Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 und NIH R56 AI063274 versehen worden

<ol>
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Die Autoren dieses Artikels haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.

Groß Genotypisierung Anwendungen verwendet worden, um den genetischen Mechanismus viele menschliche Krankheiten zugrunde liegen, besser zu verstehen. Die Entdeckung einer signifikanten Variante durch eine genomweiten Assoziationsanalyse kann eine Kandidatenregion für die weitere Untersuchung Flagge. Darüber hinaus ist Genotyp Daten ein gutes Werkzeug für die Qualitätskontrolle auf Sequenzierungsprojekten. Um Probendurchsatz zu maximieren, können mehrere Probenplatten verstärkt und in ihrer fragmentiert, resuspendierten Staaten gespeichert werden. Acht Platten können an einem einzigen Tag verstärkt werden, die Kombination der ersten 24 Stunden des Protokolls für mehrere Chargen und Bereitstellung von genügend Material für ~ 2-8 Tagen Chip-Verarbeitung. Wenn Platten verstärkt werden vorher gehortet, und wenn neue Proben auf Chips hybridisiert sofort nach dem Scanvorgang beginnt mit dem vorherigen Lauf, kann die Verarbeitung kontinuierlich, ohne die Notwendigkeit für zusätzliche Probenvorbereitung Pause laufen. Daher wird zwar Proben drei Tage zu unterziehen die kompletteAssays können Daten täglich erzeugt. Assuming24 Chips werden jeden Tag verarbeitet werden, ermöglicht über ein 1.000 DNA-Proben auf einer 12-Sample-Wulst-Chip ausgeführt werden 5 Tage-Woche. Wenn jeder Schritt oder Reagenz ausgefallen ist, aber mehrere Batches könnte mit einem Risiko für eine schlechte Leistung sein, bevor eine Korrektur angewendet werden kann. Fehler können sich Aufmerksamkeit entgehen, bis die Arrays werden gescannt oder analysiert, daher, wenn der Durchsatz maximiert, Hunderte von Proben in verschiedenen Stadien des Protokolls vielleicht schon das gleiche fehlerhafte Behandlung nach Entdeckung erhielt. Wie verloren Reagenzien und Daten nicht wiederhergestellt werden können, muss der Benutzer diese Risiken gegen die Notwendigkeit einer beschleunigten Workflow wiegen. Die Genome Analyse-Software ist die erste Chance, um wirklich beurteilen den Erfolg der Genotypisierung Prozess. Wenn die Norm-R vs Norm-Theta Intensität Stücke richtig gruppiert sind, sollte die durchschnittliche Anrufrate (Prozent des Gesamt SNPs erfolgreich typisiert) der Proben nähern sich 99%, obwohl dieser Wert variiert slightly je nach Array-Typ. Die Daten von jeder Probe mit einem Anrufrate niedriger als 85-90% ist nicht vertrauenswürdig und muss verworfen werden. Für die Qualitätskontrolle, sollten die Ergebnisse zu allen bisher bekannten Genotypen, wann immer möglich verglichen werden. Wenn keine solche Daten vorhanden sind, ist gewollt Probe Vervielfältigung ein nützliches Werkzeug bei der Überprüfung Platte oder Array-Platzierungen. Diese doppelten Paare sollten auf getrennten Chips, Platten, Chargen, oder Projekte gelegt werden, deren Genotypen bei der Erzeugung überprüft. Während spezifische QC Einschränkungen variieren je nach den Prüfer bevorzugt werden gemeinsame SNP Einschränkungen Beispielaufruf Erfolg, Hardy-Weinberg-Gleichgewicht oder missingness zwischen Fällen und Kontrollen, basiert, während gemeinsame Probe Einschränkungen werden auf Tarife für Gespräche, Mendel Unstimmigkeiten oder Querverweise auf Basis X-Chromosom Heterozygotie der klinischen Daten Geschlecht [13]. Wenn ein Problem auftritt, die Controls-Armaturenbrett, in der Analyse-Suite gefunden wird, kann die eingereicht werdenUnternehmen, um Ursache zu ermitteln. Diese Kontrollen können oft verengen das Thema auf die wahrscheinlichste Schritt oder Reagenzienversagen. Falls SNPs von Interesse sind durch eine Genotypisierung Infinium Experiment gefunden, sollten ihre Intensität Stücke doppelt überprüft in Genome für Clustering Fehler, bevor weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Ein fehlgeschlagener Versuch Infinium Genotypisierung ist wahrscheinlich auf menschliche Verarbeitungsfehler oder schlechte Qualität der eingesetzten DNA. Beispiel Quantifizierung müssen genau und präzise sein. Für beste Ergebnisse, alle Reagenzien hinzugefügt, um jede Probe oder Chip muss an der mit dem Protokoll festgelegten Volumen verzichtet werden. Pipetten sind ordnungsgemäß zu kalibrieren. Reagenzien dürfen nach Ablauf ausgeführt werden und sollte nicht einmal aufgetaut wieder eingefroren werden, mit Ausnahme der RA1 Reagenz. Um mögliche Färbung und Verlängerung Fehler zu minimieren, sollte das Formamid / EDTA-Mischung jeden Monat frisch zubereitet werden. Alle -20 ° C Reagenzien werden in nur manuelle Abtauen Gefriergeräte gelagert werden. Alle Laborgeräte in der st verwendetaining, Erweiterung und Wasch Teile des Protokolls sollten gründlich mit Wasser und einem milden Reinigungsmittel sofort bei Nichtgebrauch ausgespült werden. Die Befeuchtung Stauseen in der hyb Kammer sollte mit einem Reagenzglas Bürste und einem milden Reinigungsmittel gewaschen werden. Die Glasobjektträger mit 10% Bleichmittel gewaschen werden, wie durch ihre Benutzerhandbüchern angewiesen, einmal pro Woche.

