Diese Studie wurde zum Teil durch NIH / NIBIB R21EB008166 zu DL und NIA AG028455 und NIA AG022385 für DJM unterstützt. Wir danken Dr. James Olson am Fred Hutchinson Cancer Research Center für die Bereitstellung ihrer D282 Tumor-Mäusen.

Teil 1: Magnet Sicherheit Beide MRT und MRS mit einem starken Magnetfeld, dass äußerste Vorsicht erfordert. Zum Beispiel hat der 4,7 T Instrument, das wir für die vorliegende Arbeit verwendet ein Magnetfeld rund 90.000-mal das Erdmagnetfeld. Die hohe magnetische Feld ist immer auf, auch wenn die MR-Scanner nicht benutzt wird. Alle metallischen Gegenstand in Berührung mit einem derart hohen Magnetfeld kommt, wird stark und schnell durch den Magneten angezogen werden. Es ist äußerst gefährlich, wenn eine Versuchsperson oder Betreiber in das Projektil Weg durch einen metallischen Gegenstand fliegen in den Magneten befindet. Deshalb sollte Personal, das MR Experimente darauf achten, alle metallischen Gegenstände aus ihrer Kleidung zu entfernen, bevor sie die Nähe des Gerätes und auch pflegen die Umgebung frei von solchen Objekten. Nähere Informationen über Magnet Sicherheit wird in der Literatur 1 und die folgende Webseite: <a href="http://www.imrser.org/">http://www.imrser.org/</a> . Die Anwesenheit von metallischem Material kann nicht nur zu den genannten Sicherheits-Problem, aber stören experimentellen Ergebnisse durch Induktion Imaging / spektroskopische Artefakte. Das metallische Material präsentieren in der Nähe oder innerhalb der Imaging-Objekt kann das Magnetfeld in der Nähe zu verändern und so zu Artefakten auf aufgenommene Bilder oder erweitern Linienbreite von Spektren. Dementsprechend lassen Geldbörse, Schlüssel, Stifte, etc. außerhalb des Magneten, wenn Sie Tiere Griff für MR Verfahren. Teil 2: In-vivo-MRT der Maus in eine horizontale Bohrung Magnet Tierische Vorbereitung für MRI <ol><li> Alle Tiere sollten von der institutionellen Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss (IACUC) vor dem Ausführen von Arten der Behandlung der Tiere genehmigt werden. </li><li> Wir verwenden verdampft Isofluran, Tiere für MRI Experimente zu betäuben. Anästhesie der Tiere können durch andere Anästhetika, wie Avertin (2,2,2-Tribromethanol oder FSME) und einem Cocktail von Ketamin und Xylazin erreicht werden. Dosierung Informationen der einzelnen Betäubungsmittel ist in Tabelle 1 zu finden. </li><li> Linie eine Induktion Kammer mit Kunststoff-Backed Saugkissen (blau-Pad oder Futter). Legen Sie eine Maus (oder mehrere Mäuse für Multi-Maus-imaging) bei der Induktion Kammer. </li><li> Stellen Sie den Durchfluss der Isofluran Verdampfer auf 0,8 1,5 L / min. Dann passen Sie die Isofluran-Verdampfer bis 4% für etwa 2 3 Minuten. </li><li> Nach dem Erreichen der operativen Ebene der Anästhesie (dh keine Spur Prise response), statt mit der Maus auf ein Tier-Halter mit seiner Nase in einem Nasenkonus (oder Maske) eingefügt. Ein Kopf restrainer können für Kopf-Bildgebung verwendet werden und ein Körper Halter kann für Körper Bildgebung verwendet werden. </li><li> Tierhaltung eingesetzt werden, um mögliche Bewegung zu verhindern: Es gibt mehrere Arten von kommerziellen Inhaber. Außerdem kann ein kundenspezifisches Halter hergestellt werden, um speziellen Anforderungen eines Versuchsaufbaus unterzubringen. Für eine maßgeschneiderte Halter, vergewissern Sie sich, um nur nicht magnetischem Material zu verwenden. </li><li> Während der Bildgebung Zeit, stellen Sie den Durchflussmesser 0,4 0,8 mL / min und reduzieren die Isofluran-Verdampfer bis 1,2 