Die Autoren danken Sophia Fried für die technische Unterstützung. MBS dankt den folgenden Organisationen für ihre Unterstützung der Forschung: Die Israel Science Foundation für Finanzhilfen no.1659/08, 971/08 1503/08 und 491/10, die Ministerien für Gesundheit &amp; Science Zuschüsse Nr. 3-4114 und 3-6540, die Israel Cancer Association durch das Anwesen des verstorbenen Alexander Smidoda und die Taubenblatt Family Foundation für die Bio-Medizin Exzellenz Zuschuss.

1. T-Zell-Transfektion <ol><li> Bereiten Sie die aktivierten Amaxa Nucleofector Lösung durch Mischen des Kits &quot;Nachtrag&quot; Lösung des Nucleofector Lösung. Die aktivierte Lösung kann bei 4 ° C für bis zu drei Monate gelagert werden. </li><li> Wachsen Jurkat-T-Zellen in Kulturmedium [10% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 2 mM L-Glutamin in RPMI]. Optimalerweise sollten die Zellen 1-2 Wochen nach dem Auftauen verwendet werden. Mit Zellkulturen in der logarithmischen Wachstum ist entscheidend für hohe Transfektionseffizienz und das Überleben der Zelle. Alternativ, mit geringfügigen Modifikationen, dieses Protokoll mit primären T-Zellen verwendet werden, wie zuvor 8 beschrieben. Es sollte betont werden, dass die Dauer der Aktivierung von primären T-Zellen ist länger als die von Jurkat-T-Zellen (~ 30 min), montiert ein Mikroskoptisch Inkubation zu verwenden ist, um CO 2, Feuchtigkeit und Temperatur während der gesamten, werden Aktivierung. </li><li> Sammeln Sie 510 × 6 log-Phasen-T-Zellen pro Transfektion in einer 15-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge Zellen für 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur. </li><li> Bei der Zentrifugation Herstellung einer 6-Well-Platte. Füllen man gut für jede Transfektion mit 5 ml Kulturmedium und Pre-Inkubation bei 37 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Rohre aus der Zentrifuge und den Überstand verwerfen. Zellpellet in 1 ml RPMI. </li><li> Zentrifuge Zellen für 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur. </li><li> Während des Laufs wird, bereiten Sie die Transfektion Lösung. In einer Vertiefung einer 96-Well-Platte, mischen aktiviert 100 ul Amaxa Nucleofector Lösung in Stufe 1 mit 5 ug DNA des Plasmids von Interesse Codieren eines fluoreszenzmarkierten Protein hergestellt. Optimalerweise sollte DNA-Konzentration größer als 1 g / ml, um zu vermeiden Verdünnen der Transfektion Lösung. </li><li> Gut mischen durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Nach der Zentrifugation der Zellen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand während alle nicht disturbing das Pellet. </li><li> Pipettieren Sie die DNA / Transfektionslösung zweimal. </li><li> Fügen Sie die DNA / Transfektionslösung dem Pellet. </li><li> Übertragen Sie die Zellen an die Amaxa Küvette. </li><li> Setzen Sie die Küvette in die Amaxa Nucleofector Gerät. </li><li> Verwenden Sie den H-10 Amaxa Transfektion Einstellung für die Elektroporation (für Jurkat) oder T-23 (für die primäre T-Zellen). </li><li> Entfernen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator. </li><li> Nach der Elektroporation wurden sorgfältig den Überstand mit der Zellsuspension in den 6-well-Platte mit einer Pasteurpipette. Ein Pellet aus Zelltrümmern bilden. Vermeiden Sie die Übertragung der Pellets. </li><li> Inkubieren der Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Übertragen 2,5 ml Zellsuspension aus jeder Vertiefung in eine neue gut. Fügen Sie 2,5 ml warmem Kulturmedium (siehe Schritt 2) in jede Vertiefung. </li><li> Nach 72 h, übertragen die Zellen in ein steriles Röhrchen und zentrifugieren 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und ersetzen Sie es with Kulturmedium mit der Säugetierzelle Selektionsantibiotikum die für das verwendete Plasmid (Anwendung einer geeigneten Konzentration der Antibiotika, verwendeten wir G418 und / oder Hygromycin in Konzentrationen von 1,3 mg / ml und / oder 0,2 mg / ml) ergänzt. Kultur die Zellsuspension in einem frischen gut. Alternativ können Zellen, die transient transfiziert und 48 abgebildet h nach der Transfektion. Transient transfizierte Zellen herzustellen, Co-Transfektion der Zellen mit den beiden Plasmiden gleichzeitig mit Schritt 8 fortgesetzt normalerweise zu Schritt 20, und fahren direkt mit Schritt 23 fort. Man beachte, dass in diesem Fall wird die Zellen sofort verwendet werden, und in der Regel ihre Fluoreszenzintensität ist