Typing Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) ist eine wichtige Methode zur Identifizierung mit der Krankheit assoziiert Risikovarianten. Historisch ist der Umfang der Genotypisierungsanalysen durch die verfügbare Technologie begrenzt. Gelelektrophorese-basierte Genotypisierung Methoden werden in Abtast-und SNP-Durchsatz begrenzt ist [1]. Die Entwicklung dieser Tests können oft arbeitsintensiv sein, die sich auf dem Make-up und Struktur der Region die Variante für die Optimierung Umgebung [1]. TaqMan-Assays Genotypisierung von Life Technologies entwickelt wurde, kann eine große Anzahl von Proben schnell und mit minimalen Beteiligung Techniker laufen [2], aber SNP-Multiplex Einschränkungen weiterhin die Gesamtzahl der Genotypen auf deutlich unter eine Million pro Tag [3,4 begrenzen ]. Sequenoms Iplex Plattform kann auch viele Proben laufen auf einmal, aber, da weniger als hundert SNPs können zusammen gemultiplext werden, ist vergleichsweise geringen Gesamtdurchsatz [5]. Beckman Coulter SNP-Stream-Technologiekönnte theoretisch produzieren mehr als drei Millionen Genotypen pro Tag, aber diese Technik Grenzen Projektbereich zu einem Maximum von nur achtundvierzig SNPs pro Reaktion [4,6]. Während die Goldengate-Test kann fast zweihundert DNA-Proben jeden Tag auf Hunderten oder Tausenden von SNPs pro Probe zu verarbeiten, ist der Preis pro Genotyp nicht wettbewerbsfähig mit erweiterten, ultra-Hochdurchsatz-Techniken bei der Eingabe über dreitausend SNPs auf einmal [4,7 ]. Um mehrere Millionen Genotypen pro Tag verarbeiten, die für große Genom-weite Assoziationsstudien erforderlich Skala, Array-Hybridisierungstests haben sich die kostengünstigste Option auf dem Markt. Affymetrix-Linie von Hybridisierungsarrays und Illumina-Linie von Infinium-basierte Arrays ermöglichen potenziell Hunderte von Proben auf Hunderttausende oder Millionen von SNPs parallel [4,8] eingegeben werden. Diese SNPs können über das gesamte Genom verstreut werden, in Regionen, von Interessen, wie Ex lokalisiertomes oder den Vorlieben des Benutzers angepasst. Diese Arrays haben den Vorteil, nicht nur in der Lage, eine Million SNPs pro Probe genau Genotyp auf einmal, aber auch Kopienzahl Variation zu messen, potenziell Enthüllung Chromosomenanomalien. Infinium ausgerichtet OMNI BeadChip Arrays haben derzeit die Möglichkeit, Genotyp bis zu fast fünf Millionen Marker pro Probe, darunter eine halbe Million individuelle Loci, auf bis zu fast hundert Proben pro Tag. Da die meisten Krankheiten haben eine genetische Komponente, können diese Großversuche entscheidend bei der Suche nach Genen, die mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Hochdurchsatz-Genotypisierung ermöglicht eine effiziente Genotyp Generation in der Probe setzt groß genug, um genetische Assoziation zeugend erkennen zu niedrigeren kleinere Allel-Frequenzen. [9,10,11] Whole Genome Genotypisierung Projekte verwendet werden, um Regionen mit statistisch signifikanten Fall-Kontroll-Allel Frequenz oder Kopienzahl Unterschiede zu lokalisieren. Nach Angaben der Nationalen Menschen Genome Research Institute, führte genomweite Assoziationsstudien, um 1490 getrennte Publikationen zwischen dem 25. November 2008 und dem 25. Januar 2013, die sich aus der Entdeckung von 8.283 SNPs mit einem p-Wert von weniger als 1 x 10 -5 (siehe http:// www.genome.gov/gwastudies/). Diese Studien, die Bedingungen von Höhe zu Hodenkrebs, profitierte von der breiten Ansatz durch eine genomweite Analyse ergab erforscht. In Fällen wie diesen, kann ganze Regionen von Interesse entgangen war der Umfang der Typisierung war zu restriktiv. So kann zum Großverband analysiert, ist eine genomweite Genotypisierung Technik die Technik der Wahl. Verschiedene Versionen des Infinium Assay vorhanden ist, jeweils für die Verwendung mit bestimmten Typen von Arrays bestimmt. Die InfiniumUltra Assay, in der Tiefe unten diskutiert wird, ist angemessen für viele 12 - oder 24-Sample-Array-Chips. Diese oft Genotyp über hunderttausend SNPs pro DNA-Probe und konzentrieren sich auf targeted Regionen, wie auf exome oder benutzerdefinierte Panels. Andere Assay-Versionen können für andere Chiptypen, wie z. B. die Gesamtgenom-Genotypisierung Arrays erforderlich. Da jedoch alle Infinium Assays haben eine gemeinsame Grundlage und unterscheiden sich hauptsächlich nur von den Reagenz-Name, der Reagenzienmengen, oder die genaue Färbereagenz Verfahren, Techniken, die auf einem Test-Version perfektioniert kann oft universell einsetzbar. Andere Felder wie Methylierung Arrays könnte eine nahezu identische Protokoll verwenden, wie gut. Es muss nur genommen die Version des für die Chip-Typ im Einsatz erforderlich Assay werden. Einige Arten, wie beispielsweise diejenigen Messung der Genexpression Ebene könnten die Verwendung eines nonInfinium Protokoll. Die Proben müssen in Chargen verarbeitet werden. Zum Beispiel mit dem InfiniumUltra Assay enthalten Prähybridisierung Reagenzröhrchen genug Volumen zu 96 Proben laufen, und die Rohre können nicht wieder eingefroren werden. Daher müssen Proben in Chargen von 96 Proben zu einem Zeitpunkt ausgeführt werden. Die Proben werden auf den Tannen verstärkt werdent Tag. Nach ca. 1 h Rohbau, müssen die Proben in einem Umluftofen für 20-24 Stunden erhitzt werden. Am folgenden Tag wird fast 4 h ausgegeben werden Fragmentierungs, Ausfällen und Resuspendieren der Proben, an welchem ​​Punkt können die Proben entweder für zukünftige Verwendung eingefroren oder auf dem Chip hybridisiert werden. Lädt Chips dauert fast 2 Stunden, nach dem die Proben über Nacht für 16-24 h hybridisiert werden. Am dritten Tag erfolgt die Färbung und Verlängerungsschritt ~ 4 Stunden. Eine weitere Stunde ausgegeben werden Wasch-, Beschichten und Trocknen der Späne. Schließlich werden die Matrizen gescannt, die 15-60 min / Chip dauern kann, abhängig von der Art verwendet. Standard-Labor