1,5%. Das ausgeatmete Gas aus der Maus Nasenkonus wird durch eine Pumpe gesammelt und entfernt in eine in-house Vakuum. </li><li> Die Augen des Tieres wird feucht gehalten mit einer sterilen Auge Schmier-Salbe sein. Das Tier wird bei 35-37 ° C während des Experiments in einem warmen Wasserkreislauf gehalten werden. Andere Arten von Wärmequelle wie beheizte Pads und warme Luft in die Radiofrequenz-(RF)-Spule durchgebrannt verwendet werden. </li><li> Ein Tier Monitoring-System ist vorhanden, um die Körpertemperatur, Atmung / Herzzyklus zu überwachen und zu synchronisieren Atmung / Herz-Gating mit Bildaufnahmen. </li><li> Ein Standard-Probe von Agarose hergestellt wird neben dem Tier abrupt Signaländerung Monitor platziert. Diese Standard-Agar-Probe ist besonders nützlich für Multi-Slice-und Multi-Zeit-Punkt Bildgebung. Wenn eine unerwartete Signaländerung in einem Stück aus den aufgenommenen Bildern erkannt wird, kann die Scheibe mit dem unerwarteten Signaländerung beseitigt werden. Darüber hinaus können ihre Signalintensitäten anhand des Signals ändert die Standard-Probe während der post-Bildanalyse eingestellt werden. </li><li> Nach sichere Platzierung der Tier-und Monitoring-Komponenten auf der Tierhalter, Position der Tierhalter in der Mitte einer HF-Spule. </li><li> Bewegen Sie den HF-Spule um den Magneten Raum und legen Sie die HF-Spule in das warme Wasser Kreislauf-System innerhalb des Magneten platziert. Abbildung 2 zeigt mehrere Komponenten eines MRT-Scanners von der Vorderseite des Magneten beobachtet Bohrung. </li></ol> MRI-Experiment <ol><li> Tune die HF-Spule, die 1 H-Resonanzfrequenz und entsprechen der charakteristischen Impedanz der Spule 50 Ohm mit dem Tuning Panel in den MR-Scanner. Dies ist, um optimale Bedingungen der Signalempfang zu erreichen. Die meisten Menschen MRI-Scanner benötigen keinen separaten Prozess von tune / Spiel außerin MRS Verfahren. </li><li> Führen Sie eine Shim-Prozess mit einem einzigen Impulsfolge. Eine MR-Signal setzt auf die Umwelt Magnetfeldhomogenität. Die shimming Verfahren ermöglicht das Magnetfeld in der Region von Interesse zu sein so homogen wie möglich. Jedes MR-Scanner verfügt über einen eigenen Weg, um die Shim-Prozess, einschließlich der automatischen schnell shimming Prozesse wie schnell Karte und Gradientenshimmen durchzuführen. </li><li> Optimieren Sie die HF-Pulses durch die Maximierung eindimensionales Bild Profil. HF-Pulses Befugnisse angeordnet, während die Pulsdauer konstant und eine ausreichend lange TR (recycle Verzögerung), dass etwa 3 ist - 5x die T 1 des Gewebes. </li><li> Erwerben Sie scout Bilder in drei orthogonalen Richtungen, um eine axiale, koronale und sagittale Bilder zu erstellen. Eine schnelle Bildaufnahme-Sequenz (dh Gradientenecho oder schnelle Spin-Echo-Bildgebung Sequenz) kann der Scout Bilder zu erwerben. Die aufgenommenen Bilder werden verwendet, um für die eigentliche Bildgebung mit der Bestimmung der Bildebenen zu planen. </li><li> Wechseln Sie auf Spin-Echo-Sequenz. Wählen der richtigen Reihenfolge Parametern: TR (recycle Verzögerung) sollten drei vor fünf Mal das Gewebe T 1 bis völlig entspannt Bilder wie Protonendichte oder T 2-gewichteten Bilder zu erwerben. TE (Echozeit) ist die Zeitdauer zwischen der ersten HF-Puls und dem Zentrum von echo-Signal. Ein TE-Wert kann je nach den Bildkontrast, wie in Tabelle 2 zusammengefasst ausgewählt werden. Abbildung 2 zeigt in vivo Bilder mit unterschiedlichen entspannende Wirkung von T 1, T 2 und T 2 * für eine Nacktmaus mit einer Xenograft