Diese Prüfung wurde von den National Institutes of Health gewährt, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, Hirschl Karriere Scientist Awards zu BKC und von der NSF Center for Biophotonik Science and Technology, Cooperative Agreement PHY012099 und ein UCD Health System Research Award an TH unterstützt UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al Wissenschaft 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. Überblick Zell-Zell-Ausbreitung von HIV wurde ursprünglich beschrieben mit HIV infiziert Jurkat-Zellen als Spenderzellen und primäre CD4 + T-Lymphozyten als Akzeptor Zellen 1,2,3. In diesen Studien wurde das Virus in fixierten Zellen mittels Antikörper-Färbung festgestellt. So verfolgen die Übertragung des Virus von Zelle zu Zelle in lebenden Zellen, nutzen wir ein rekombinanter, infektiöser molekularer Klon von HIV genannt HIV Gag-iGFP 4. Es trägt das grün fluoreszierende Protein (GFP) intern in die Gag-Protein zwischen den MA und CA-Domains eingeführt. Dieser molekulare Klon von HIV behält Infektiosität ohne die Notwendigkeit für Helfervirus. Viruspartikel aus diesem Klon gemacht werden stöchiometrisch mit dem grün fluoreszierenden Protein geladen und bietet eine starke Fluoreszenz-Signal auf virale Montage und zwischen Zellen zu überwachen. Wenn in Verbindung mit inerten Zell-Tracking Fluoreszenzfarbstoffen, Empfänger-Zellen können aus Eingangs-Spenderzellen diskriminiert werden, und so dass man für die Übertragung von HIV von einer infizierten T-Zellen zu einem nicht infizierten T-Zelle 5 zu visualisieren. Virologische Synapsenbildung und Übertragung des Virus von einer Zelle zur anderen kann dann in lebenden Zellen beobachtet werden, während sie in einem verschlossenen, gasdurchlässige Bildgebung Kammer kultiviert werden. (Tag 1) 2. Vorbereitung von HIV Gag-iGFP transfizierten Jurkat T-Zellen <ol><li> Bereiten Sie die menschlichen CD4 + T-Zelllinie Jurkat (ATCC, Manassas, VA) durch eine sorgfältige Pflege der Zellen bei einer Konzentration zwischen 2 x 10 5 und 8 x 10 5 Zellen / ml in Jurkat Kulturmedien (RPMI 1640, 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / mL Streptomycin). Der Schlüssel zum Erfolg: Kultur der Jurkat-Zellen bei Konzentrationen von über 8 x 10 5 Zellen / ml wird in einer Verringerung der Transfektionseffizienz führen. Hinweis: Die Transfektion von HIV Gag-iGFP Provirus-DNA in T-Zellen, wie unten beschrieben, führt zur Produktion von ein Replikations-kompetenten humanen Immundefizienz-Virus. Als solche sind alle Verfahren, die nur von geschultem Laborpersonal in zertifizierten Sicherheitsstufe 2 + oder Biosicherheitsstufe 3 (BL2 + / BL3) Gewebekultur Zimmer vorgenommen werden. Arbeiten mit infektiösen HIV in bildgebenden Einrichtungen muss von Ihrem lokalen institutionellen Biosicherheit genehmigt werden. </li><li> Transfizieren die Jurkats mit der viralen Plasmid, HIV Gag-iGFP mit dem Amaxa Nukleofektion Methode (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 150 x g. Saugen Sie den Überstand und die Zellen in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Zentrifugieren Sie die Zellen und das Pellet zu 97 ul vorgewärmtes, Nucleofector Lösung V mit dem Hersteller zu ergänzen. Fügen Sie drei ul von Endotoxin kostenlose HIV-Gag-iGFP Plasmid (1 pg / mL) zu der Zellsuspension und vorsichtig mischen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Küvette und nucleofect mit dem Programm S-18. Sofortüberweisung die Zellen 3 ml vorgewärmtem Jurkat Kulturmedien ohne Antibiotika. </li><li> Zur Vorbereitung CD4 + Zielzellen für die virologische