Wir danken J. Sedgewick für die Unterstützung beim Aufbau des konfokalen Mikroskops, um Bilder von Silberkörner erfassen; Unterstützte teilweise durch NIH Forschungsstipendien AI48484 (ATH), AI20048 (RA), und AI066314 (CJM); National Center for Research Resources gewähren. RR00169 (CNPRC, University of California, Davis).

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li et al., Science 323, 1726 bis 1729 (2009)</a> . Kombinierte in situ Tetramer-Färbung und in situ-Hybridisierung (ISTH) Verfahren ISTH Verfahren lassen sich in 4 Stufen eingeteilt werden: 1) IST Färbung von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen im Gewebe; 2) ISH auf Virus-infizierte-RNA + Zellen zu detektieren, 3) konfokale mikroskopische Bildgebung der IST-gefärbten Zellen und Virus-RNA + Zellen; 4) Bildanalyse, einschließlich des Baus von Bildmontagen und Kartierung von Tetramer + und Virus-RNA + Zellen. 1. IST-Färbung von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen in Gewebeschnitten. <ol><li> Cut frische Gewebe in 200 um dicke Schnitte mit einem Vibratom oder Skalpell. </li><li> Gefühlt Vibratom Bad mit sterilem PBS-H und Chill auf 0-2 ° C. Stellen Sie die Vibratom Blattwinkel auf einem ziemlich steilen 27 °. Wann immer möglich, die dem Zellgewebe auf Eis gekühlt, um den Abbau zu minimieren. Frisches Gewebe ist auch leichter zu Abschnitt mit einem Vibratom, wenn es gekühlt. </li><li> Cut Gewebe mit chirurgischer Schere oder Skalpell in kleine ca. 0,5 cm breit und 0,25 cm hoch Stück. Put Gewebestücke in einer wiegen Boot oder Schälchen geben und mit ~ 40 ° C geschmolzen 4% PBS gepuffert niedrig schmelzende Agarose. Stellen Sie sicher, Gewebe in Kontakt mit dem Boden der Schale. Push-Gewebestücke ab, wenn sie schwimmen. Festigen Sie auf dem Eis. Dies dauert in der Regel 3-5 Minuten. </li><li> Coat Vibratom Gewebe-Block mit Loctite Kleber. Cut Agarose um das Gewebe mit dem Skalpell, und dann mit einer Pinzette vorsichtig Übertragung der fragilen Agarose eingebetteten Gewebe zu einem Vibratom Block in Leim bestrichen. Bewegen Sie sich nicht das Stück von Gewebe, wenn es auf das Gewebe Block gesetzt ist. Trocknen lassen ca. 10 Minuten auf dem Eis. </li><li> Berg Gewebe Block in der Vibratom und schneiden das Gewebe in 200um dicke Abschnitte mit einer Toten langsamen Fahrgeschwindigkeit und relativ hoher Amplitude. Geschwindigkeit und Amplitude Einstellungen variieren je nach Vibratom. Wenn ein Vibratom nicht verfügbar ist, oder das Gewebe ist nicht zugänglich Vibratom Schneiden, schneiden Gewebe in dünne Streifen mit einem Skalpell. </li><li> Transfer-Abschnitte mit einem Pinsel in ein Gewebe Kammer in die Vertiefung einer 24-well Zellkultur-Platte mit 1 ml der gekühlten PBS-H gesetzt. Legen Sie bis zu vier Gewebeschnitte in jedes Gewebe Kammer. Beschriften Sie die Deckel der Gewebekultur Platte mit experimentellen Probe Informationen und sichere Deckel auf die Platte mit einem Gummiband. </li><li> Alternativ kann für Gewebe, die nicht schneiden gut mit Vibratom, wie gut, kann geschnitten so dünn wie möglich Streifen mit dem Skalpell oder einer Rasierklinge. Legen Sie nur einen Abschnitt pro Vertiefung für Skalpell Schnitte. </li><li> Gehen Sie zur Färbung unmittelbar nach Abschluss Schneiden Gewebe. Keep Abschnitte gekühlt, um den Abbau zu allen Zeiten zu minimieren, bis fest. Lassen Sie sich nicht Abschnitten austrocknen. Halten Sie Abschnitte in gekühltem sterile PBS-H. </li><li> Inkubieren Gewebeschnitte über Nacht mit 0,5 mg / ml FITC-konjugierten Tetramere. Kann Maus oder Nicht-Kaninchen-Antikörper an extrazelluläre Epitope in dieser Inkubationszeit, zB Anti-CD8-Antikörper, verdünnt 1:200 in Blocking-Lösung gerichtet sind. Verwenden Sie 1 ml Lösung pro Vertiefung für