Wir danken Mitglieder der Rosenblatt Labor für wissenschaftliche Diskussionen, Anregungen und Kommentare. Wir möchten auch Mary Halloran, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt das Plasmid kodiert RFP-UtrCH und David Grunwald, der CK versorgt haben: GFP transgener Zebrafische. Danke auch an Gretchen König und die Mitarbeiter der Zentrale Zebrafisch Ressourcen an der Universität von Utah für exzellente Wartung und Pflege der Zebrafisch. Diese Arbeit wurde vom New Innovator NIH-NIGMS NIH Director des Award 1 DP2 OD002056-01 bis JR unterstützt. GTE wurde durch die NIH Multidisziplinäre Cancer Schulungsprogramm zu gewähren 5T32 CA03247-8 unterstützt.

Grundlegende Workflow für die Visualisierung von Aktindynamik während der Zellteilung Extrusion in der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch Die Epidermis der Entwicklung Zebrafisch besteht aus zwei verschiedenen Schichten, die Oberflächenschicht (oder Periderm) und einer basalen Schicht aus Zellen, die die Basalmembran 2 Kontakt besteht. Die Zellen der äußeren Oberflächenschicht Apoptose und werden aus dem Gewebe durch Extrusion 3 (Abbildung 1) eliminiert. Zur Visualisierung dieses Prozesses in Echtzeit, spritzen wir RNA-Kodierung rot fluoreszierendes Protein, fusioniert mit dem Calponin Homologie Domäne von Utrophin, ein Aktin-bindende Protein (RFP-UtrCH) 4,5, in einem-Zell-Stadium transgenen Zebrafisch Ausdruck grün fluoreszierende Protein (GFP ) unter dem geschichteten Epithelien Promoter Cytokeratin 8 6 (Abbildung 2A). Obwohl RFP-UtrCH ist ubiquitär in das Tier nach RNA-Injektion ausgedrückt, wir uns auf die oberflächlichen Zellen der Epidermis, die sowohl RFP und GFP zu Aktindynamik speziell folgen in der Epidermis (Abbildung 2B) zum Ausdruck zu konzentrieren. Danach behandeln wir die Larven mit G418 zu apoptotischen Extrusion und Bild der Epidermis und Aktin-Filamente mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop zu induzieren und zu erwerben 4D Datensätzen. Vor dem Start des Experiments <ol><li> In-vitro-Transkription der RNA aus einem linearisierten DNA-Template mit dem mMessage mMachine SP6 Kit (Ambion) und reinigen die capped RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen). Verdünnen Sie die RNA auf ~ 60ng/ul mit sterilem Wasser, machen 3-5μl Aliquots und bei -80 ° C bis fertig zur Injektion. Hinweis: Vermeiden Sie wiederholte Einfrieren / Auftauen zu einem Abbau der RNA zu verhindern. </li><li> Machen Sie eine Form, die Embryonen während der Injektion zu halten durch Gießen 40ml 2% Agarose in E3 Embryo Medium (E3) in einen 100 x 15mm Kultur Platte und Platzieren eines Mikroinjektion Form (Adaptive Science Tools, # I-34) in diesem Fach. Nachdem die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie das Werkzeug, um die Tröge in der Agarose aussetzen. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Pull Kapillare Nadeln für die Injektion mit Borosilikatglas mit Filamenten (OD 1,0 mm, ID 0,78, 10cm lang) und eine Sutter P-97 Pipette Puller bei den folgenden Einstellungen (Heat 485, Pull 50, Velocity 60, Delay / Uhrzeit 90, Druck 200 ). Hinweis: Verschiedene Arten von Glas wird die Optimierung der aufgeführten Bedingungen erfordern. </li><li> Make up 1% Low Melt (LM) Agarose in E3 und speichern 1ml Aliquots bei 42 ° C. Achten Sie darauf, wie Verdampfung von E3 aus den Beständen der Agarose-Konzentration erhöhen können. </li><li> Behalten erwachsenen Zebrafisch unter Standard-Laborbedingungen mit einem regelmäßigen