Synapsen, erhalten wir humanen peripheren mononukleären Zellen aus Buffy Coats mit Hilfe eines Standard-Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Schweden)-Protokoll. CD4 + T-Zellen werden dann negativ gewählt mit Hilfe eines magnetischen Beads Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Diese können kryogen in flüssigem N2 in Aliquots von 5 x 10 6 cells/500 ul des Einfrierens Medien (90% fötalem Rinderserum serum/10% DMSO) gespeichert werden. Aufgetaut primären CD4 + T-Zellen werden in RPMI 10% FBS, mit 10 Einheiten / ml IL-2 kultiviert. </li></ol> (Tag 2) 3. Rückgewinnung von lebenden Zellen aus Jurkats mit HIV Gag-iGFP und Färbung der Zielzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen Transfizierte <ol><li> Lassen Sie die Jurkat-Zellen aus der Transfektion über Nacht erholen. Dann entfernen Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation über einen Ficoll Hypaque Dichtegradienten Material. Dispense 1,5 ml Ficoll-Paque, um den Boden eines 15 ml konischen Rohr. Gently Overlay dieses Gefälle Material mit den transfizierten Jurkats in einer 5-ml Volumen RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 xg für 20 min bei Raumtemperatur mit der Bremse ausgeschaltet. Entfernen Sie vorsichtig die Zellen aus dem media / Ficoll-Schnittstelle mit einer Pipette. Übertragung auf einen neuen 15 ml konischen Rohr. Verdünnen Sie die Zellen mit RMPI auf ein Gesamtvolumen von 15 ml und bei 300 g zentrifugiert für 10 min. Das Pellet in 3 ml Jurkat Kulturmedien in einer 2 cm gut (6-Well-Platte) und geben die Zellen der Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Zur Unterscheidung Zielzellen von Spenderzellen in Zell-Zell-Transfer-Experimenten haben wir prelabel der CD4 + Zielzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen. Primäre CD4 + T-Zellen sind die sogar alsIng. vor dem Gebrauch. Wir haben ausgezeichnete Erfolge Kennzeichnung T-Zellen sowohl mit CellTracker und CellTrace Farbstoffe (Invitrogen, Carlsbad, CA) hatte. Während der Farbstoffkonzentration und Inkubationszeiten müssen optimiert, je nach den besonderen Farbstoff und Zelltyp verwendet werden, folgt eine repräsentative Protokoll. Pellet 4 x 10 6 primären CD4 + T-Zellen durch Schleudern bei 400 xg für 10 min. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS resuspendieren und in 2 ml PBS. Add CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) auf eine Endkonzentration von 1,5 um und bei 37 ° C für 20 min. 8 ml komplette Jurkat Medien und Zentrifuge bei 400 xg für 10 min. Resuspendieren der Zellen in 3 ml komplettem Medium mit 10 Einheiten / ml IL-2 und in der Gewebekultur-Inkubator über Nacht ergänzt. </li></ol> (Tag 3) 4. Überwachung Zell-Zell-Transfer von HIV Gag-iGFP mit Live Cell Imaging Wir verwenden routinemäßig HIV Gag-iGFP transfizierten Jurkat-Zellen 48 Stunden nach der Transfektion. Allerdings haben wir erfolgreich Zellen bereits nach 24 Stunden benutzt, und so spät wie 72 Stunden nach der Transfektion. <ol><li> Etwa 48 Stunden nach der Transfektion werden HIV Gag-iGFP Ausdruck Jurkats gezählt, gewaschen mit CO 2-unabhängigen Medien (Invitrogen, Carlsbad, CA), und erneut im Live Cell Imaging Medien (CO 2 unabhängige Medien, 10% fötalem Rinderserum, 100 U / mL Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, 10 Einheiten / ml IL-2) in einer Konzentration von 1-3 x 10 7 Zellen / ml. </li><li> In ähnlicher Weise, waschen und resuspendieren markierte primäre CD4 + T-Zellen bei einer Konzentration von 1-3 x 10 7 Zellen / ml im Live Cell Imaging Medien. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP-transfizierten Jurkats mit primären CD4 + T-Zellen bei einer 1:2 oder 1:3 Verhältnis und Last in einer Gewebekultur behandelt, gasdurchlässigen, Mikrokammer (ibidi, Verona, WI). Zum Beispiel, mix 20 ul von HIV Gag-iGFP transfizierten Jurkats mit 40 ul der markierten primären CD4 + T-Zellen. Legen Sie 50 ul dieser Mischung in ein ibidi Kammer und Dichtung der Kammer mit Steckern. Sichern Sie den Stecker durch Umwickeln der Stecker / ibidi Kammer-Schnittstelle mit Parafilm. </li></ol> 5. Überlegungen für die Mikroskopie Plattformen: Spinning-Disk-konfokale Abbildung Nach dem Laden eines ibidi Bildgebung Kammer mit Zellen, haben wir sofort Montieren Sie das Gerät auf einer invertierten optischen Mikroskop (IX71 Olympus, Center Valley, PA). Die ibidi Kammer sollte das Mikroskop nur durch BL2 +-qualifiziertem Laborpersonal Tragen geeigneter Schutzkleidung übertragen werden. Obwohl live-cell imaging häufigsten verwendet teure Inkubationskammern, um eine stabile 37 ° C Umgebung zu erhalten, diese wurde mit einer einfachen und kostengünstigen Thermostat Heizung (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) zusammen mit einem T-Typ Thermoelement Spitze montiert neben die Probe für die richtige Temperatur Feedback. Wir haben festgestellt, mit CO 2-unabhängigen Medien uns zu hohen Zellvitalität zu halten bei gleichzeitiger Vermeidung der Verwendung eines CO 2-Kammer ermöglicht. Um die Plattform gegen Temperaturschwankungen im Raum Puffer und zu blockieren, die Hintergrund Licht ausgesetzt, so ist ein großer schwarzer Schleier über das ganze Mikroskop / Heizung Setup Erstellung einer isolierten Luftblase rund um das System drapiert. Dies reduziert Temperaturschwankungen und der damit verbundenen Temperatur-bezogene Probe Drift, sondern erfordert eine Vorwärmung für 30 Minuten vor dem Einbau der Probe. 6. Data Acquisition, Transfer-und Bildverarbeitung Die Bilder sind aufgenommen mit einem 60x 1,42 NA Ölimmersionsobjektiv (UPlanApo N, Olympus), als der hohen numerischen Apertur (NA) erheblich verbessert die Auflösung. So erstellen Sie 3D-konfokale Bilder, ist das Scannen von einer sich drehenden Scheibe konfokalen Einheit (CSU-10, Yokagawa, Japan), die gleichzeitig verwendet&gt; 800 konfokalen Spots zu einem dramatischen Anstieg der Abtastrate durchgeführt. Zur Ergänzung seiner Geschwindigkeit, die CSU-10 ist mit einem hochempfindlichen Elektron-Multiplikation berechnet-coupled device (EMCCD, iXon + 897, Andor Technologies, Irland) Kamera auf schnelle, leichte Bildgebung, die sowohl Bleichen und Phototoxizität reduziert damit gepaart. Die Fluoreszenz-Lichtquelle ist ein Multi-Wellenlängen-ARKR Ionen-Gaslaser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), wo die gewünschten Wellenlänge (488 nm) und Laserleistung direkt vor dem Mikroskopobjektiv (&lt;1 mW) gemessen werden von einem ausgewählten akusto- optischen abstimmbaren Filter (AOTF), (Andor Technologies). Zur weiteren Reduzierung Ausbleichen und zu erweitern Total imaging Zeit, schaltet sich der AOTF schnell (Mikrosekunden) aus dem Laserstrahl jedes Mal, wenn die Kamera nicht aktiv ist (10-20 ms), während die neu erworbene Bild von der CCD (15-30 ms Belichtungszeit) geliefert wird, auf den Computer. Das Laserlicht wird in die sich drehende Scheibe-System mit einem 405/488/568/647 Quadband dichroitischen Spiegel (Semrock, Rochester, NY) gekoppelt. Fluoreszenzemission wird gefiltert mit einem 525/50 Bandpassfilter (Semrock) in einem Filterrad (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) montiert bVergleicht man die EMCCD Kamera und die konfokale