Este estudo foi financiado em parte pelo NIH / NIBIB R21EB008166 para DL e AG028455 NIA e NIA AG022385 para DJM. Agradecemos ao Dr. James Olson no Centro de Pesquisa Fred Hutchinson Cancer para fornecer os seus D282 ratos tumor.

Parte 1: Segurança Magnet Ambos MRI e MRS usar um campo magnético forte que exige extrema cautela. Por exemplo, o instrumento T 4.7 que usamos para o presente trabalho tem um campo magnético aproximadamente 90.000 vezes o campo magnético da Terra. O campo magnético de alta está sempre, mesmo quando o scanner MR não está sendo usado. Qualquer objeto metálico que entra em contato com um campo magnético de alta será fortemente e rapidamente atraído pelo ímã. É extremamente perigoso se um sujeito experimental ou operador está localizado no caminho do projétil de um objeto metálico voando para o ímã. Portanto, o pessoal que conduzem experimentos MR deve ser cuidadoso para remover qualquer objeto metálico de suas roupas antes de entrar na proximidade do instrumento e também manter o meio ambiente livre de tais objetos. Informações mais detalhadas sobre segurança ímã aparece na literatura 1 e a seguinte página: <a href="http://www.imrser.org/">http://www.imrser.org/</a> . A presença de material metálico não só pode causar o problema de segurança mencionados, mas interfere com os resultados experimentais através da indução de imagem / artefatos espectroscópicas. O presente material metálico perto ou dentro do objeto de imagem pode alterar o campo magnético na vizinhança e assim gerar artefatos nas imagens adquiridas ou ampliar a linha de largura de espectros. Assim, deixe carteira, chaves, canetas, etc fora do ímã, se você lida com os animais para os procedimentos de MR. Parte 2: Em Vivo MRI de rato em um ímã Horizontal Bore Preparação de animais para ressonância magnética <ol><li> Todos os procedimentos animal deve ser aprovado pelo cuidado animal institucional e da comissão de uso (IACUC) antes de executar qualquer tipo de manuseio dos animais. </li><li> Usamos isoflurano vaporizado para anestesiar animais para experimentos de ressonância magnética. Anestesia dos animais pode ser alcançado por outros anestésicos, como Avertin (2,2,2 tribromoetanol ou TBE) e um coquetel de quetamina e xilazina. Informação sobre a dosagem de cada anestésico é encontrado na Tabela 1. </li><li> Câmara de uma linha de indução com almofada de apoio de plástico absorvente (pad azul ou chuck). Coloque um mouse (ou vários mouses de multi-imagens do rato) na câmara de indução. </li><li> Ajuste o medidor de vazão do vaporizador isoflurano 1,5 a 0,8 L / min. Em seguida, ajuste o vaporizador isoflurano a 4% para cerca de 2 3 minutos. </li><li> Depois de atingir o plano cirúrgico de anestesia (ou seja, sem resposta pitada tep), coloque o mouse sobre um suporte de animais com seu nariz inserido em um cone de nariz (ou máscara). Um limitador de cabeça pode ser usado para imagens de cabeça e um suporte de corpo pode ser usado para imagens de corpo. </li><li> Detentores de animais são usados ​​para impedir o movimento potencial: há vários tipos de suportes comerciais. Além disso, um titular personalizados podem ser fabricados para acomodar quaisquer requisitos especiais de uma instalação experimental. Para um suporte personalizados, certifique-se de usar apenas material não magnético. </li><li> Durante o período de imagem, ajuste o medidor de vazão para 0,4 0,8 mL / min e reduzir o vaporizador isoflurano a 1,2% 1.5. O gás expirado proveniente do cone do nariz do rato é coletado por uma bomba e removido em um vácuo in-house. </li><li> Os olhos do animal será mantido úmido com uma pomada lubrificante ocular estéril. O animal será mantido a 35-37 º C durante o experimento dentro de um sistema de circulação de água quente. Outros tipos de fonte de calor pode ser usado como almofadas de aquecimento e ar quente expelido para a bobina de radiofreqüência (RF). </li><li> Um sistema de monitoramento de animais está no local para monitorar a temperatura do corpo, a respiração / ciclo cardíaco, e sincronizar a respiração / gating cardíaca com aquisições de imagem. </li><li> A amostra padrão feito de agarose é colocado ao lado do animal para monitorar a mudança abrupta do sinal. Esta amostra agar padrão é particularmente útil para multi-slice e multi-tempo imagem ponto. Quando uma mudança de sinal