diesen und alle folgenden Inkubationen, und führen Sie diese und alle folgenden Inkubationen bei 4 ° C mit Platten auf einem Schaukelstuhl Plattform. Keep Gewebe Kammern mit verschiedenen experimentellen Proben von mindestens einem leeren getrennt gut, um eine Kreuzkontamination von Lösungen in den nachfolgenden Schritten zu verhindern. </li><li> Nach der Grundschule Inkubation waschen Abschnitte mit gekühltem PBS-H zweimal (2X) für jeweils 20 Minuten. Tun Sie dies durch die Übertragung des Gewebes Kammern auf einen anderen 24-Well-Zellkultur-Platte mit gekühlt PBS-H. Achten Sie darauf, Inhalte aus einer experimentellen Probe in ein anderes tropfen, beim Bewegen Gewebe Kammern. Für alle folgenden Inkubationen und Waschungen ähnlich Transfer des Gewebes Kammern zu einer sauberen Teller mit den entsprechenden Lösung. Monitor-Abschnitte im Gewebe Kammern während Verfahren, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht zu den Seiten des Gewebes Kammern stecken. </li><li> Fix Abschnitte mit frischem PBS gepuffert 4% Paraformaldehyd für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Waschen mit kaltem PBS-H 2X jeweils 5 min. </li><li> Inkubieren mit Kaninchen-anti-FITC-Antikörper, zB Biodesign1: 10.000, in Blocking-Lösung für 1-3 Tage. Für Co-Kennzeichnung können auch Nicht-Kaninchen-Antikörper an intrazelluläre Epitope in dieser Inkubation gerichtet als auch. Für diese Option setzen Epitope, wenn nötig und durchdringen und blockieren die Zellen vor der zweiten Inkubation. </li><li> Bei der Verwendung von Antikörpern an intrazelluläre Epitope, die Antigen-Retrieval verlangen von Formaldehyd Fixierung gerichtet, aussetzen Epitope durch Kochen 3 mal in 0,01 M Urea, jeweils 10 Sekunden Zeit, in der Mikrowelle. Warten Sie 2 Minuten zwischen jeder Heizung. Seien Sie sehr vorsichtig, wie kochende Lösung können die Abschnitte Kraft aus dem Brunnen. Wenn dies geschieht, verwenden Sie einen Pinselzu schieben Abschnitte von den Seiten des Gewebes Kammer oder aus dem Deckel der Platte wieder in den Boden des entsprechenden Gewebes Kammer. Wenn Antikörper nicht verlangen Antigen-Retrieval diesen Schritt auslassen. </li><li> Bei der Verwendung von Antikörpern an intrazelluläre Epitope gerichtet, vor der zweiten Inkubation permeabolize und Block-Zellen in Gewebeschnitten mit PBS-H mit 0,3% Triton X-100 und 2% normalem Ziegenserum für eine Stunde. Führen Sie dann verbleibenden Antikörper Inkubationen in PBS-H mit 0,3% Triton X-100 und 2% normalem Ziegenserum. </li><li> Nach der zweiten Inkubation waschen Sektionen in PBS-H für 20 Minuten bis mehrere Stunden. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wäschen. Führen Sie eine abschließende Inkubation mit entsprechenden fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Zum Beispiel, Ziege Anti-Kaninchen-Cy3 und Ziege anti-Maus-Alexa 488 1:1000 verdünnt jeweils in Blocking-Lösung. Inkubieren 02.59 Tage. Halten Sie Abschnitte von Licht durch das Einwickeln der Platten in Alufolie während dieser Inkubation und danach, wie das Licht löscht Fluorophore geschützt. </li><li> Wash Sektionen in PBS-H für 20 Minuten bis mehrere Stunden. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wäschen. </li><li> Für IST mit ISH post-fix Abschnitte post-fix in 4% Paraformaldehyd für 1 Stunde zu sichern Tetramere und Antikörper in Ort kombiniert, dann spülen Abschnitte mit PBS-H wieder zu montieren. </li><li> Verwenden Sie einen Pinsel, um Abschnitte auf einen Objektträger übertragen. Coat jedem Abschnitt mit Glycerin / Gelatine enthält 4mg/ml n-Propylgallat oder andere Montage Medien mit einem Fluorophor Konservierungsmittel und mit einem Deckglas abdecken. Shop Dias in Licht geschützt schieben Behälter bei -20 °. Rinse-Zellkulturplatten