heterogen und nicht notwendigerweise hoch. </li><li> Wachsen die Zellen mit Kulturmedium mit der entsprechenden Auswahl Antibiotikum ergänzt. Teilen Sie die Zellen und ergänzen sie mit Antibiotika ergänzt Kulturmedium nach Bedarf. </li><li> Nach 2 Wochen, ob erfolgreiche Transfektion mit dem Einsatz von FACS (Grippeorescence-activated cell sorting) wie folgt: </li><li> Sammeln 10 6 transfizierten Zellen 10 6 mock-transfizierten Zellen (negative Kontrolle) und 10 6 Zellen, die bekanntermaßen stabil exprimieren fluoreszenzmarkierten Proteins. Wenn Zellen mit mehr als einem fluoreszierenden Protein (siehe Schritt 27), transfiziert werden, verwenden mehrere, einzeln markierten Zelllinien als positive Kontrollen. </li><li> Zentrifuge Zellen für 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand verwerfen. Die Zellen in 500 ul FACS-Puffer (PBS w / o Ca 2 + und Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% Natriumazid). </li><li> Mit einer analytischen FACS, um zelluläre Fluoreszenz überprüfen. Vergleichen der Fluoreszenz der transfizierten Zellen mit dem der negative und positive Kontrollen. </li><li> Um die Zellen mit einem zusätzlichen, fluoreszenzmarkierten Protein, wiederholen Sie die Schritte 3-26 mit den transfizierten Zellen transfiziert. </li><li> Zellen, die hohe Niveaus der Fluoreszenz verwendet werden. Optimalerweise mindestens 50%die Zellen in der Kultur sollte stark fluoreszierend. Handy Fluoreszenz kann durch Zellsortierung via FACS erhöht werden. </li></ol> Etwaige zusätzliche markierte Proteine ​​müssen unterschiedlichen Fluorophoren fusioniert werden und auf Plasmiden für verschiedene Selektionsantibiotika codiert werden. Selektionsmedium für Zellen mit mehr als einem Plasmid transfiziert ist mit allen geeigneten Antibiotika ergänzt werden. 2. T-Zell-Spreading Assay Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie Lab-Tek II Deutsch Deckglas System 4 Kammer-Objektträgern. Achten Sie darauf, nicht versehentlich zerkratzen die innere Oberfläche der Kammern, mit einer Pipettenspitze zB während der Herstellung oder Verwendung. </li><li> Bereiten 50-ml Objektträgervorbereitung Lösung: Nehmen Sie 4,6 ml 12 M (37%) HCl, fügen 38,5 ml 100% Ethanol und 6,9 ml doppelt destilliertes Wasser. </li><li> Füllen Sie jede Kammer der Rutsche mit 500 ul Objektträgervorbereitung Lösung. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Saugen Sie die Kammers, Trocknen sie vollständig. </li><li> Inkubieren Sie die unbedeckten Folien für 1 Stunde bei 45 ° C bis vollständig trocken. </li><li> Bereiten 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung durch Verdünnen 0,1% Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) in doppelt destilliertem Wasser. </li><li> Bewerben 500 ul zu jeder Kammer. </li><li> Den Objektträger für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie die Kammern, Trocknen sie vollständig. </li><li> Inkubationszeit von 3 h bei 45 ° C bis vollständig trocken. </li><li> Beschichtete Objektträger gespeichert für mehrere Monate bei Raumtemperatur trocken sein. </li><li> Bereiten Sie eine aktivierende Antikörper-Lösung. Verwenden Sie ein Anti-CD3-Antikörper: entweder HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) oder UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 ug / ml in 400 ul PBS pro Kammer. Diese Lösung sollte kurz vor der Präparation der Objektträger hergestellt werden. </li><li> Füllen Sie jede Kammer mit 400 ul des aktivierenden Antikörper-Lösung. </li><li> Den Objektträger für 2 Stunden bei 37 ° C oder, vorzugsweise, über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die aktivierende Antikörper solution und sofort abwaschen die Kammer zweimal mit 300 ul PBS. Ab diesem Zeitpunkt sicher, dass die Kammern mit Puffer gefüllt bleiben. </li><li> Bewahren Sie die PBS-gefüllten Folie bei 4 ° C. Wir empfehlen die Verwendung der vorbereiteten Objektträger Kammern innerhalb 1 Woche. </li></ol> 3. T-Zell-Aktivierung und Imaging <ol><li> Bereiten Bildgebung buffer [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml FCS, 38.75 ml RPMI ohne Phenolrot]. Imaging-Puffer bei 4 ° C nach der Filtration gespeichert werden. </li><li> Aktivieren Sie die Zeiss LSM 510 Meta Mikroskop. Halte das Mikroskop beheizbare Einbaurahmen bis 37 ° C. Wählen Sie &quot;Expert-Modus&quot;. </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Acquire&quot; und öffnen Sie die folgenden