inesperado é detectado em uma fatia a partir das imagens adquiridas, a fatia com a mudança de sinal inesperado pode ser eliminada. Além disso, as intensidades seu sinal pode ser ajustada com base na mudança de sinal da amostra-padrão durante a pós-imagem análise. </li><li> Após a colocação do animal de forma segura e componentes de monitoramento no suporte animal, a posição do detentor de animais no centro de uma bobina de RF. </li><li> Mover a bobina de RF para a sala de ímã e inserir a bobina de RF para o sistema de circulação de água quente colocada no interior do ímã. A Figura 2 apresenta vários componentes de um scanner de ressonância magnética observada a partir da frente do ímã furo. </li></ol> Experimento MRI <ol><li> Sintonize a bobina de RF na frequência de ressonância 1 H e combinar a impedância característica da bobina a 50 Ohm usando o painel de sintonia no scanner MR. Este é conseguir melhores condições de recepção do sinal. Mais humano scanners MRI não requerem um processo separado de sintonia / partida, excetonos procedimentos de MRS. </li><li> Realizar um processo shimming usando uma seqüência de pulso único. Um sinal de MR depende da homogeneidade de campo magnético ambiental. O processo permite shimming o campo magnético na região de interesse para ser o mais homogêneo possível. Cada scanner MR tem sua própria maneira de realizar o processo de calços, incluindo automático rápido shimming processos tais como o mapa rápido e calços de gradiente. </li><li> Otimizar o pulso de RF, maximizando um perfil de imagem dimensional. Poderes RF pulso pode ser vestida, mantendo o comprimento do pulso constante e um TR longo o suficiente (atraso reciclar) que é de aproximadamente 3 - 5x o T 1 de tecido. </li><li> Adquirir imagens olheiro ao longo de três orientações ortogonais para criar axial, coronal e sagital imagens. Uma sequência rápida aquisição de imagem (ie gradiente eco ou fast spin echo seqüência de imagens) pode ser usado para adquirir as imagens scout. As imagens obtidas serão usadas para planejar imagem real com a determinação de planos de imagem. </li><li> Alterar a girar seqüência de eco. Selecione os parâmetros seqüência correta: TR (atraso reciclar) deve ser de três a cinco vezes o tecido T 1 para adquirir imagens totalmente relaxado, como a densidade de prótons ou 2 T imagens ponderadas. TE (tempo de eco) é a duração de tempo entre o pulso de RF em primeiro lugar e no centro de sinal de eco. Um valor TE podem ser selecionados de acordo com o contraste da imagem, conforme resumido na Tabela 2. A Figura 2 mostra em imagens adquiridas vivo com efeitos de relaxamento diferentes de T 1, T 2 e T 2 * para um rato nua com um tumor xenoenxerto em suas costas. </li><li> T 2 medições pode ser feito usando multiecho imagem ou imagem echo único com vários valores TE. </li><li> Após a experiência de MRI / MRS in vivo, os animais devem ser monitorados durante todo o processo de recuperação. Depois de ressonância magnética, os animais serão levados para fora da bobina de RF e monitorados para garantir a recuperação total quando voltou para a jaula. Perda de calor é rápida em ratos anestesiados. Manter os animais quente, cobrindo-os com compressas de gaze ou toalhas e / ou fornecer uma fonte de calor até que os animais são recuperados da anestesia. </li></ol> Processamento de Imagem <ol><li> Revisão imagens adquiridas no console MR e transferência de dados selecionados para um computador de pós-processamento. </li><li> Normalmente usamos ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) para análise de imagens. A análise de imagem inclui dimensionamento de imagem / filtragem, cálculos de T 1, T 2 e difusão, as medições de volume do tumor e segmentação de tumores. </li></ol> Parte 3. Vivo na MRS para Mouse muscular dos membros posteriores ósseas em um ímã Vertical Bore Construção de Cuff para induzir isquemia reversível <ol><li> Comece com um pedaço de tubo de PVC que é cerca de 5-7 milímetros de largura, com um ID de 12-15 mm. Perfurar um pequeno buraco na parede desta peça e de discussão. </li><li> Corte um pedaço de balão por isso é aberto em ambas as extremidades (balões de hélio melhor qualidade de trabalho). Insira este pedaço por pedaço do PVC e enrole a fita de volta e termina em conjunto na parede externa do pedaço de PVC. </li><li> Use shrink wrap