Hell / Dunkel-Zyklus von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit 7. Die Nacht vor dem Experiment bis Fische zu paaren, indem 3 weibliche und 2 Männer in einem Tank durch eine Trennwand getrennt eingestellt. Am nächsten Morgen, ändern das Wasser in den Tank und ziehen Sie die Trennlinie, wenn das Licht angeht. </li></ol> 1. Die Injektion von RNA Encoding der fluoreszenzmarkierten Aktin-bindende Protein <ol><li> Auftauen RNA auf Eis. Add 0,5% Phenol Red an die RNA im Verhältnis 1:1 für eine endgültige RNA-Konzentration von ~ 30ng/μl und laden 1μl Lösung in eine gezogen Kapillarnadel von Back-Füllung. </li><li> Sammeln ~ 75 1-Zelle Stufe 8 CK: GFP Embryonen in E3. Pipettieren der gesammelten Embryonen in die Mikroinjektion Form mit einem 5 ¾ Pasteur-Pipette und sanft Orientierung der Embryonen in den Trog mit FST Dumont Nr. 5 Pinzette. Hinweis: Achten Sie darauf, schnell zu arbeiten, um zu vermeiden Injektion in eine multi-Zell-Stadium Embryos, die in Mosaik Ausdruck der injizierten RNA führen kann. </li><li> Unter einem Standard-Labor seziert Stereomikroskop, spritzen die RNA in den Dotter des Embryos mit einem Druck-kontrollierte Mikroinjektor (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-Injector). Ein roter Fleck (Phenolrot) sollte in den Embryo sichtbar nach der Injektion. Inject mindestens 50 Embryonen, die für jedes Experiment. (Siehe vorherige JoVE Protokoll für ein ausführliches Protokoll auf RNA-Injektion in Zebrafisch-Embryos 9). Hinweis: <ol type="A"><li> Ein Volumen von ~ 2nl sollte für die Injektion von RNA in einer Zelle Embryonen verwendet werden. Zur Bestimmung der Menge an RNA injiziert, verzichten Bolus der RNA in einem Tropfen Mineralöl auf einer geeichten Mikrometer Dia oder unter einem Mikroskop mit einer Skala bar in die Okulare gebaut. Der Tropfen der RNA sollte eine perfekte Kugel ist. Berechnen Sie den Betrag mit Hilfe der Gleichung geliefert: Volumen (in nl) = 4/3πr 3. Stellen Sie die Lautstärke, indem der Einspritzdruck oder die Uhrzeit auf dem Gerät geliefert. </li><li> Vorsicht ist auch auf die niedrigste Menge an RNA, die Visualisierung des Fluorophors kann spritzen, wie hohe Konzentrationen von RNA kann giftig sein, um den sich entwickelnden Embryo werden. Um festzustellen, angemessenen Ausdruck Ebene sollte eine Dosis-Wirkungs-Kurve experimentieren, bevor Sie das Experiment durchgeführt werden. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Sortieren Sie die Embryonen zu jedem unbefruchteten oder beschädigte Eier zu entfernen und alle restlichen Embryonen bei 28,5 ° C. </li><li> Nach 24 Stunden mit einem fluoreszierenden Präpariermikroskop auf Zebrafisch-Embryonen, die ein hohes Maß an GFP (Epidermis) und RFP (Aktin) Fluoreszenz haben zu wählen. Legen Sie die ausgewählten Embryonen bei 28,5 ° C bis bereit, mit der medikamentösen Behandlung, Apoptose zu induzieren gehen. </li></ol> 2. Induction of Cell Extrusion in Zebrafisch-Larven mit G418 Wir haben festgestellt, dass die Exposition gegenüber dem Aminoglykosid-Antibiotikum G418 oder Geneticin, Apoptose und Extrusion von epidermalen Zellen in der Entwicklung Zebrafischlarven 3 durch einen unbekannten Mechanismus verursacht. Wichtig ist, dass diese Behandlung funktioniert nur auf Larven, die 4 Tage nach der Befruchtung und älter sind. Wir finden, dass ~ 5-25 Zellen gefunden werden Extrudieren zu einem bestimmten Zeitpunkt aus dem fin Epithelzellen des G418 behandelt Larven Zebrafisch werden. Da die Menge der