Sicherheit und Sauberkeit Vorsichtsmaßnahmen gelten. Obwohl die Amplifikation nicht PCR-basierten, sind separate Arbeitsstationen für Vor-und postamplification Verfahren notwendig, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu minimieren. Die Identifikationsnummer eines jeden Kit gelieferten Reagenzien im Einsatz muss auf einer Tracking-Blatt angemeldet sein. Reagents sollten unmittelbar vor Gebrauch mehrmals vor der Abgabe aufgetaut und umgekehrt werden. Die getippt werden müssen DNA hochwertige genomische DNA (260/280 Absorptionsverhältnis von 1,6 bis 2,0, 260/230 Absorptionsverhältnis von unter 3,0), nach Standardmethoden isoliert und mit einem Fluorometer quantifiziert werden. Abbau von DNA ist oft ein Faktor in geringer Qualität Assay-Ergebnisse. Typischerweise wird 200 ng DNA benötigt wird, obwohl dieser Betrag kann für einige Chiptypen variieren. Ein Tecan Flüssigkeitshandhabungsroboter kann viele Schritte des Protokolls zu automatisieren und menschliche Fehler zu minimieren als Faktor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="477">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:145px;">Consumable or Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Manufacturer&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Part Number&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Minimum Required for 96 Samples</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.8 ml Deep Well Plate</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0765</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Plate Mats</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0674</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Reagent Basin</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-681-502</td>
			<td style="width:113px;">9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat-seal Sheets</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0559</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow-through Spacer</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">NC9563984</td>
			<td style="width:113px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 200 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L200F</td>
			<td style="width:113px;">192</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 10 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L10F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 1,000 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L1000F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">DNA Suspension Buffer</td>
			<td style="width:121px;">Teknova</td>
			<td style="width:99px;">T0220</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.1 N NaOH</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AC12419-0010</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Isopropanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">A451</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">459836</td>
			<td style="width:113px;">330 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Formamide (100%)</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:99px;">C001K38</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">EDTA (0.5 M)</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:99px;">E177</td>
			<td style="width:113px;">0.2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">10 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-10XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">200 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-200XLS</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">1,000 &#956;l Single-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L-1000XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">13500-890</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Refrigerated Microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">BK369434</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">SE-901-1001</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex Microsample Incubator</td>
			<td style="width:121px;">SciGene</td>
			<td style="width:99px;">1057-30-0</td>
			<td align="right" style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex MIDI Heat Block Insert</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-601</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat Sealer</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0384</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hyb Chamber w/ Insert and Mat</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-402</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-804-20</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow Through Assembly Parts</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-202</td>
			<td style="width:113px;">8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Wash Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-450</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Genepaint Chamber Rack</td>
			<td style="width:121px;">Tecan</td>
			<td style="width:99px;">760-800</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Temperature Probe</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">A1-99-109</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Staining Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-207</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Self-Closing Tweezers</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc</td>
			<td style="width:99px;">5374-NM</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Vacuum Manifold</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc&#160;</td>
			<td style="width:99px;">2240</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">iScan or HiScan</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">-</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infinium assay for large-scale snp genotyping applications

