auf Eis.
Verdünnen Sie das Eluat mit 25 Millilitern HT-Puffer und bewahren Sie die Mischung auf Eis auf. 15 Milliliter in einen 15 Milliliter Zentrifugalfilter geben und auf ein Volumen von 1,5 Milliliter konzentrieren. Die restlichen 15 Milliliter mit der konzentrierten Lösung in den Filter geben und erneut auf 1,5 Milliliter konzentrieren.
10 Milliliter HT-Puffer in die konzentrierte Probe geben und auf einen Milliliter konzentrieren. Gewinnen Sie die konzentrierte Probe zurück und fügen Sie eine gleiche Menge Anratspuffer B hinzu und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Stellen Sie während des Pufferaustauschs die Spalte wie im Text angegeben wieder her.
Messen Sie am vierten Tag die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay. Konzentrieren Sie die Probe mit 0,5 Millilitern drei Kilodalton Cutoff-Zentrifugalfilter auf 20 Milligramm pro Milliliter. Überprüfen Sie die OnePot PURE-Proteinzusammensetzung mithilfe der SDB-Seite.
Verdünnen Sie 2,5 Mikroliter der Probe mit 7,5 Mikrolitern Wasser gemischt mit 10 Mikrolitern von zwei X Laemmli-Puffern und laden Sie dann fünf Mikroliter und 2,5 Mikroliter der Proben auf das Gel. Führen Sie die SDB-Seite wie im Text angegeben aus. Geben Sie die Konzentration und Länge der DNA in den entsprechenden gelben Zellen in der Tabelle mit zwei bis 10 Nanomol DNA für die Reaktion ein.
Füllen Sie das gewünschte Gesamtreaktionsvolumen in Mikrolitern ein. Nehmen Sie die benötigten Reagenzien aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie auf Eis auf. Dann pipettieren Sie die berechneten Mengen an Wasser, DNA und Energielösung auf eine Seite des PCR-Röhrchens oder eine Ecke eines Brunnens auf der 384-Well-Platte.
Die berechneten Mengen an Protein- und Ribosomenlösung werden auf die andere Seite eines PCR-Röhrchens oder die gegenüberliegende Ecke der 384-Well-Platte pipettiert. Drehen Sie sich etwa 30 Sekunden lang, um die Reaktionskomponenten zusammenzuführen. Um die Verdunstung während der Experimente mit dem Plattenleser zu verhindern, fügen Sie 35 Mikroliter flüssiges Wachs hinzu und versiegeln Sie die Platte mit einem transparenten Dichtmittel.
Mindestens drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Für die Anzeige auf einem Plattenleser messen Sie alle zwei Minuten die Blütenstandsintensität bei der erforderlichen Wellenlänge. Die erfolgreiche Überexpression in allen einzelnen Stämmen, die anschließend für die OnePot-Proteinpräparation verwendet wurden, wird hier gezeigt.
Die Gesamtzusammensetzung der endgültigen OnePot PURE Proteinlösung wurde von der SDS-Seite analysiert. Auffällig ist, dass EFTU im Vergleich zu den anderen Proteinen erwartungsgemäß in einer höheren Konzentration vorliegt. Die Syntheseausbeuten der OnePot-Proteinlösung in Kombination mit den His-markierten oder nicht markierten Ribosomen wurden analysiert, indem die eGFP-Fluoreszenz im Laufe der Zeit überwacht wurde.
Die Expressionsniveaus von drei verschiedenen Proteinen, die mit dem Grünen Liste tRNA in vitro Markierungssystem oder Kumasi Färbung markiert wurden, wurden auf einem SDS-Seitengel analysiert. Für ein funktionierendes PURE-System ist es absolut entscheidend, dass alle Stämme ihre jeweiligen Proteine gut exprimieren. Diese Technik erleichtert die Implementierung des PURE-Systems in die biologische Systemtechnik und ermöglicht die Entwicklung neuartiger genetischer Netzwerke, molekularer Diagnostik, Therapeutika und Bildungskits.