Tumor auf dem Rücken erworben. </li><li> T 2-Messungen können durchgeführt entweder mit multiecho Bildgebung oder einzelne Echo-Bildgebung mit mehreren TE-Werte sein. </li><li> Im Anschluss an die MRI / MRS in vivo Experiment sollten die Tiere während des Recovery-Prozess überwacht werden. Nach der MR-Bildgebung werden die Tiere aus der HF-Spule aufgenommen und überwacht werden, um vollständige Genesung zu gewährleisten, wenn sie den Käfig zurück. Der Wärmeverlust ist bei narkotisierten Mäusen schnell. Halten Sie die Tiere warme durch Abdecken mit Gaze-Pads oder Handtüchern und / oder die Bereitstellung einer Wärmequelle bis die Tiere aus der Narkose gewonnen werden. </li></ol> Image Processing <ol><li> Bewertung aufgenommenen Bilder auf dem MR-Konsole und von ausgewählten Daten an ein Post-Processing Computer. </li><li> Wir verwenden in der Regel ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) zur Analyse von Bildern. Die Bildanalyse umfasst Bildskalierung /-Filterung, Berechnung von T 1, T 2 und Diffusion, Tumorvolumen Messungen und Segmentierung von Tumoren. </li></ol> Teil 3. In Vivo MRS für Mouse Hinterlauf Skelettmuskulatur in eine vertikale Bohrung Magnet Bau der Manschette zur Induktion Reversible Ischämie <ol><li> Beginnen Sie mit einem Stück PVC-Rohr, dass etwa 5-7 mm breit mit einer ID von 12-15 mm ist. Bohren Sie ein kleines Loch durch die Wand von diesem Stück und Faden. </li><li> Schneiden Sie ein Stück Ballon so dass es an beiden Enden offen ist (Helium Ballons Qualität der Arbeit am besten). Legen Sie dieses Stück durch die PVC Stück und wickeln sich wieder um und Bandenden zusammen an der Außenwand des PVC Stück. </li><li> Verwenden Sie Schrumpffolie, um den Ballon Dichtung endet um das Rohr. Sie sollten über eine Manschette mit einem festen Außenwand und einem aufblasbaren Innenwand. </li><li> Schneiden Sie eine Fläche von Schrumpf-und Ballon rund um die Gewindebohrung, wobei darauf zu viel Material zwischen dem Loch und der Kante des PVC Stück verlassen. Themen ein 1,5 cm großes Stück NE-Metallen (zB Messing) in das Loch in der PVC. Damit können Sie die Manschette aufzublasen. Seal Bereich mit 5 Minuten Epoxy. </li><li> Fix diese Manschette in Platz neben dem HF-Spule in der MRS-Sonde und eine Verbindung zu einem externen Blutdruckmessgerät. </li></ol> Benutzerdefinierte Atmung überwachen <ol><li> Wir verwenden eine maßgeschneiderte Atmung überwachen, dass kompatibel gemacht werden mit dem begrenzten Raum und den Zugang zu der Bohrung des Magneten wird. Mehrere kommerzielle Modelle sind ebenfalls erhältlich. </li><li> Tie ein kleiner Ballon am Ende der Strecke beständig Schlauch in die Sonde zugeführt. </li><li> Schließen Sie das andere Ende des Schlauchs an einen Druckwandler. </li><li> Seien Sie sicher, dass die Linie und Ballon sind frei von Luftblasen. Die Blasen werden dämpfen das Signal von der Kompression des Ballons durch die Bewegung der Maus Körper durch Atmung verursacht. </li></ol> Mauspositionierung in MRS Probe <ol><li> Anesthetize die Maus mit 5% Avertin (0,010 ml / g Körpergewicht). </li><li> Nach dem Erreichen der operativen Ebene der Anästhesie, positionieren Sie den Mauszeiger in der MRS-Sonde, indem Sie die Maus auf den Rücken der Maus unterstützen. Legen Sie die mit Flüssigkeit gefüllten Ballon auf der Bauchseite der Maus und befestigen Sie mit Maus-Unterstützung Trägern. </li><li> Position der Maus und Körper zu unterstützen in der MRS-Sonde. </li><li> Ziehen Sie eine Hinterbein durch die ischämische Manschette und