para selar o balão termina ao redor do tubo. Você deve ter um manguito com uma parede externa sólida, e uma parede inflável interior. </li><li> Cortar uma área de envoltório do psiquiatra e balão ao redor do furo rosqueado, tendo o cuidado de deixar a abundância de material entre o furo ea borda do pedaço de PVC. Tópico um pedaço de 1,5 cm de metais não ferrosos (latão, por exemplo) dentro do buraco no PVC. Isso permite que você inflar o manguito. Selar a área com epóxi 5 minutos. </li><li> Corrigir esse manguito no lugar ao lado da bobina de RF na sonda MRS e se conectar a um esfigmomanômetro externo. </li></ol> Monitor de Respiração personalizado <ol><li> Nós usamos um monitor de respiração custom made, que é feito para ser compatível com o espaço restrito e acesso ao furo do ímã. Vários modelos comerciais também estão disponíveis. </li><li> Amarre um pequeno balão até o final da tubulação resistente trecho alimentado na sonda. </li><li> Conecte a outra extremidade do tubo a um transdutor de pressão. </li><li> Certifique-se a linha e balão são livres de bolhas de ar. As bolhas vão atenuar o sinal da compressão do balão causado pelo movimento do corpo do mouse, devido à respiração. </li></ol> Posicionamento do mouse na MRS Probe <ol><li> Anestesiar o rato com Avertin 5% (0,010 peso corporal ml / g). </li><li> Depois de atingir o plano cirúrgico de anestesia, posicione o mouse na sonda MRS, colocando o mouse sobre as suas costas com o apoio mouse. Coloque o balão cheio de líquido no lado ventral do rato e seguro em lugar com tiras de suporte mouse. </li><li> Posição do mouse e apoio do corpo na sonda MRS. </li><li> Puxe uma hindlimb através do manguito isquêmica e bobina MRS. A perna deve ser centrada na bobina como much possível. Este arranjo permite que o corpo do mouse para ser posicionado horizontalmente em um ímã furo vertical (Figura 3). </li><li> Fix perna no lugar gravando pé para suporte rígido. </li><li> Lugar termopar por via subcutânea em hindlimb fora da região amostrada pela bobina. </li><li> Humedecer os olhos com a pomada de lubrificação dos olhos para evitar os olhos de secagem. Cobrir os olhos do mouse e no rosto para evitar o atrito ou irritação da parede da sonda. </li><li> Sondas de monitorização outros podem ser adicionados, dependendo das necessidades específicas do experimento. </li></ol> Criação Experiment MRS <ol><li> Conecte o fluxo de ar ao elemento de aquecimento na sonda MRS. </li><li> Definir a unidade de controlo variável de temperatura em software VNMR para manter a temperatura da perna a 35-37 ° C. </li><li> Tune freqüência bobina e impedância de correspondência usando o painel de sintonia no software MRS para ambos 1 H e 31 P ressonâncias. </li><li> Ajuste shimming circuitos para otimizar a homogeneidade do campo magnético B1 na região de interesse usando uma espectroscopia H. </li><li> Mudar para 31 P freqüência para determinar a largura de pulso de RF para produzir máxima do sinal de um decaimento livre (FID) (90 hora °). </li><li> Coletar sinal de alta para espectros de ruído totalmente relaxado (FRS) para determinar as relações de fosfato inorgânico (P i) e fosfocreatina (PCr) para ATP, em condições totalmente relaxado. Estes espectros são coletados usando o tempo de 90 ° com o tempo entre as aquisições FID (TR) de cerca de 5x o T 1 da PCr (20 seg. Às 7 T). Estes serão utilizados para a quantificação dos níveis de PCr e P i a partir de MR espectros. </li></ol> Experimento isquêmica <ol><li> A perturbação simples isquêmico permite a determinação de repouso e máxima produção de ATP mitocondrial, medindo mudanças na fosfocreatina durante e imediatamente após a isquemia. </li><li> Set-up da matriz para coletar espectros múltiplas usando um 45 ° de largura de pulso (ou seja, 0,5 x o 90 ° tempo) e uma TR de 0,5 x o T 1 (~ 1,5 seg.). Normalmente, recolher 4 FIDs para todos os espectros (número de média (na) = 4 em VNMR software) para uma resolução temporal de cerca de 6 segundos. Esta resolução de tempo é suficiente para determinar com precisão em repouso e máxima produção de ATP mitocondrial. </li><li> Coletar espectros de repouso por aproximadamente 5 minutos. </li><li> Induzir isquemia inflando o manguito para 270-300 mmHg por 10-12 minutos. </li><li> Liberação do manguito e coletar espectros de recuperação por 5 minutos. </li><li> Remova