Genotypisierung Varianten des menschlichen Genoms hat sich als ein wirksames Verfahren, um genetische Assoziationen Phänotypen identifizieren. Die Verteilung der Varianten innerhalb der Familien oder Populationen kann die Identifizierung der genetischen Faktoren der Erkrankung zu erleichtern. Panel der Genotypisierung BeadChips Illumina ermöglicht Ermittler zu Tausenden oder Millionen von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) Genotyp oder an andere genomische Varianten, wie Kopienzahl, über eine große Anzahl von DNA-Proben zu analysieren. Diese SNPs können über das gesamte Genom verteilt oder in bestimmten Regionen, um potenzielle Entdeckungen zu maximieren richtet sein. Die Infinium-Assay wurde optimiert, um hochwertige, schnell genaue Ergebnisse liefern. Bei richtiger Konfiguration können ein Techniker von einigen hundert bis zu über tausend DNA-Proben pro Woche zu verarbeiten, abhängig von der Art der Anordnung. Dieser Test führt den Benutzer durch jeden Schritt, ausgehend von genomischer DNA und endend mit dem Scannen des Arrays. Mit Anstand Reagents werden Proben verstärkt, fragmentiert, gefällt, resuspendiert, auf dem Chip, um eine einzelne Base, gebeizt erweitert hybridisiert und entweder auf einem iScan oder Hallo Scan hochauflösende optische Abbildungssystem gescannt. Eine Nacht Schritt erforderlich, um die DNA zu amplifizieren. Die DNA wird denaturiert und isotherm durch Amplifikation des gesamten Genoms amplifiziert, daher ist kein PCR erforderlich. Proben werden über Nacht in einem zweiten Schritt auf die Arrays hybridisiert. Am dritten Tag werden die Proben nun gescannt und analysiert werden. Amplifizierte DNA kann in großen Mengen gelagert werden, so dass Perlenanordnungen jeden Tag der Woche verarbeitet werden, wodurch der Durchsatz maximiert wird.