MRS-Spule. Das Bein sollte in der Spule als mu zentriert werdench wie möglich. Diese Anordnung erlaubt die Maus Körper horizontal in eine vertikale Bohrung Magneten positioniert werden (Abbildung 3). </li><li> Fix Bein statt durch Abkleben Fuß zu starren Träger. </li><li> Legen Thermoelement subkutan in Hinterlauf außerhalb der Region durch die Spule abgetastet. </li><li> Befeuchten der Augen mit dem Auge Schmier-Salbe auf die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. Cover Maus Augen und Gesicht zu reiben oder Reizung von der Wand der Sonde zu verhindern. </li><li> Sonstige Überwachungs-Sonden können hinzugefügt je nach den spezifischen Bedürfnissen des Experiments werden. </li></ol> Einrichten MRS Experiment <ol><li> Connect Luftstrom zum Heizelement auf dem MRS-Sonde. </li><li> Setzen Sie die Variable Temperatur-Regeleinheit auf VNMR Software Bein Temperatur bei 35-37 ° C zu halten </li><li> Tune Spule Frequenz und Impedanz Spiel mit dem Tuning Panel in der MRS-Software für 1 H und 31 P-Resonanzen. </li><li> Passen shimming Schaltungen, um die Homogenität der B1 Magnetfeld in der Region von Interesse mittels 1 H-Spektroskopie zu optimieren. </li><li> Wechseln Sie zu 31 P Frequenz des HF-Pulses Breite zu ermitteln, um maximale Signal von einem Free Induction Decay (FID) (90 ° Zeit) zu erhalten. </li><li> Sammeln hohes Signal-Rausch völlig entspannt Spektren (FRS), um die Verhältnisse von anorganischem Phosphat (P i) und Phosphokreatin (PCr) zum ATP bestimmen, unter völlig entspannt Bedingungen. Diese Spektren werden gesammelt, indem die 90 °-Zeit mit der Zeit zwischen FID Akquisitionen (TR) von ca. 5x die T 1 von PCr (20 sek. Bei 7 T). Diese werden für die Quantifizierung von PCR und P i Ebenen von MR-Spektren verwendet werden. </li></ol> Ischämische Experiment <ol><li> Eine einfache ischämischen Störung ermöglicht die Bestimmung von Ruhe-und maximale mitochondrialen ATP-Produktion durch die Messung von Veränderungen in Phosphokreatin während und unmittelbar nach Ischämie. </li><li> Set-up-Array auf mehrere Spektren sammeln mit Hilfe eines 45 ° Pulsbreite (dh 0,5 x 90 ° Zeit) und eine TR von 0.5x der T 1 (~ 1,5 sek.). Wir sammeln in der Regel 4 FIDs für jeden Spektren (Anzahl der Mittelung (na) = 4 in VNMR Software) für eine zeitliche Auflösung von etwa 6 Sekunden. Diese zeitliche Auflösung ist ausreichend, um genau zu bestimmen, Ruhe-und maximale mitochondrialen ATP-Produktion. </li><li> Sammeln Sie ruhen Spektren für ca. 5 Minuten. </li><li> Induce Ischämie durch Aufpumpen der Manschette um 270-300 mmHg für 10-12 Minuten. </li><li> Lassen Sie die Manschette und sammeln Recovery-Spektren für 5 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die Sonde aus Magneten und der Maus von der Sonde. Lassen Sie die Maus, um aus der Narkose unter geeigneten Bedingungen zu erholen. Experimente können an den folgenden Tagen wiederholt werden. Nach der letzten Spektroskopie Experiment Maus Beinmuskeln werden entfernt und sofort eingespannt Einfrieren in flüssigem N 2 für die Analyse der ATP-Konzentrationen durch HPLC. </li></ol> Data Analysis <ol><li> Die Daten werden analysiert offline mit einem von mehreren Spektralanalyse Programme für NMR-Spektren. Unser Labor verwendet in der Regel fit zu Standard 2 und jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) zur Quantifizierung der Peakflächen. </li><li> Initial PCr Abbauraten während einer Ischämie sind ein Maß für die mitochondriale ATP-Produktion unter normoxischen Bedingungen wie in mehreren Zeitungen 3-5 beschrieben. PCr Verwertungsquoten können verwendet werden, um die maximale Kapazität für mitochondriale ATP-Produktion auf dem Ansatz zu bestimmen zuvor beschriebenen 4,6 sein. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig1.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" /></a> Abbildung 1. In-vivo-MRI-Setup von der Vorderseite des Magneten angesehen Bohrung. Das Setup besteht aus einem HF-Spule, Tier-Erwärmung (oder warmem Wasser Kreislauf-System) und Steigung einzufügen. Alle diese Komponenten sind in einer horizontalen Magneten eingesetzt. Warmes Wasser wird in einem Wasser-Reservoir außerhalb des Magneten Raum erwärmt und in das Tier Erwärmung System über eine Tygon Schlauch (grünes Band). Nach Umlauf in den Zylinder wird Wasser aus der Erwärmung System zurück zum Stausee gezogen, um beheizt werden. Ein Isofluran Rohr-und Vakuumröhrenkollektoren werden verwendet, um Mäuse während der MRT-Untersuchungen zu betäuben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig2.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" /></a> Abbildung 2 In-vivo-Bilder für eine Nacktmaus mit Xenograft Tumor (Tumor D282) auf dem Rücken (Pfeil) mit unterschiedlichen entspannende Wirkung:. A. T 1 gewogen Bild (TR / TE = 500/14.2ms). B. T 2 gewogen Bild (TR / TE = 2s/40ms). Sowohl T 1 und T 2-gewichteten Bilder wurden durch Spin-Echo-Sequenz erworben. C. T 2-Karte mit 4 Sets von Bildern unterschied erworben verarbeitetschiedenen TE-Werte im Bereich von 20 bis 80 ms. D. T 2 * wog Bild (TR / TE = 180/7.39ms, Flipwinkel = 20 °) durch Gradienten-Echo-Sequenz erworben. Sehfeld von 35 x 35 mm 2 ist für alle MR-Bildern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig3.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig3tmb.jpg" alt="Abbildung 3" /></a> Abbildung 3. Illustration der Maus in horizontaler Körper-Halter mit Bein positioniert in HF-Spule befestigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig4.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig4tmb.jpg" alt="Abbildung 4" /></a> Abbildung 4. In-vivo-31 P-Spektren durch eine Ischämie Reperfusion Zyklus. Die Daten wurden auf einem 7 T vertikale Bohrung Magnet und mit einer 20 Hz-Filter exponentiell erweitert gesammelt. TR = 1, na = 4, alle 20 Spektren aufgezeichnet. Tabelle 1. Dosierung des Narkosemittels für Maus MRI / MRS. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tier Spezies </td><td> Narkose Agent </td><td> Dosis (Mg / kg für injizierbare) </td><td> Route </td></tr><tr><td> Maus </td><td> Isofluran-Gas </td><td> 4,0% für 2-3 min (Induktion), dann 1,2 bis 1,5% kontinuierlich (Instandhaltung) </td><td> Inhalative über Nasenkonus </td></tr><tr><td> Maus </td><td> Avertin </td><td> 5%, 10ml/kg Körpergewicht </td><td> intraperitoneal (IP) </td></tr><tr><td> Maus </td><td> Ketamin / Xylazin </td><td> 100 mg / kg und 10 mg / kg </td><td> IP </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Bild mit Entspannung Gewichtungen <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Bild Gewichtung </td><td> TR (recycle Verzögerung) </td><td> TE (Echozeit) </td></tr><tr><td> T1 </td><td> Short (kürzer als T1) </td><td> Short (kürzer als T2) </td></tr><tr><td> T2 </td><td> Lange (3 ~ 5 mal T1) </td><td> Long (rund T2) </td></tr><tr><td> PD (Protonendichte) </td><td> Lange (3 ~ 5 mal T1) </td><td> Short (kürzer als T2) </td></tr></tbody></table> T1: Spin-Gitter-Relaxationszeit (oder longitudinale Relaxation) Zeit T2: Spin Spin-Relaxationszeit (oder transversale Relaxation) Zeit