a sonda do ímã e do rato da sonda. Permitir que o mouse para se recuperar da anestesia em condições adequadas. Experimentos podem ser repetidas nos dias subseqüentes. Após a final espectroscopia experimento músculos da perna do rato são removidos e imediatamente freeze-fixada em líquido N 2 para a análise das concentrações de ATP por HPLC. </li></ol> Análise de Dados <ol><li> Os dados são analisados ​​off-line usando um dos vários programas de análise espectral para os espectros de RMN. Nosso laboratório utiliza normalmente se encaixam ao padrão 2 e jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) para quantificar as áreas de pico. </li><li> Taxas de decomposição inicial PCr durante a isquemia é uma medida da produção de ATP mitocondrial em condições normóxica como descrito em vários trabalhos 3-5. Taxas de PCr recuperação pode ser usado para determinar a capacidade máxima de produção de ATP mitocondrial com base na abordagem descrita anteriormente 4,6. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig1.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" /></a> Figura 1. Na configuração do MRI vivo visto de frente do ímã furo. A configuração inclui uma bobina de RF, o sistema de aquecimento animal (ou sistema de circulação de água quente) e inserir gradiente. Todos estes componentes são inseridos em um ímã horizontal. Água quente é aquecida em um reservatório de água fora da sala de ímã e introduzido no sistema de aquecimento de animais através de um tubo Tygon (fita verde). Depois de circular no cilindro, a água é retirado do sistema de aquecimento de volta para o reservatório de água a ser aquecida. Um tubo de isoflurano e tubo de vácuo são usados ​​para anestesiar ratos durante as experiências de ressonância magnética. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig2.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" /></a> Na figura 2 imagens para um rato vivo nu com tumor xenoenxerto (D282 tumor) em sua parte traseira (seta) com efeitos de relaxamento diferentes:. A. T 1 pesava imagem (TR / TE = 500/14.2ms). B. T 2 pesava imagem (TR / TE = 2s/40ms). Tanto T 1 e T 2 imagens ponderadas foram adquiridas pela seqüência spin echo. C. T mapa 2 tratados com 4 conjuntos de imagens adquiridas por diferentesdiferentes valores TE variando de 20 a 80 ms. D. T 2 * imagem pesados ​​(TR / TE = 180/7.39ms, ângulo de inclinação = 20 graus) adquirida pela seqüência gradiente eco. Campo de visão de 35 x 35 mm 2 é para todas as imagens MR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig3.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" /></a> Figura 3. Ilustração de mouse posicionado no suporte horizontal do corpo com a perna garantidos na bobina de RF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig4.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" /></a> Figura 4. In vivo 31 P espectros através de um ciclo de isquemia reperfusão. Os dados foram coletados em um ímã 7 T verticais furo e da linha ampliada com um filtro de 20 Hz exponencial. TR = 1, na = 4, todos os espectros de 20 são plotados. Tabela 1. Dosagem de anestésico para mouse MRI / MRS. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Animal Espécies </td><td> Anestésico Agente </td><td> Dose (Mg / kg para injetáveis) </td><td> Rota </td></tr><tr><td> Mouse </td><td> Gás isoflurano </td><td> 4,0% por 2-3 min (indução), em seguida, 1,2-1,5% continuamente (manutenção) </td><td> Inalado através de cone do nariz </td></tr><tr><td> Mouse </td><td> Avertin </td><td> 5%, o peso corporal 10ml/kg </td><td> intraperitoneal (IP) </td></tr><tr><td> Mouse </td><td> Cetamina / Xilazina </td><td> 100 mg / kg e 10 mg / kg </td><td> IP </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Imagem com as ponderações de relaxamento <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Ponderação imagem </td><td> TR (atraso reciclar) </td><td> TE (tempo de eco) </td></tr><tr><td> T1 </td><td> Curto (inferior a T1) </td><td> Curto (inferior a T2) </td></tr><tr><td> T2 </td><td> Tempo (3 a 5 vezes T1) </td><td> Longo (cerca de T2) </td></tr><tr><td> PD (densidade de prótons) </td><td> Tempo (3 a 5 vezes T1) </td><td> Curto (inferior a T2) </td></tr></tbody></table> T1: relaxamento spin-lattice (ou relaxamento longitudinal) tempo T2: relaxamento spin (ou relaxamento transversal) tempo