und entfernen Sie Etiketten auf Deckeln mit Alkohol. Kann Platten wiederverwendet werden. </li><li> Analysieren gefärbten Gewebeschnitten mit einem konfokalen Mikroskop. Dann können wir fortfahren, ISH. </li></ol> 2. Detect-Virus-infizierten-RNA + Zellen durch in situ-Hybridisierung. Diese in-situ-Hybridisierung Protokoll wurde von unseren bisher veröffentlichten Protokollen 4,5 wie folgt geändert: <ol><li> Re-cut 5-8 Mikrometer dicke-sectionss aus dickem in situ Tetramer gefärbten Schnitten. <ol><li> 200-Mikron-dick-Abschnitte werden bei 70 ° C für 5 min auf den Abschnitt von der Folie ablösen. </li><li> Der Abschnitt wird dann in OCT auf Trockeneis eingebettet. </li><li> 8-Mikron-Abschnitte werden mit einem Kryostaten von der dicke Schnitte geschnitten und verklebt auf silanisierte Dias. </li><li> Dias können bei -80 ° C in einem verschlossenen Kasten für die anschließende in-situ-Hybridisierung gespeichert werden. </li></ol></li><li> In-situ-Hybridisierung <ol><li> Rehydrieren Gewebeschnitten durch Eintauchen Rutschen für jeweils 3 min in 90% Ethanol und DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Permeabilisieren Gewebeschnitten durch Erhitzen in 10 mM Citratpuffer (pH 6,0) bei 98 ° C in einem Wasserbad für 15 min. </li><li> Coole Gewebeschnitte bei Raumtemperatur für 20-30 min. </li><li> Zweimal waschen in DEPC-behandeltem Wasser für 3 min. </li><li> Acetylieren Gewebeschnitt durch Eintauchen Folien in 0,25% Essigsäureanhydrid in 0,1 M TEA (Triethanolamin, pH 8,0) für 10 min. </li><li> Objektträger in 0,1 M TEA (pH 8,0) für 5 min. </li><li> Hybridisieren Abschnitte zu 35 S-markierten Virus-spezifische (zB HIV-1, SIV) Antisense-Sonde oder Sinn (negative Kontrolle für HIV-1, SIV) oder 35 S-markierten LCMV Ribosonden (gepoolte Sense-und Antisense). </li><li> Wash Abschnitte zweimal mit 2 × SSC für 5 min nach Hybridisierung über Nacht bei 42 ° C. </li><li> Wash Abschnitte in STE (0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) für 5 min. </li><li> Digest Abschnitte mit RNasen A und T1 in STE bei 37 ° C für 30 min </li><li> Wash Abschnitte in 2x SSC plus 50% Formamid für 5 min. </li><li> Wash Abschnitte in 1x SSC 10 min. </li><li> Wash Abschnitte in 0,5 x SSC 15 min. </li><li> Entwässern Sektionen in 70, 80 und 100% Ethanol mit 0,3 M Ammoniumacetat, jeweils 5 min. </li><li> Coat Abschnitte mit Kernspur Emulsion </li><li> Dry in einem dunklen Raum für 1 Stunde. </li><li> Expose Abschnitte bei 4 ° C für 11 Tage (SIV) und 3 Tage (LCMV). </li><li> Entwickeln Sie Abschnitte in D19 (Kodak, Cat # 146 4593) für 3 min, in dH2O 30 Sekunden waschen, in Rapid Fixer fix (Kodak, Cat # 146 4106) für 4 min, in dH2O 5 min x 3-mal waschen. </li><li> Entwässern in 70%, 80% und absolutem Ethanol, jeweils 5 min. </li><li> Berg rutscht in fluoreszierenden kompatibel Permount Medium. </li></ol></li></ol> 3. Erwerben Sie konfokalen Mikroskop Bilder. <ol><li> Erfassen ISTH Bilder mit einer Bio-Rad MRC 1000 Konfokalmikroskop, oder jede andere konfokalen Mikroskop mit EPI2-Blue Reflection Gerät. </li><li> Verwenden Sie Epi1-605 für den roten Tetramer Fluorochrom, EPI2-522 DF32 für die grüne CD8 Fluorochrom und der EPI2-Blue Reflection for Silberkörner (ISH-Signal in den entwickelten radioautographs) bei 20x (für SIV) oder 60x (für LCMV) </li><li> Nacheinander sammeln Z-Serien Bilder in 1-Mikrometer-Abständen in den drei Kanälen der einzelnen Felder. </li><li> Erwerben Sie Bilder von jedem Abschnitt von links nachrechts und oben nach unten, und der Name jedes Bild entsprechend seiner Zeile und Spalte in einer Excel-Datei. </li><li> Erfassen jedes Bild mit einem ~ 20% Überlappung mit den benachbarten Bilder, um Lücken in der rekonstruierten montage Bild zu vermeiden. </li></ol> 