Spinning-Disk-Einheit. Alle verwendeten Hard-und Übernahme, einschließlich einer z-Phase (Mad City Labs, Madison, WI), werden durch die Andor iQ v1.8 Software gesteuert. Um die Geschwindigkeit des Erwerbs von rund 1,2-1,9 zweite 3D Bildstapel zu maximieren, Ernte wir die Aufnahme Region des EMCCD Kamera bis auf die Zell-Paar der unmittelbaren Umgebung. Darüber hinaus auf Kosten der einige Informationen in z kann eine große z-Schritt zwischen 0,45-0,75 um zur Beschleunigung Akquisition werden. Imaging unter diesen Bedingungen kann bis zu 6 Stunden - mit kontinuierlichen 20-60 Minuten-Segmente - mit minimalem Ausbleichen. Insgesamt jedes Datensegment in der Regel nimmt 5-20 GB Speicherplatz als Zehntausende von Bildern getroffen werden. Zur Erleichterung des Transports und der Analyse der großen Datendateien, muss jeder Erwerb eingestellt abgebaut und exportiert als 1 Gb TIFF-Image-Datei-Segmente mit dem Andor iQ v1.8 Software. Von hier aus sind viele ausgezeichnete Software-Pakete für Bildanalyse, wie Metamorph, Volocity und ImageJ (wir empfehlen ihre Variation Fiji). Wenn zwei fluoreszierenden Markern verfolgt werden soll, haben wir gleichzeitig aufnehmen beide ohne zu verlangsamen Übernahme durch eine &quot;Split-Screen-Modus.&quot; Beide Marker werden durch zwei verschiedene ARKR Laserlinien auf einmal (oft 488 und 568 nm) angeregt. Direkt vor dem EMCCD Kamera wird ein Bild Splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK), dass die beiden unterschiedlichen Bilder trennt eingefügt. Jedes Bild wird dann unabhängig gefiltert mittels Fluoreszenz-Filter (Semrock) und projiziert side-by-Side an der Kamera auf einmal die Schaffung der &quot;split-screen&quot;-Effekt. Dies würde dann eine manuelle Zuschneiden und Ausrichten der Bilder später in der Bildverarbeitung. 7. Überlegungen für die Bildverarbeitung und Datenanalyse Wir arbeiten typischerweise Bildanalyse mit Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) auf Macintosh-Computern (Apple, Inc). Spinning Disk Laser konfokalen Mikroskopie-Aufnahmen werden zunächst in ihrer Intensität angepasst werden, um für Bleichen, dann mit Volocity entfalteten korrigieren. Intensitätsmessungen und Verfolgung von Gag puncta mit dem Volocity Quantifizierung Modul durchgeführt. Bei Bild-Sets, bei denen die Bewegung relativ zu einem vorgeformten Synapse muss berechnet werden, ist ein automatisiertes Tracking-Algorithmus eingesetzt werden, die Spuren der synaptischen Taste während der gesamten Sequenz. Manuelle Kontrolle der Regionen von Interesse durch die Nachführung Software definiert werden muss durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die Software richtig auf das gewünschte Objekt verfolgt werden. Für Objekte, bei denen der Kontrast mit der umgebenden Objekte zu schwach ist, kann die manuelle Abtastung auf einer Frame-by-Frame-Basis durchgeführt werden. Die Volocity Software-Paket ermöglicht den Export von XYZ Lage, das Volumen und integrierte Signal innerhalb der gewünschten Objekte. Der Abstand von der Synapse und die Geschwindigkeit des verfolgten Objekts werden durch die Normalisierung der Bewegungen in die Mitte der synaptischen Button berechnet. 8. Repräsentative Ergebnisse Innerhalb von 10 bis 15 Minuten Mischen sollte man in der Lage sein HIV Gag-iGFP Ausdruck Jurkat-Zellen anhaftende primäre CD4 + T-Zellen zu visualisieren. Imaging diese Konjugate, kann man die Bewegungen der Gag Punkte in infizierten Zellen sowie in Zielzellen nach synaspe beurteilen. Man kann die Bewegung des Gag-iGFP puncta in Zielzellen bald bemerken, nachdem Synapsen gebildet werden.