<ol>
	<li>Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+safety+issues+in+magnetic+resonance+imaging:+state+of+the+art.">Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art.</a> Radiol Med. 112, 491-491 (2007).</li><li>Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+spectral+analysis+of+kinetic+data+using+natural+lineshapes.">NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes.</a> Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).</li><li>Amara, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+vivo:+spectroscopy+provides+window+on+cellular+energetics.">Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics.</a> Methods. 46, 312-312 (2008).</li><li>Blei, M. L., Conley, K. E., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separate+measures+of+ATP+utilization+and+recovery+in+human+skeletal+muscle.">Separate measures of ATP utilization and recovery in human skeletal muscle.</a> J Physiol. 465, 203-203 (1993).</li><li>Marcinek, D. J., Schenkman, K. A., Ciesielski, W. A., Conley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+coupling+in+vivo+in+mouse+skeletal+muscle.">Mitochondrial coupling in vivo in mouse skeletal muscle.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C457-C457 (2004).</li><li>Paganini, A. T., Foley, J. M., Meyer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+dependence+of+muscle+phosphocreatine+kinetics+on+oxidative+capacity.">Linear dependence of muscle phosphocreatine kinetics on oxidative capacity.</a> Am J Physiol. 272, 501-501 (1997).</li><li>Sun, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+detection+of+gliomas+by+chlorotoxin-conjugated+superparamagnetic+nanoprobes.">In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes.</a> Small. 4, 495-495 (2008).</li><li>Marcinek, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mitochondrial+coupling+in+vivo+alters+cellular+energetics+in+aged+mouse+skeletal+muscle.">Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle.</a> J Physiol. 569, 467-467 (2005).</li></ol>