4. Bild analysiert: montage Bildrekonstruktion Zelle Schwerpunkt Berechnung und Analyse raumbezogener Daten. <ol><li> Projekt Z-Serien-Bilder in einem einzigen Bild für jeden Kanal mit Confocal Assistant (Version 4.02.). </li><li> Automatisch verschmelzen das projizierte Bild aus drei Kanälen in einem RGB-Bild mit einem Photoshop 7.0 Aktion Verfahren. </li><li> Generieren Sie eine Montage Bild durch Nähen fusionierten Bilder zusammen in Schichten in Photoshop 7.0. </li><li> Assoziierte einzelnen Silberkörner und Tetramer mit Zellen färben, und weisen Sie die X-, Y-Koordinaten der Zentren (Schwerpunkte) des SIV-RNA + und Tetramer + Zellen unter Verwendung MetaMorph (Version 7.1.3.) Oder Photoshop (erhältlich beim Autor) </li><li> Export Schwerpunkt-Daten in Excel-Dateien als numerische Zahlen für jede Zelle. E: T-Verhältnissen aus der Excel-Dateien aus der Gesamtzahl der Tetramer + und virale RNA + Zellen in der Sektion bestimmt. </li></ol> Räumliche Beziehungen zwischen Rot und Blau Tetramer + SIV RNA + Zellen sind durch Kopieren und Einfügen der jeweiligen Grundstücke aus der Excel-Dateien in ein Photoshop-Dokument erfasst. Nach Verringerung der Deckkraft einer Ebene ausrichten und skalieren Sie das Gitter so, dass sie, zusammen Farb-Auswahl und das Kopieren und Einfügen in eine neue Ebene die Positionen des blauen RNA +-Zellen, und legt danach die Schicht verwendet werden, um die Gitter auszurichten, die Positionen der Tetramer + und virale RNA + Zellen in die abgeflachte Bild enthüllt werden. 5. Zusätzliche Hinweise Wenn Schneiden infektiöse Gewebe: Arbeiten Sie in einem BSL2.5 Labor. Besondere Vorsichtsmaßnahmen mit Rasierklingen. Setzen Sie den Rasierer in die Vibratom Sägeblattaufnahme mit einer Pinzette. Wenn Sie sich nicht setzen die Klinge mit einer Pinzette, dann setzte es in vor der Zugabe von Gewebe, das Bad, und ersetzen nicht die Klinge. Wenn Sie fertig sind Schneiden, entfernen Sie die Klinge mit einer Pinzette. Spray Klinge mit 70% EtOH oder DMQ vor der Entfernung. Wie immer, von Blades in einem Entsorgungsboxen entsorgen. Ändern äußeren Handschuhe oder Spülen in Desinfektionsmittel nach jedem Kontakt mit dem Gewebe oder kontaminierte PBS im Tank. Wenn Sie fertig sind, wenn die Arbeit mit infektiösem Material, fügen DMQ Desinfektionsmittel zu PBS in Tank und lassen Sie sich ein paar Minuten vor dem Entfernen. Entsorgen dekontaminiert PBS den Bach runter. Dann spülen Sie den Tank mit Wasser, Salz und Desinfektionsmittel zu entfernen. Saubere Arbeitsfläche und Geräte mit DMQ. Spülen Sie das Geschirr mit Wasser. To Make Tetramere von biotinylierten MHC Monomere: Erhalten biotinylierten MHC Klasse I Moleküle wie HLA-A * 0201 / B 2 m / Peptid-Moleküle mit entweder Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV) oder irrelevant MART-Peptid (ELAGIGILTV) Peptide, die von Beckman Coulter produziert. Biotinylierten HLA-A * 0301 / B 2 m / Peptid-Moleküle mit entweder Gag (KIRLRPGGK) oder Nef (QVPLRPMTYK) am NIAID Tetramer-Anlage produziert. Tetramere werden durch Zugabe von 6 Aliquots von FITC generiert ExtraAvidin (Sigma) an biotinylierte Mamu A * 01 / B 2 m / Peptid-Monomere im Laufe von 8 Stunden, um eine endgültige Molverhältnis von 4,5:1. Die Logik hinter Addition der ExtrAvidin langsam ist, dass während der frühen Zeitpunkten gibt es ein Überangebot an Monomer, dass alle ExtrAvidin bekommt alle vier Biotin Seiten gebunden hinzugefügt versichert. Später in der Reaktion wird dabei weniger effizient, weil es weniger Monomer links und eine größere Chance, dass ExtrAvidin werden nicht alle 4 Standorte gebunden. Wenn hinzugefügt alle ExtrAvidin auf einmal die Reaktion wäre weniger effizient und ExtrAvidin Moleküle müssten nur 2 oder 3 Monomere befestigt.