apoptotischen Zellen Extrudieren von Fisch zu Fisch variieren kann, empfehlen wir Montage mehrerer Fische für die Bildgebung. <ol><li> Sammeln und Platz 4 Tage nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischlarven ausstellenden sowohl GFP und RFP-Fluoreszenz in einem 35 x 10mm Kulturschale mit 3 Milliliter (ml) der E3. Man kann zu behandeln bis zu 25 Larven in dieser Größe Kulturschale. </li><li> Vorsichtig wieder die Medien mit 3mLs der E3 mit 1mg/ml G418 und inkubieren Larven in das Medikament für 4 Stunden bei 28,5 ° C. Beachten Sie, dass G418 lichtempfindlich ist, so achten Sie darauf, halten Sie die Kulturschale bedeckt oder in der Dunkelheit. </li><li> Entfernen Sie das Medium und ersetzen mit vorgewärmten 28,5 ° C E3 Media mit 0,02% Tricaine und fahren Sie mit der Montage der Larven. </li></ol> 3. Montage Zebrafischlarven for Imaging <ol><li> Transfer 3 Larven in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, und entfernen Sie die meisten der E3, nachdem der Fisch sinken auf dem Boden des Röhrchens. Wir haben festgestellt, dass bis zu 3 Tiere ordnungsgemäß montiert werden kann, bevor die Agarose erstarrt. </li><li> Unter Anwendung eines Cut Pipettenspitze, pipet 120ul von 1% LM-Agarose (42 ° C) in die Röhre, mischen und dann vorsichtig pipet die Larven und Agarose Mischung auf dem Deckglas in den Boden eines MatTek Kulturschale. </li><li> Mit einem FST Pin-Halter mit einem Steckbolzen oder Wolfram Nadel, schnell orientieren sich die Larven, so dass sie gerade und flach gegen die Deckglas des MatTek Gericht. Hinweis: Wir verwenden in der Regel ein Zylinderstift zum ersten Orientierung die Larven und dann ein L-förmiger Stift, um sicherzustellen, sie sind gegen die Deckglas flach und verhindert Schäden an den Proben. </li><li> Nachdem die Agarose erstarrt ist, vorsichtig die Schale fuellen E3 mit 0,02% Tricaine. Hinweis: Alternativ G418 kann auf der E3 in der Imaging-Gericht zu veranlassen Extrusion weiter hinzugefügt werden, obwohl langfristige Exposition gegenüber 1mg/ml G418 die Larven töten. </li></ol> 4. Live-Imaging von Aktin Dynamics und Individual Epithelzellen Verhalten während der Zellteilung Extrusion mit einem Spinning Disc Konfokalmikroskop Wir haben festgestellt, dass der gesamte Prozess der apoptotischen Extrusion aus der Epidermis entwickelt Zebrafischlarven ca. 20 Minuten 3 nimmt. Hier zeigen wir, wie ein Zeitraffer-Imaging-Experiment zu einer Reihe von z Ebenen durch eine einzige Schicht der Epidermis Zebrafisch zu sammeln, um die Extrusion zu visualisieren Setup. Wir haben herausgefunden, dass typische Weitfeld Fluoreszenzmikroskope signifikante Ausbleichen des Aktin-Filamenten und nicht für Zeitraffer Bildgebung ermöglichen verursachen. Daher unsere Resolution zu maximieren und zu verhindern, Bleichen, verwenden wir eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop. Im Folgenden beschreiben wir, wie Sie das Experiment mit dem Andor IQ-Software mit einer Nikon-Mikroskop, obwohl die Prinzipien diskutiert, um ähnliche Mikroskop Set-ups angewendet werden können. <ol><li> Zuerst auf der Argon (zur Anregung von GFP bei 488nm) und HeNe (zur Anregung des RFP bei 561nm) Laser, Mikroskop, Kamera und epifluoreszenten aufleuchtet. </li><li> Innerhalb der Andor IQ-Software (Version 1.10.1), erstellen Sie eine Zeitreihen-Protokoll enthält die Wellenlängen Sie Bilder, die Häufigkeit der Intervalle zwischen Bild erfasst und die Zahl Zeiten der Eroberung sollte wiederholt werden. </li><li> Sanft