As etapas de pré-aquisição de sintonia / partida e calços são críticos para adquirir alta resolução espacial e uma relação sinal-ruído alto (SNR). Também é importante para monitorar as condições dos animais com um sistema de monitoramento de animais para manter um estado estável fisiológica para os animais durante as aquisições sinal para cumprir com a manipulação de animais sem crueldade e para impedir qualquer potencial artifactual medições. Os procedimentos explicados no protocolo podem ser mod...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inova 200 MR scanner/4.7 T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian/Bruker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Used for mouse MRI</td>
</tr>
<tr>
<td>Inova 300 NMR spectrometer/7 T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian/Oxford</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Used for MRS of mouse skeletal muscle</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

noninvasive in vivo small animal mri and mrs: basic experimental procedures

Pequenos animais de pesquisa Ressonância Magnética (RM) tem emergido como um elemento importante da pesquisa biomédica moderna, devido à sua natureza não-invasiva ea riqueza de informações biológicas que ele proporciona. MR não exige nenhum tipo de radiação ionizante e não invasiva pode proporcionar maior resolução e melhor relação sinal-ruído em comparação com a tomografia outras modalidades ou espectroscópicas. Neste protocolo, vamos concentrar-nos em pequenos animais ressonância magnética e espectroscopia de MR (MRI / MRS) para adquirir a forma não-invasiva de relaxamento ponderada<sup&gt; 1</sup&gt; H imagens do rato e para obter<sup&gt; 31</sup&gt; P espectros do músculo mouse. Este trabalho não tenta cobrir todos os aspectos de pequenos animais MRI / MRS, mas introduz procedimentos básicos de mouse MRI / MRS experimentos. O objetivo principal deste trabalho é informar os investigadores dos procedimentos básicos para<em&gt; In vivo</em&gt; MR experimentos em animais de pequeno porte. O objetivo é proporcionar uma melhor compreensão dos procedimentos básicos experimental para permitir que novos pesquisadores para o campo MR planejar melhor para não-MR componentes de seus estudos para que ambos MR e não-MR procedimentos estão perfeitamente integrados.

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Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Este trabalho descreve os procedimentos básicos de pequenos animais não-invasivo de MRI e MRS<em&gt; In vivo</em&gt;.

Não invasivo In Vivo Pequenos Animais MRI e MRS: Basic procedimentos experimentais

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

noninvasive-vivo-small-animal-mri-mrs-basic-experimental

Research

JoVE Journal

Biology

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

16.0K visualizações.  University of Washington. Este trabalho descreve os procedimentos básicos de pequenos animais não-invasivo de MRI e MRS In vivo.

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Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Rastreamento de Dinâmica de enxerto muscular em animais de pequeno In Vivo Fluorescent Imagem

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Biologia

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

Síntese de um<em&gt; Em vivo</em&gt; Sonda Apoptosis MRI-detectável

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

Nucleofection e In Vivo Propagação de Parasitas de Eimeria de Frango

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in all vertebrates by providing feedback to the brain and pituitary. Teleost fishes possess a higher degree of tissue plasticity and variation in reproductive&#160;strategies compared to mammals and appear to be useful models to investigate the role of sex steroids and the mechanisms by which they act. The removal of the main source of sex steroid production using gonadectomy together with blood sampling to measure steroid levels has been well-established and fairly feasible in bigger fish and is a powerful technique to investigate the role and effects of sex steroids. However, these techniques raise challenges when implemented in small size teleost models. Here, we describe the step-by-step procedures of gonadectomy in both males and female Japanese medaka followed by blood sampling. These protocols are shown to be highly feasible in medaka indicated by a high survival rate, safety for the life span and phenotype of the fish, and reproducibility in terms of sex steroid clearance. The use of these procedures combined with the other advantages of using this small teleost model will greatly improve the understanding of feedback mechanisms in the neuroendocrine control of reproduction and tissue plasticity provided by sex steroids in vertebrates.

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

The article describes a quick protocol to gonadectomize and sample blood from the small teleost fish, using Japanese medaka (Oryzias latipes) as a model, to investigate the role of sex steroids in animal physiology.

Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

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Não invasivo In Vivo Pequenos Animais MRI e MRS: Basic procedimentos experimentais