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	<li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li><li>Qingsheng, L. i., Skinner, P. J., Ha, S. -. J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li><li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue.">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li><li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells.">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li><li>Li, Q. i. n. g. s. h. e. n. g., Estes, J. a. c. o. b. D., Schlievert, P. a. t. r. i. c. k. M., Duan, L. i. j. i. e., Brosnahan, A. m. a. n. d. a. J., Southern, P. e. t. e. r. J., Reilly, C. a. v. a. n. S., Peterson, M. a. r. n. i. e. L., Schultz-Darken, N. a. n. c. y., Brunner, K. e. v. i. n. G., Nephew, K. a. r. l. a. R., Pambuccian, S. t. e. f. a. n., Lifson, J. e. f. f. r. e. y. D., &amp;amp, J. o. h. n. V. C. a. r. l. i. s., Haase, A. s. h. l. e. y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission.">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Da Virus-RNA als Marker für Virus-infizierten Zellen in diesem Bericht verwendet wird, sollten alle Reagenzien vor der Hybridisierung werden RNAase kostenlos. Die in-situ-Hybridisierung hier beschriebene Verfahren wurde geändert, um das Fluoreszenzsignal von in situ-Tetramer-Färbung erhalten. Da die radioautographic Signal von Virus-infizierten-Zellen nachgewiesen durch in situ Hybridisierung ist in einer Tiefe von etwa einem Zell-Durchmesser haben die dicke Schnitte für in situ-Tetramer-Färbung verwendet, um nachgeschnitten werden in 5-8 Mikrometer dicke Schnitte. Diese neuartige Technik der Kombination in situ Tetrameren und in situ-Hybridisierung (ISTH) hier beschriebenen ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung, Kartierung und Analyse der räumlichen Beziehung von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zielzellen. Diese Methode kann angewendet CD8 + T-Zell-basierten Impfstoff zu bewerten und in anderen nicht-Virus-Erreger und Wirt-Interaktionen. Die Bildanalyse hier beschriebene Verfahren kann auch angepasst an die räumlichen Beziehungen von zwei Zellpopulationen Interaktion in situ zu studieren, zB haben wir vor kurzem verwendet den Schwerpunkt Mapping-Verfahren bei der Untersuchung von HIV-1 sexuellen Übertragung in der nicht-menschlichen Primaten-Modell von Simian Immundefizienz Virus-Infektion von Rhesusaffen 6