legen Sie die MatTek Schale mit Ihrer Probe auf dem Mikroskoptisch und verwenden Sie ein 20x-Objektiv mit Durchlicht auf die Larven zu konzentrieren. </li><li> Bewegen Sie den 40X Wasserimmersionsobjektiv (NA 0,8) in die richtige Position. Mit diesem Ziel können wir Film ca. 20-25 Zellen pro Feld, das uns an zelluläre Verhaltensweisen während der Extrusion zu folgen, während auch die Lösung sub-zellulären Aktin-Dynamik ermöglicht. Hinweis: Der gleiche Montage-und Imaging-Strategien, um aufrechte Mikroskope angewendet werden, obwohl ein 40X Wasserimmersionsobjektiv mit einem großen Arbeitsabstand verwendet werden muss. </li><li> Vorsichtig einen Tropfen Wasser auf der Oberseite des 40x-Objektiv und raschen Platzierung der MatTek Schüssel an der Spitze. Nichte: Zeiss Immersol Eintauchen Lösung kann auch verwendet werden, wenn Verdunstung des Wassers ist ein Problem sein. </li><li> Identifizieren Sie die Probe mit Phase oder DIC Beleuchtung und verwenden Sie dann 488nm Epifluoreszenz, sich speziell auf die GFP positive Epidermis. </li><li> Wechseln Sie zu konfokalen Scanning-Modus. Passen Sie die Laserintensität und Belichtungszeit für jeden der Kanäle (488nm und 561nm) entsprechend. Achten Sie auf die Laserleistung und Belichtungszeit für eine optimale Erkennung des Signals auszugleichen und jede Bleichen oder Toxizität zu verhindern. </li><li> Zur Identifizierung Extrudieren Zellen verwenden Epifluoreszenz zur Visualisierung der GFP-markierten Epidermis und identifizieren eine Gruppe von Zellen in einem klassischen Rosette Muster, bestehend aus einer Sammlung von umgebenden Zellen ein kleiner runder Zellen in der Mitte. Mit der konfokalen Scanning-Modus, sollte es auch eine Anreicherung des RFP-markierten Aktin sichtbar wie ein Ring um den kleinen runden Zellen in der Mitte, ein Markenzeichen der Zelle Extrusion werden. Sobald Sie ein Extrudieren Zelle identifiziert, schnell auf das Mikroskop 4D (XYZ-Time) konfokale Datensätze erwerben gesetzt. </li><li> Stellen Sie den oberen und unteren Punkte innerhalb der z-Ebene auf eine einzelne Schicht der Epidermis, einschließlich der Extrusion Zelle sichtbar zu machen, und wählen Sie die Schrittweite. Für Zeitraffer-Bildgebung, die Intervalle für die Bilderfassung und Anzahl der Wiederholungen. Zum Beispiel haben wir in der Regel erwerben z-Serie Spanning 5-10 um, mit einer 1 um Schritt Größe, alle 1-2 Minuten für 30 Minuten. </li><li> Um die Daten anzuzeigen, wir machen typischerweise 3-D-Projektionen der z-Serie, und speichern Sie die Daten als eine Filmdatei, die kompatibel mit Quick Time (Apple) eingestellt ist. Auf diese Weise können wir visualisieren Kontraktion des Aktin-Ring und epithelialen Verhaltensweisen, um den sterbenden Zelle im Laufe der Zeit auftreten. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Schematische Darstellung der apoptotischen Extrusion. Aktinfilamente sind rot dargestellt, sind GFP positive Zellen der Epidermis grün. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Experimentelle Workflow. A. Schematische Darstellung des Workflow für das Experiment. B. Expression von RFP-UtrCH in der Epidermis eines 4dpf CK: GFP Zebrafisch. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Standbilder (z-Projektionen) aus einem Zeitraffer-Film, Live-Aktindynamik folgt während des Prozesses der epithelialen Zell-Extrusion. Die Pfeile zeigen den Ring aus Aktin durch benachbarte Zellen, die Verträge und schließt sich im Laufe von 2 Minuten gebildet.