Registerkarten: Laser; Mikroskopie; Konfiguration; Scan; Time Series. </li><li> Aktivieren Sie die benötigten Lasern. Zur Anregung von MCFP und mYFP setzte der Argon / 2 Laser auf &quot;Standby&quot; für 5 min, dann auf &quot;on&quot;. </li><li> Wenn Sie diesen Live-Cell-Imaging-Test vor durchgeführt haben, mit den gleichen Fluorophoren, öffnen Sie die resultierende LSM-Datei, klicken Sie auf die &quot;Wiederverwendung&quot; icon, und von Schritt 9 fort. Andernfalls mit Schritt 6 fort. </li><li> Definieren Kanäle mit Filter geeignet für die Anregung und Emission der fluoreszierenden Proteine ​​verwendet. </li><li> In der &quot;Scan Control&quot; Fenster wählen Sie die Option Z-Stack. </li><li> Geben Sie die folgenden Scan-Parameter: Anzahl der Scheiben: 5; Intervall: 0,5 um; Aktuelle Scheibe: 3. </li><li> Bereiten Sie eine Accublock Digitale Dry Bath (Labnet) bei 37 ° C in der Nähe des Mikroskops. </li><li> Wärmen Sie die Imaging-Puffer auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie das gespeicherte Bild durch Absaugen des PBS, und ersetzt sie mit 600 ul Puffer warmen Bildgebung. </li><li> Den Objektträger bei 37 ° C Halten Sie die Folie in den Inkubator, bis Stufe 13, für mindestens 15 min. </li><li> Sammeln Sie 5 x 10 5 transfizierten T-Zellen. </li><li> Zentrifuge Zellen für 2 min bei 400 × g. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 1 ml warmen Imaging-Puffer, und übertragen Sie sie auf einer 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Legen Sie die test Rohr auf der Accublock Digitale Dry Bath. </li><li> Nehmen Sie die erwärmte Folie aus dem Inkubator und klebe sie auf die erwärmte Mikroskop Einbaurahmen. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;VIS&quot;-Symbol. </li><li> Mischen Sie die Zellsuspension und entfernen 1-2 ul. </li><li> Legen Sie die Spitze der Pipette in das abbildende Puffer über dem unteren Rand der Folie. Vermeiden Sie ein Verkratzen der Folie. </li><li> Seed die Zellen gegenüber dem Ziel der Öffnung. </li><li> Sofort beginnen visuell Verfolgung der fluoreszierenden Zellen, wie sie absteigen. Markieren Sie eine Zelle, die eine hohe Fluoreszenz zeigt in beiden Kanälen. </li><li> Bevor die Zelle erreicht die Oberfläche der Folie, aktivieren Sie die LSM-Modus. </li><li> Sehen nur ein Anregungslaser. Wählen Sie einen Laser, für die Sie eine DIC-Kanal. </li><li> Set Zoom auf 1 setzen. Klicken Sie auf die &quot;Fast XY&quot;-Symbol. Klicken Sie auf das Symbol &quot;Stop&quot;. Mit dem Crop-Werkzeug, wählen Sie eine ROI auf die Zelle zentriert. </li><li> Set Zoom bis 3. Klicken Sie auf die &quot;Fast XY&quot;-Symbol und dann manuell den Fokus optimal sehen die Zelle. Klicken Sie auf &quot;Stop&quot; icon. </li><li> Sehen alle benötigten Anregungslaser. </li><li> Starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf das &quot;StartT&quot;-Symbol. Bild der Zelle für die Gesamtheit der Ausbreitung Verfahrens (üblicherweise 5 min). Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf das Symbol &quot;Stop&quot;. </li><li> Speichern Sie die Datei. </li><li> Um zusätzliche Zellen zu erwerben, klicken Sie auf &quot;VIS&quot;-Symbol. Wenn es Zellen, die noch nicht in Kontakt mit dem Schlitten hat die unten kommen, aus dem Schritt 23 fort. Vermeiden Bildgebung von Zellen, die bereits die Verbreitung Prozess begonnen haben. Ansonsten gehen Sie zu Schritt 32. </li><li> Wenn die beobachteten slide Bereich ist meist frei von Zellen, fügen Sie eine weitere Teilmenge von Zellen (weiter bei Schritt 20). Ansonsten gehen Sie zu Schritt 33. </li><li> Um zusätzliche Zellen erwerben, bewegen Sie den Schieber, so dass der Bereich oberhalb des Objektivs Öffnung frei von Zellen ist. </li><li> Einen weiteren hinzufügen Aliquot von Zellen (und fahren Sie mit Schritt 20). </li><li> Nach Durchführung aller die gewünschte Bildgebung, öffnen Sie eine gespeicherte Datei LSM. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Galerie&quot;, &quot;Zeit + Z&quot; und &quot;Subset&quot;. </li><li> Wählen Sie die Relevantent Zeitbereich und Z-Stack. </li><li> Speichern Sie die neue Datei. </li><li> Führen Sie die Schritte 35-38 für alle Imaging-Dateien. </li></ol> 4. Imaging Data Analysis <ol><li> Öffnen Sie die Dateien mit Imaris LSM Software (Bitplane AG, Zürich Schweiz). </li><li> Klicken Sie auf &quot;übertreffen&quot;. Klicken Sie auf &quot;Image Processing&quot;-Menü und wählen Sie &quot;Wechseln von Zeit und Z&quot;. Dies wird in den richtigen Beschneiden des Bildes zu unterstützen. </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Bearbeiten&quot;-Symbolleiste, und wählen Sie die &quot;Crop 3D&quot;-Option aus dem Dropdown-Menü. Das Bild zuschneiden, um nur die Umgebung der Zelle gehören. Wir schlagen vor, Zuschneiden eines 300 × 300 Pixel Platz auf der Zelle zentriert. Beachten Sie, dass die Form und Lage der Zelle mit der Zeit ändern. Die Beobachtung der t-Achse, stellen Sie sicher, dass die Zelle in der Region zugeschnitten ist zu allen Zeitpunkten. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Image Processing&quot;-Menü und wählen Sie &quot;Wechseln von Zeit und Z&quot;, um die ursprüngliche zeitliche Trennung des Bildes wiederherzustellen. </li><li> Drücken Sie die &quot;Coloc&quot;-Taste auf der Haupt-Symbolleiste. Wählen Sie &quot;Bauzeit Dep. Coloc &quot;. Imaris berechnet automatisch Intensität Schwellenwerte für jeden Kanal zu jedem Zeitpunkt. </li><li> Sehen Sie sich die Ergebnisse der Kolokalisationsanalyse indem Sie &quot;Channel Statistics&quot;. Exportieren Sie die Daten, indem Sie auf &quot;Export&quot;. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 6 für jeden abgebildeten Zelle. Es empfiehlt sich, mindestens 50 Zellen in dieser Art und Weise analysiert werden. </li><li> Berechnen Sie den Mittelwert Pearson Kolokalisation Koeffizienten und deren Standardfehler oder Abweichung. </li></ol>

<ol>
	<li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+and+T+cell+development.">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li><li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity.">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li><li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+tumour+antigens:+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer.">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li><li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition.">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li><li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation.">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li><li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network.">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton.">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li><li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosines+113,+128,+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity.">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li><li>Wunderlich, L., Farag&#243;, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes.">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li><li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization.">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization.">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li><li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).</li></ol>

Wir haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Die Regulation und Funktion von mehreren zellulären Prozessen abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Interaktionen. Mikroskopische Bildgebung ermöglicht die Echtzeit-Tracking von fluoreszierend markierten Proteinen in lebenden Zellen. Kolokalisation markierter Proteine ​​deuten auf eine direkte oder indirekte Wechselwirkung zwischen den Proteinen und kann verwendet werden, um Erkenntnisse durch biochemische Methoden wie Immunpräzipitation erhalten verstärken. Im Gegensatz zu biochemischen M...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti CD3 (UCHT1 clone)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300432</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon FACS Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>345810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German coverglass system 4 chamber slides</td>
			<td>Lab-Tek II</td>
			<td>155382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Bio Lab</td>
			<td>8410501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-380-306</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accublock digital dry bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>D1105A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S</td>
			<td>PeCon</td>
			<td>130-800-031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>411860-9010-000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence activated cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>FACSVantage SE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>7.0.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