Lösungen und Reagenzien: <ul><li> PBS-H phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Heparin (100ug/ml oder 18.7U/ml), um RNasen zu verhindern </li><li> RPMI Gewebekultur-Medien mit Heparin (100ug/ml oder 18.7U/ml) zu hemmen RNasen </li><li> 4% niedrig schmelzende Agarose in PBS </li><li> PBS mit 2% normalem Ziegenserum (oder Serum von Spezies, bei denen der Fluorophor konjugierte Antikörper wurden). </li><li> PBS mit 2% normalem Ziegenserum und 0,3% Triton X-100 </li><li> MHC-Klasse-I-Tetramere konjugiert FITC </li><li> Anti-FITC-Antikörper, zB Biodesign Kaninchen-anti-FITC </li><li> Fluorophor konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG, die hochvernetzte adsorbiert auf andere Arten IgG für die Verwendung mit mehreren Kennzeichnung, z. B. Ziege-Anti-Kaninchen-Cy3 hat </li><li> Fluorophor konjugierten Anti-Maus IgG, die hochvernetzte adsorbiert auf andere Arten IgG für die Verwendung mit mehreren Etikettierung </li><li> Frische PBS gepuffert 4% Paraformaldehyd </li><li> 0,01 M Urea </li><li> Glycerol / Gelatine enthält 4mg/ml n-Propylgallat </li></ul> Spezielle Ausrüstung <ul><li> Vibratom </li><li> Skalpell </li><li> Rasierklingen </li><li> Chirurgische Schere </li><li> Loctite Quick Set Sofortklebstoff (Produkt # 46551) </li><li> Zange </li><li> # 2 Kamelhaar Pinsel. Kann trim mit Rasierklinge auf die gewünschte Dicke </li><li> 24-Well-Flachboden-Zellkulturplatten zB Falcon Katalog # 353226 </li><li> Tissue Kammern </li><li> Zinnfolie </li><li> Karton schieben Ordner zB Fisher Katalog # 12-587-10 </li><li> Konfokalmikroskop </li></ul> IST Reagenzien Quick Reference PBS-H (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Heparin) <ul><li> 450 ml 1X PBS </li><li> 50 ml 1X PBS + 10X Heparin </li></ul> 1x PBS + 10X Heparin <ul><li> 500 ml 1X PBS </li><li> 500 mg Heparin-Pulver (gefunden auf Trockenlöschmittel Ablagefach) </li></ul> PBS-H / 2% NGS (normal Ziegenserum) <ul><li> 49 ml PBS-H in Falcon-Röhrchen </li><li> 1 ml NGS (gefunden in 1 ml Aliquots bei -20 Tiefkühler) </li></ul> PBS-H / 2% NGS / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 49 ml PBS-H / 0,3% Triton X-100 in Falcon-Röhrchen </li><li> 1 ml NGS (gefunden in 1 ml Aliquots bei -20 Tiefkühler) </li></ul> PBS-H / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 500 ml PBS-H </li><li> 1,5 ml Triton X-100 (das ist eine dicke Flüssigkeit auf Trockenlöschmittel Ablagen gefunden) </li></ul> 4% LMP Agarose <ul><li> 2 g LMP Agarose Pulver </li><li> 50 ml PBS </li><li> Schütteln, bis gemischt, Mikrowelle bis das Pulver aufgelöst hat. </li></ul> GG-NPG (Glycerin Gelatine mit n-Propyl galate <ul><li> Legen Sie eine Flasche Glycerin Gelatine in 50 Grad Wasserbad schmelzen </li><li> Add 0,06 g Propyl galate (gefunden auf Terris Regal), gut schütteln </li><li> Halten Sie im Wasserbad unter gelegentlichem Schütteln, bis es gelöst. </li><li> Aliquot in 1-ml-Röhrchen (braun-Rohre) </li></ul> 4% Paraformaldehyd <ul><li> 4 g Paraformaldehyd Pulver (auf Trockenlöschmittel Ablagen) </li><li> Setzen Sie ca. 10 ml PBS-H in einem Messzylinder, fügen pf Pulver </li><li> Fügen Sie etwas Wasser bis zum Volumen erreicht etwa 70 ml </li><li> Fügen Sie eine Pipette von NaOH. </li><li> Rühren bis gelöst (in der Regel etwa 20-30 Minuten) </li><li> Add HCl bis pH erreicht zwischen 7-8. </li><li> Bringt Volumen auf 100 ml mit Wasser. </li></ul> Urea 0,01 M <ul><li> 0,3 g Harnstoff (gefunden auf Trockenlöschmittel Ablagen) </li><li> 500 ml Wasser </li></ul>