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	<li>Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+safety+issues+in+magnetic+resonance+imaging:+state+of+the+art.">Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art.</a> Radiol Med. 112, 491-491 (2007).</li><li>Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+spectral+analysis+of+kinetic+data+using+natural+lineshapes.">NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes.</a> Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).</li><li>Amara, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+vivo:+spectroscopy+provides+window+on+cellular+energetics.">Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics.</a> Methods. 46, 312-312 (2008).</li><li>Blei, M. L., Conley, K. E., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separate+measures+of+ATP+utilization+and+recovery+in+human+skeletal+muscle.">Separate measures of ATP utilization and recovery in human skeletal muscle.</a> J Physiol. 465, 203-203 (1993).</li><li>Marcinek, D. J., Schenkman, K. A., Ciesielski, W. A., Conley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+coupling+in+vivo+in+mouse+skeletal+muscle.">Mitochondrial coupling in vivo in mouse skeletal muscle.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C457-C457 (2004).</li><li>Paganini, A. T., Foley, J. M., Meyer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+dependence+of+muscle+phosphocreatine+kinetics+on+oxidative+capacity.">Linear dependence of muscle phosphocreatine kinetics on oxidative capacity.</a> Am J Physiol. 272, 501-501 (1997).</li><li>Sun, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+detection+of+gliomas+by+chlorotoxin-conjugated+superparamagnetic+nanoprobes.">In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes.</a> Small. 4, 495-495 (2008).</li><li>Marcinek, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mitochondrial+coupling+in+vivo+alters+cellular+energetics+in+aged+mouse+skeletal+muscle.">Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle.</a> J Physiol. 569, 467-467 (2005).</li></ol>