Schutz gegen Infektionskrankheiten durch das Immunsystem vermittelt 1,2. T-Lymphozyten sind die Master Koordinatoren des Immunsystems, der Regulierung der Aktivierung und Antworten mehrerer Immunzellen 3,4. T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Erkennung von Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) angezeigt. Die T-Zell-Antigen-Rezeptor (TCR) ist spezifisch für jedes T-Zell-Klon und bestimmt Antigenspezifität 5. Die Bindung des TCR auf das Antigen induziert die Phosphorylierung von Komponenten des TCR-Komplexes. Um den T-Zell-Aktivierung zu fördern, müssen dieses Signal von der Membran in das Zytoplasma und den Zellkern transduziert Einleiten verschiedenen entscheidenden Reaktionen wie Einstellung der Signal-Proteinen an die TCR; APC Website (Immunsynapse), deren molekulare Aktivierung Zytoskelett-Umlagerung Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration, und Veränderungen in der Genexpression 6,7. Die richtige initiation und Beendigung der Aktivierungssignale ist entscheidend für die entsprechenden T-Zell-Reaktionen. Die Aktivität der Signalproteine ​​ist abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, posttranslationale Modifikationen wie Protein-Phosphorylierung die Bildung von Protein-Komplexe, Protein Ubiquitin und die Rekrutierung von Proteinen an verschiedenen zellulären Seiten 8. Das Verständnis, das Innenleben des T-Zell-Aktivierung ist entscheidend sowohl für die immunologische Forschung und klinische Anwendungen. Verschiedene Tests wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, aber biochemische Assays, wie dem weit verbreiteten Co-Immunopräzipitation Methode nicht zulassen Protein Lage zu sein, erkannt und somit auch keine Beobachtung wertvolle Einblicke in die Dynamik zellulärer Mechanismen. Zusätzlich können diese Masse Assays kombinieren üblicherweise Proteine ​​aus verschiedenen Zellen, die möglicherweise in verschiedenen Stadien der ter untersucht zellulären Prozess. Dies kann sich nachteilig auf die zeitliche Auflösung. Die Verwendung von Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen ermöglicht sowohl die räumliche Verfolgung von Proteinen und die Fähigkeit, zeitlich zwischen Signalwege zu unterscheiden, damit Licht auf die Dynamik des Prozesses 9,10. Wir stellen ein Verfahren zur Echtzeit-Bildgebung von Signalisierungs-Komplexbildung bei T-Zell-Aktivierung. Primären T-Zellen oder T-Zell-Linien, wie Jurkat sind mit Plasmiden, die für Proteine ​​von Interesse fusioniert an monomeren fluoreszierenden Proteine ​​transfiziert verhindert unphysiologische Oligomerisierung 11. Live-T-Zellen werden in einem Deckglas vorbeschichtet mit T-Zell-aktivierende Antikörper 8,9, die dem CD3/TCR Komplex bindet und induziert T-Zell-Aktivierung unter Überwindung der Bedarf an speziellen aktivierende Antigene fallen gelassen. Aktivierten Zellen werden ständig mit der Verwendung der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Imaging Daten werden analysiert, um quantitative Ergebnisse, wie die Ausbeute colocalization Koeffizient der Signal-Proteinen.

Wir präsentieren ein Beispiel für Live-T-Zell-Bildgebung und Analyse. Vor dem Imaging Experiment wurden SLP76 defizienten T-Zellen (J14) mit der Verwendung von FACS auf die Expression der fluoreszierenden Proteine ​​(Abbildung 1) zu bestimmen, analysiert. T-Zellen mit den markierten Signalproteine ​​MCFP-Nck und SLP76-mYFP transfiziert wurden Aktivieren Folien aufgebracht und abgebildet während T-Zell-Spreizung (Abbildung 2). Gesammelte Bilder zeigen die Dynamik von Protein-L...

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Echtzeit-Live-Bildgebung der Bildung von T-Zell-Signalkomplexen | Immunologie und Infektion | Video

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

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13.6K Aufrufe.  Bar-Ilan University. Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Serie: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Real-time Imaging von Leukotrien B 4 Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Simultane Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Excision Kreis (TRECs) und K-Löschen Rekombination Excision Kreis (KRECs) durch Echtzeit-PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...