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	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

Animal Welfare Assurance Alle Verfahren in diesem Protokoll unter Verwendung der Zebrafisch, Danio rerio durchgeführt, wurden von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) an der University of Utah (Animal Welfare Assurance # 10-07017).

Die hier beschriebene Protokoll zeigt eine einfache und unkomplizierte Methode, um den Prozess der Extrusion in einer Live-Epithelgewebe zu visualisieren. Diese Art von Experiment ermöglicht es uns, Feinheiten der Aktin-Dynamik nicht zuvor in fixiertem Gewebe Analysen geschätzt zu untersuchen, und daher ergänzt gemeinsamen Immunfluoreszenz-Methoden. Wir können dieses Protokoll in Kombination mit chemischen Inhibitoren oder genetische Mutanten eine bessere Analyse der Extrusion und Studium Erkrankungen mit dem Scheit...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Catalog Number </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reagens </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reagens </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Crossing Tanks </td><td> Werkzeug </td><td> Thoren aquatischer Systeme </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Die Pipet Pump </td><td> Werkzeug </td><td> Bel Art Products </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ Pasteurpipette </td><td> Werkzeug </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroinjektion Mold </td><td> Werkzeug </td><td> Adaptive Science Tools </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> 100x15mm Kulturplatte </td><td> Werkzeug </td><td> Fischer </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown Mikropipette Puller </td><td> Werkzeug </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Modell P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren mit Filament </td><td> Werkzeug </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> B1400-78 bis 10 </td><td> OD 1,0 mm, ID 0.78mm, 10cm Länge </td></tr><tr><td> Aufbewahrung der Elektroden Jar </td><td> Werkzeug </td><td> World Precision Instruments </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Phenol Red </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% in DPBS </td></tr><tr><td> Pressure Controlled Mikroinjektor und Mikromanipulator </td><td> Werkzeug </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> 35x10mm Kulturschale </td><td> Werkzeug </td><td> CELLSTAR </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> Reagens </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / mL in dH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Pinzetten </td><td> Werkzeug </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm Pin-Halter </td><td> Werkzeug </td><td> Feine Science Tools </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Legen Pins </td><td> Werkzeug </td><td> Feine Science Tools </td><td> 26007-02 und-03 </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Kulturschale mit 1,5 Deckglas </td><td> Werkzeug </td><td> MatTek </td><td> P35G-1,5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Low Melt Agarose </td><td> Reagens </td><td> Fischer </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Präpariermikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Präpariermikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescent Präpariermikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning Disc Konfokalmikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse-Ti </td><td> Ausgestattet mit einem Yokagawa Spinning Disc-Kopf </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Kamera </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micron quadratischen Pixeln </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

Homöostatische Wartung von epithelialen Geweben erfordert die kontinuierliche Beseitigung von geschädigten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Unsere Studien haben herausgefunden, dass sterbende Zellen Signale zu senden, um ihre Nachbarn zu leben, um Form und Vertrag einen Ring aus Aktin und Myosin, dass es wirft aus der epithelialen Blatt beim Schließen etwaiger Lücken aus seiner Ausfahrt hätten ergeben können, bezeichnet ein Verfahren, Zell-Extrusion 1. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Induktion und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis. Zur Visualisierung Extrusion, injizieren wir ein rot fluoreszierendes Protein markierte Sonde für F-Aktin in einem-Zell-Stadium transgenen Zebrafisch-Embryos, die grün fluoreszierendes Protein in der Epidermis und induziert Apoptose durch Zugabe von G418 zu Larven. Wir verwenden dann Zeitraffer-Imaging auf eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop zu Aktindynamik und Epithelzellen Verhalten während des Prozesses der apoptotischen Extrusion beobachten. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die Extrusion in Live-Epithelien zu untersuchen und eine Allee zu Erkrankungen durch das Versäumnis, apoptotische Zellen zu eliminieren verursacht Studie liefern.

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Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

live-imaging-cell-extrusion-from-epidermis-developing

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Aufrufe.  University of Utah. Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.

Serie: Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.