a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ

Die Zahlen und Standorte von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen bezogen auf die Anzahl und Standorte ihrer infizierten Zelle Ziele wird angenommen, dass kritische Bestimmung Ergebnissen, die von Spiel zu chronischen persistierenden Infektionen. Wir beschreiben hier eine Methode zur Beurteilung der räumlichen und quantitative Beziehungen zwischen Effektorzellen des Immunsystems (E)-Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen und infizierten Ziele (T), die in situ-Tetramer (IST)-Färbung kombiniert, um Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen erkennen und in situ Hybridisierung (ISH) auf virale RNA-+-Zellen in den Geweben, wo der Kampf zwischen Immunabwehr und Infektion erfolgt zu erkennen. Die Kombination von IST-Färbung und ISH, abgekürzt ISTH, ermöglicht die Visualisierung und Kartierung der Standorte von Immun-Effektorzellen und-ziele und einfache Bestimmung von E: T-Verhältnissen. Diese Parameter wiederum können dann verwendet werden, um die Beziehungen zwischen räumlicher Nähe zu bestimmen, und das Timing und das Ausmaß der Immunantwort, Ergebnisse vorherzusagen Anfang Infektion.

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A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Eine Technik, die Kombination von in situ-Tetramer-Färbung und in situ-Hybridisierung (ISTH) ermöglicht die Visualisierung, Kartierung und Analyse der räumlichen Nähe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen, um ihre Virus-infizierte Zielzellen, und die Bestimmung der quantitativen Beziehungen zwischen diesen Immunsystem Effektoren und Targets auf eine Infektion Ergebnisse.

Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

a-technique-to-simultaneously-visualize-virus-specific-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

12.0K Aufrufe.  University of Minnesota. Eine Technik, die Kombination von in situ-Tetramer-Färbung und in situ-Hybridisierung (ISTH) ermöglicht die Visualisierung, Kartierung und Analyse der räumlichen Nähe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen, um ihre Virus-infizierte Zielzellen, und die Bestimmung der quantitativen Beziehungen zwischen diesen Immunsystem Effektoren und Targets auf eine Infektion Ergebnisse.

Serie: A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

Regulatorische T-Zellen: Therapeutische Potenzial zur Behandlung von Transplantatabstoßung und Typ-I-Diabetes

Forschung

Biologie

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...