Die vor der Übernahme Schritte tune / Spiel und Shim sind entscheidend für die hohe räumliche Auflösung und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) zu erwerben. Es ist auch wichtig, um Tier-Bedingungen mit einem Tier Monitoring-System zu einer stabilen physiologischen Zustand der Tiere zu halten während Signalmittelungen mit humane Behandlung der Tiere zu erfüllen und mögliche Artefakt-Messungen zu verhindern überwachen. Die Verfahren in das Protokoll erklärt werden können modifiziert werden, um zusätzliche...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inova 200 MR scanner/4.7 T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian/Bruker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Used for mouse MRI</td>
</tr>
<tr>
<td>Inova 300 NMR spectrometer/7 T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian/Oxford</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Used for MRS of mouse skeletal muscle</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

noninvasive in vivo small animal mri and mrs: basic experimental procedures

Kleintier-Magnet-Resonanz-(MR-) Forschung als ein wichtiges Element der modernen biomedizinischen Forschung aufgrund ihrer nicht-invasive Natur und den Reichtum der biologischen Informationen, die sie bietet entstanden. MR benötigt keine ionisierende Strahlung und kann nicht-invasiv eine höhere Auflösung und bessere Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu anderen tomographischen oder spektroskopischen Modalitäten. In diesem Protokoll werden wir uns auf kleine Tier MR-Bildgebung und MR-Spektroskopie (MRI / MRS) Fokus auf nicht-invasiv zu erwerben Entspannung gewichteten<sup&gt; 1</sup&gt; H Bilder von Maus und zu erhalten<sup&gt; 31</sup&gt; P-Spektren der Maus Muskel. Diese Arbeit wird nicht versucht, jeden Aspekt des Kleintier-MRT / MRS decken, sondern eine Einführung in grundlegende Verfahren der Maus MRI / MRS Experimente. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es Forschern der grundlegenden Verfahren für informieren<em&gt; In vivo</em&gt; MR-Experimente auf kleine Tiere. Das Ziel ist ein besseres Verständnis der grundlegenden experimentellen Verfahren bereitzustellen, um den Forschern neu auf dem MR-Feld besser planen für Nicht-MR-Komponenten ihres Studiums, so dass beide MR-und Nicht-MR Verfahren nahtlos integriert sind.

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Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Diese Arbeit beschreibt die grundlegenden Verfahren der nichtinvasiven Kleintier-MRT und MRS<em&gt; In vivo</em&gt;.

Nichtinvasive In Vivo Small Animal MRI und MRS: Basic Experimentelle Verfahren

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

noninvasive-vivo-small-animal-mri-mrs-basic-experimental

Research

JoVE Journal

Biology

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

16.0K Aufrufe.  University of Washington. Diese Arbeit beschreibt die grundlegenden Verfahren der nichtinvasiven Kleintier-MRT und MRS In vivo.

Serie: Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Forschung

Biologie

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafisch-Based In-vivo- Small Molecule-Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

Synthese eines<em&gt; In vivo</em&gt; MRT-Probe nachweisbar Apoptose

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In vivo siRNA-Transfektion und Gene Knockdown im Rückenmark über Rapid-Nichtinvasive Lendenwirbel intrathekale Injektionen in Mäuse

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in all vertebrates by providing feedback to the brain and pituitary. Teleost fishes possess a higher degree of tissue plasticity and variation in reproductive&#160;strategies compared to mammals and appear to be useful models to investigate the role of sex steroids and the mechanisms by which they act. The removal of the main source of sex steroid production using gonadectomy together with blood sampling to measure steroid levels has been well-established and fairly feasible in bigger fish and is a powerful technique to investigate the role and effects of sex steroids. However, these techniques raise challenges when implemented in small size teleost models. Here, we describe the step-by-step procedures of gonadectomy in both males and female Japanese medaka followed by blood sampling. These protocols are shown to be highly feasible in medaka indicated by a high survival rate, safety for the life span and phenotype of the fish, and reproducibility in terms of sex steroid clearance. The use of these procedures combined with the other advantages of using this small teleost model will greatly improve the understanding of feedback mechanisms in the neuroendocrine control of reproduction and tissue plasticity provided by sex steroids in vertebrates.

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

The article describes a quick protocol to gonadectomize and sample blood from the small teleost fish, using Japanese medaka (Oryzias latipes) as a model, to investigate the role of sex steroids in animal physiology.

Gonadektomie und Blutentnahmeverfahren im Small Size Teleost Modell Japanische Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Nichtinvasive In Vivo Small Animal MRI und MRS: Basic Experimentelle Verfahren

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