<ol>
	<li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells.">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li><li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes.">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses.">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li></ol>

Wir beschreiben hier eine einfache Methode zur Visualisierung der Übertragung von HIV von der Zell-Zell. Neuere Forschungen aus unserem Labor und andere &quot;legt nahe, dass dies die vorherrschende Form der HIV zwischen T-Zellen verteilt werden. Die hier beschriebene Methode nutzt eine rekombinante Form des HIV, genannt HIV Gag-iGFP, die einen genetisch kodierte grün fluoreszierendes Protein-Tag in den Kern Strukturprotein, Gag trägt. Aufgrund des hohen Niveaus der GFP in jedem Viruspartikel produziert, ermöglicht diese Replikations-kompetente Klon von HIV-Forscher an einzelne Viruspartikel in Echtzeit zu verfolgen. Dieser Virus sollte besonders nützlich in Studien über die Montage-und Zell-Zell-Transfer von HIV. Die Übertragung von HIV durch Zell-Zell-Transfer ist sehr effizient. Während einer dreistündigen Co-Kultur, Routine sehen wir Virus auf 20-30% der primären T-Zellen übertragen, wie mittels Durchflusszytometrie untersucht. Ähnliche Effizienzsteigerungen sind qualitativ im Live Cell Imaging gesehen. Viral infizierte T-Zellen beginnen bilden Synapsen mit infizierten primären T-Zellen fast unmittelbar nach der Einleitung des Co-Kultur. Interessant sind nicht alle primären T-Zellen zur Wechselwirkung mit HIV-infizierten Jurkat-Zellen trotz gezwungen Interaktionen mit Laser-Pinzette (unveröffentlichte Beobachtungen, GM). HIV Gag-iGFP wird zweifellos nützlich für die Bestimmung T-Zell-Subsets, die am anfälligsten für Zell-Zell-Transfer, sowohl in vitro und in vivo sind.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Jurkat T Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leukocyte buffy coats from whole blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New York Blood Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector System and Solution V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EndoFree Maxi Prep Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HIV Gag-iGFP plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chen Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll-Paque</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Celltracker/CellTrace Dyes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-Independent Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ibidi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlanApo N 1.42NA 60X oil objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C ArKr ion gas laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>525/50 bandpass filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ASI 400 Thermostatic Heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nevtek</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing cell-to-cell transfer of hiv using fluorescent clones of hiv and live confocal microscopy

Durch die Fusion des grün fluoreszierenden Proteins, um ihre Lieblings-Proteine, Biologen haben jetzt die Möglichkeit zu studieren lebende komplexen zellulären Prozesse mittels Fluoreszenz-Video-Mikroskopie. So verfolgen die Bewegungen des humanen Immundefizienz-Virus-Core-Protein während der Zell-Zell-Übertragung des Humanen Immundefizienz-Virus, haben wir die Gag-Protein in Zusammenhang mit einer infektiösen molekularen Klon von HIV, genannt HIV Gag-iGFP GFP-markierten. Wir untersuchen diese virale Klon mit Video-konfokale Mikroskopie. In den folgenden visualisiert Experiment transfizieren wir eine menschliche T-Zell-Linie mit HIV Gag-iGFP, und wir nutzen fluoreszenzmarkierten infizierten CD4 + T-Zellen als Zielzellen für das Virus dienen. Anhand der unterschiedlichen fluoreszierenden Markierungen wir ohne weiteres folgen virale Produktion und den Transport über interzelluläre Strukturen können als virologische Synapsen. Einfache gasdurchlässige Bildgebung Kammern ermöglichen es uns, Synapsen mit Live-konfokale Mikroskopie von Minuten bis Tagen zu beobachten. Diese Ansätze können verwendet werden, um virale Proteine ​​verfolgen, wie sie in von einer Zelle zur nächsten zu bewegen.

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.3K Aufrufe.  Mount Sinai School of Medicine. Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Serie: Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Spezielle Kennzeichnung von HIV-1 positiven Zellen mit Hilfe eines Rev-abhängigen Lentivirale Vector mit dem Ausdruck des Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Vorhersage von HIV-1 Korezeptor Usage (Tropismus) durch Sequenzanalyse mit einem Genotypische Ansatz

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Messung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...