Ein richtig verarbeitet Wulst Chip sollte hell und deutlich roten und grünen Laser-Lichtintensitäten beim Scannen angezeigt. In Abbildung 6 zeigt die iScan Scan-Software eine Standard genomischen DNA-Probe erfolgreich zu einer benutzerdefinierten Bild SNP-Genotypisierung Array hybridisiert. Die markierten Nukleotide, die in den Ausbau und die Färbeschritte befestigt waren fluoreszieren unter den Lichtern der beiden Laser. Da diese Nukleotide selektiv erweitern den Wulst des Oligonukleotid-Kette an die fragmentierte DNA-Strang hybridisiert, und als die Oligonukleotid-Ketten sind direkt an der Stelle der Variante zu beenden, kann die Farbe und die Intensität des sich ergebenden Signals verwendet werden, die an die vorhandenen Allele zu bestimmen, SNP-Stelle. Ein User-generierten Probenblatt, die Proben-IDs und klinische Informationen CHIPID und Lage entspricht, und ein Array-spezifischen SNP manifestieren, direkt von der Firma erhalten, notwendig sind beide um die sca importierennner Ausgabedateien in die Genome Analyse-Software. Beispiel Musterblätter können auf der Website des Unternehmens zu finden. Sobald die Genome Projekt erstellt wird, kann Genotypen aus den resultierenden Intensität Cluster von der Software automatisch generiert erzielt werden. Obwohl mehrere Display-Optionen bestehen, die Standardansicht, Norm-R (eine normierte Intensitätswert) vs Norm-Theta (ein Allel-Intensitätsverhältnis), ist oft die einfachste Handlung zu drei unterschiedliche Cluster unterscheiden. Die meisten SNPs sollte eine, zwei oder drei Gruppen zeigen, abhängig von der Neben Allelfrequenz. Die drei Cluster stellen Proben demonstriert AA, AB oder BB-Allele (siehe Abbildung 7). Diese Cluster können Genotypen entweder, indem Sie eine Standard-Clustering-Position Vorlage direkt aus dem Unternehmen, indem Sie &quot;Cluster Alle SNPs&quot; aus der Symbolleiste Analyse der Software oder durch Klicken und Ziehen Sie die farbigen Kreise auf der Intensitätsgrundstücke manuell edi zugeordnet werden<html> t nennt. Die Farbe der Probe von der Intensität Grundstück (rot, violett oder blau) gibt an, den Anruf (AA, AB oder BB, respectively), schwarz zeigt keine Anruf. Durch Scrollen durch die in der Volldatenbereich der Software aufgeführt SNPs kann das Clustering für jeden SNP angezeigt oder abgerufen werden. Sobald die Cluster zufriedenstellend Anrufe vergeben, wird die Volldatenbereich der Software sind die Genotypen für jede einzelne Probe bei jedem einzelnen SNP. Die Option Spaltenauswahl über der Tabelle können Datenformate umzuschalten. Daten können entweder über die Symbolleiste Analyse oder direkt von der Full Data-Tabelle für eingehende Analyse exportiert werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. Übersicht - Infinium Assay-Protokoll.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> 2. Komplette Hyb Kammerbasis und Matte sowie Deckel. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> Abbildung 3 Laden einer BeadChip -.. Dispense die Probe auf den Einlassöffnungen [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um zu vergrößern</a><html> Bild. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> Abbildung 4 Entfernen der BeadChip Cover -.. Fassen Sie die Dichtung an der Ecke diagonal schälen und sanft [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> 5. Komplette BeadChip Durchflussversammlung - Das BeadChip wird aus einem Glasobjektträger mit einem Abstandshalter getrennt und mit Klammern gebunden.&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> 6. Erfolgreiche BeadChip Scan - A) Die BeadChip ist sowohl mit einem roten und grünen Laser abgetastet, die Scan-Software zeigt beide gleichzeitig. Sections vorbei Intensität QC wird grün auf dem BeadChip Display nach links zu markieren. § § andernfalls Intensität QC wird auf der Anzeige zu markieren BeadChip rot. B) Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, wird die Software die roten und grünen Anzeigen überlagern. Ein vergrößerten Bild gezeigt. Die Farbe und die Intensität der einzelnen Perle zeigt den aktuellen Allel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.wiDünn page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> Abbildung 7. SNP-NORM-R vs NORM-THETA Clusterprofile - A) Eine gültige SNP mit drei verschiedenen Clustern, die AA, AB und BB-Genotypen, rot, lila, blau und b) ein SNP erfordern Bearbeitung.. Die mittlere Cluster, die homozygot AB sein soll, bleibt un-genannt. Die BB-Cluster fälschlicherweise als AB. C) Eine schlechte leistungs SNP. Keine Genotypen können von dieser Intensität Grundstück erhalten werden, da keine unterschiedliche Cluster existieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Ein Protokoll beschrieben, das Illumina Infinium Assays verwendet, um groß angelegte Genotypisierung. Diese Assays zuverlässig Millionen SNPs Genotyp über Hunderte von einzelnen DNA-Proben in drei Tagen. Einmal erzeugt, können diese Genotypen verwendet werden, um für Vereine mit einer Vielzahl von verschiedenen Erkrankungen oder Phänotypen zu überprüfen.

Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

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38.6K Aufrufe.  Oklahoma Medical Research Foundation.  Ein Protokoll beschrieben, das Illumina Infinium Assays verwendet, um groß angelegte Genotypisierung. Diese Assays zuverlässig Millionen SNPs Genotyp über Hunderte von einzelnen DNA-Proben in drei Tagen. Einmal erzeugt, können diese Genotypen verwendet werden, um für Vereine mit einer Vielzahl von verschiedenen Erkrankungen oder Phänotypen zu überprüfen. 

Serie: Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Forschung

Biologie

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafisch-Based In-vivo- Small Molecule-Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Ein halbautomatisches ChIP-Seq-Verfahren für groß angelegte epigenetische Studien

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...