Wir danken Dr. Amir Aharoni für seine Unterstützung und Geula Dawydow, Noam Grimberg und Chen Guttman für ihre Ratschläge und Kommentare.

1. Klonierung und Expression von Mama Gene in E. coli Das mutierte Gen mamAΔ41 wurde unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus genomischer DNA von Magnetospirillum magneticum AMB-1 mit Primer: 5&#39;-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 &#39;und 5&#39;-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3&#39;. In der amplifizierten DNA-Fragmente wurde eine NcoI-Stelle am ATG eingeführt und die Terminationscodon wurde mit einem ScoI Ort ersetzt. Die Fragmente wurden mit NcoI und SacI verdaut und kloniert in den jeweiligen Standorten der pET52b (+), was zu pET52bMamAΔ41-AMB1. In diesem Konstrukt wurde die mamAΔ41 Gen in-frame mit dem 10-His-Tag am C-Terminus fusioniert. Das Plasmid wurde in E. coli-Stamm BL21 elektroporiert. E.-coli-Stamm BL21 beherbergen pET52bMamAΔ41 in auto-Induktion wurde angebaut (15)-Medium mit Ampicillin (50 mg / ml) 310 ° K für 3 Stunden. Der Anbau Temperatur wurde dann von 310 ° bis 300 ° K verschoben und gewartet für weitere 48 h bei 300 ° K. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 5465g für 10 min bei 277 ° K. geerntet 8 Liter Kultur produziert 60 Gramm feuchten Zellpellet. 2. Bioinformatics Berechnungen Berechnungen von Molekulargewicht (MW), nach Aminosäuren-Sequenz und die vorhergesagte Aufnahme von 1mg/1ml von Protein in 280nm, mit dem ProtParam Server (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Für 10His-Tag-MamAΔ41 der MW ist 22529 Da (240 Aminosäuren) und für MamAΔ41 (mit 9 Aminosäuren nach His-tag Entfernung von Thrombin links) Mw ist 20596.5Da (187 Aminosäuren). Der vorhergesagte Aufnahme von 1mg/1ml von Protein in 280nm für 10His-Tag-MamAΔ41 ist 0,595 und für MamAΔ41 ist 0,579. Darüber hinaus bedeutet die Aminosäure-Sequenz enthalten keine Cysteinreste. Daher sind Reduktionsmittel nicht während der Reinigung benötigt. 3. Reinigung von MamAΔ41 <ol><li> Für Stammlösung Vorbereitung, abwiegen und vorbereiten (200 ml) in den folgenden Konzentrationen: Imidazol (MW 228,2 g / mol) 4M Lösung, NaCl (Mw 58,44 g / mol) 5M-Lösung, Tris-HCl (Mw 121,3 g / mol ) 1M-Lösung, pH-Wert einstellen = 8. Fügen Sie doppelt destilliertem Wasser (DDW) und mischen mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Filter-Lösungen mit 0,22 &amp;mgr; m-Filter und halten bei Raumtemperatur. </li><li> Vorbereiten und Filter 6 frischen Puffer aus Stammlösungen (Tabelle 1). </li><li> Verdünnen und Suspend-Zellen in Puffer A im Verhältnis 1:2, Gramm Zellen Puffervolumen (ml). </li><li> Add 10 &amp;mgr; l für jede 10gr von Bakterien der DNase I (1 mg / ml), um DNA-Fragmente in der Probe zu brechen. 1ml für jede 20gr von Bakterien EDTA frei Protease-Inhibitor-Cocktail. Inkubieren für 20 min auf Eis. </li><li> Unter aufgeschlossenen Zellen in zwei Zyklen von Französisch Presse bei 25.000 psi. Im Gegensatz zu Ultraschall ist die Französisch drücken bei hoher Lautstärke (&gt; 10ml) Zelle Extrusion, indem sie den Zellen unter hohem Druck durch eine dünne Öffnung gerichtet. Der Kolben sollte auf Eis 10 Minuten vor ihrer Verwendung und Montage durch Temperatur Aufbau gekühlt werden. </li><li> Übertragen Sie die lysierten Zellen in 25ml Ultrazentrifuge Rohre und Balance ihnen genau (50mg) mit Puffer A, bis die Probe erreicht das Rohr s Ausschnitt. </li><li> Separate Zelltrümmer durch Ultra-Zentrifugation bei 270.000 g für 1 Stunde bei 277 ° K. </li><li> Bereiten Sie eine hausgemachte Schwerkraft Ni NTA-Säule (2,5 cm Durchmesser) durch Zugabe von 4 ml Ni NTA-Harz, das in 20% Ethanol konserviert sind, auf die Säule. Lassen Sie die Flüssigkeit fallen komplett, dann mit 40 ml DDW waschen und lassen Sie die Flüssigkeit fallen vollständig aus. Voräquilibriert das Harz in der Säule mit 40 ml Puffer A </li><li> Übernehmen der löslichen Fraktion von ultra-Zentrifugenröhrchen auf die Schwerkraft Ni NTA-Säule. Lassen Sie die Flüssigkeit fallen, sammeln Flow-Through-(ungebundene Proteine) und erhalten bei 277K. </li><li> Sammeln Sie Pellet Probe aus dem ultra-Zentrifugenröhrchen mit einem kleinen Tipp, um das Pellet Schrott. Mix der Spitze in 50 ul 5% β-Mercaptoethanol in 2X SDS-PAGE-Probenpuffer. </li><li> Die Säule wird mit 100 ml Puffer B Lassen Sie die Flüssigkeit fallen, sammeln Flow-Through und erhalten bei 277K. </li><li> Bereiten Sie 15 markierte Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml). </li><li> Elution - in der Nähe Spalte Ventil und laden Sie dann 1 ml Puffer C auf die Säule; inkubieren 3 min von Öffnungs-und Flow-Through-Auflistung. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Eluieren Rest der Suspension bei 1 ml Puffer C-Schritten und Schließen des Ventils. </li><li> Messen der OD bei 280 nm der Fraktionen und bewerten Ort der Protein-Peak, wenn die OD ist&gt; 0,3, zusätzliche Proben notwendig sind. </li><li> SDS-PAGE-Analyse der gesammelten Fraktionen. Eine solche Analyse sollte auch mit den folgenden Proben durchgeführt werden, ungebundenen Proteine ​​Flow-Through-, Wasch-Flow-Through-und uLTRA-Zentrifugationspellet Probe. Mix 10 &amp;mgr; l von jeder Probe mit 10 &amp;mgr; l 5% β-Mercaptoethanol in 2X SDS-PAGE-Probenpuffer. Laden Sie die Proben auf 15% SDS-PAGE und führen Sie für 45 min in 180 Volt. </li><li> Stain das Gel in 15 ml InstantBlue Lösung für 1 Stunde geschüttelt. Stellen Sie sicher, dass die Kunststoff-Box bedeckt ist und vor Licht geschützt. </li><li> Bewerten Gel, wenn Proteinexpression ist hoch und spezifische gemäß der indikativen Bands, zusammenführen ausgewählt eluierten Fraktionen. </li><li> Um 10-His-Tag zu entfernen, fügen Rinderthrombin (10 Einheiten / ul), 10 &amp;mgr; l Thrombin pro 1 mg Protein, entsprechend der Empfehlung des Herstellers der kombinierten Probe. </li><li> Die Dialyse ist für überschüssige Imidazol Entfernung verwendet und NaCl-Konzentrationen für die Stufen beim Ionenaustausch Bindung benötigt verringern. Für die Dialyse, schneiden die gewünschte Länge von 7 kD molecular weight cut off (MWCO) Dialyseschlauch. Waschen mit DDW und machen einen Knoten an einem Ende (oder Siegel mit Clips). Transfer fusionierte Protein-Lösung auf den Beutel während Verlassen etwas Platz am oberen und Klemmung. </li><li> Tauchen Sie die Dialyseschlauch in 4 Liter gekühltes Dialyse-Puffer (Buffer D). Rühren Sie die Lösung langsam über Nacht bei 277 ° K. </li><li> Nehmen Sie den Dialyseschlauch aus dem Becherglas, machen einen kleinen Schnitt und den Transfer des Proteins auf 50ml Tube. </li><li> Ionenaustausch-Chromatographie: Montage vorverpackten MonoQ 4.6/100 PE Spalte auf Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC). Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen (CV) von DDW gefiltertes Wasser. Equilibrated die Säule mit 5 SV Puffer D. </li><li> Waschen Sie die Probenschleife mit DDW (zwei Loop-Volumes) und wiederholen Sie mit Puffer D. Laden des Proteins in der Probenschleife. </li><li> Spritzen Sie die Proteinprobe (Durchfluss von 1 ml / min) und sammeln Fraktionen für SDS-PAGE Detektion von Proteinen unbegrenzt. </li><li> Wenn das erste Protein Volumen (Schritt 3,23) größer ist als Injektionsschleife, wiederholen Sie die Schritte 3,25-3,26, ohne Waschen der Schleife, bis die gesamte Probe auf der Säule geladen wird. </li><li> Die Säule wird mit 3 CV des Puffers C, um grenzenlose Proteine ​​zu entfernen. </li><li> Eluieren des Proteins mit einer 60 min linearer Gradient von 40 2000mm NaCl zwischen Puffer D &amp; E (bei 100% Puffer E das Ende der Steigung), Fließgeschwindigkeit 1 ml / min (obwohl höhere Strömungsgeschwindigkeiten in den Kosten genutzt werden können größere Volumina, aber weniger konzentriert, Protein-Peaks). Sammeln Proteine ​​Gipfel, wie sie in der 280nm-Chromatogramm erscheinen. </li><li> Reinigen Sie vor Füllkörperkolonne nach Empfehlung herzustellen. </li><li> SDS-PAGE-Analyse der gesammelten Fraktionen. Eine solche Analyse sollte mit den folgenden Proben durchgeführt werden, unbounded Proteine ​​Flow-Through-und Protein-Peaks Durchströmung. Führen Sie das SDS-PAGE und Färbung wie in den Schritten von 3,17 bis 3,18 zu nennen. </li><li> Bewerten Gel für Proteinbanden Existenz der vorhergesagten Mw nach dem Protein vor-gefärbten Marker. Merge ausgewählt Elutionsfraktionen, dass die entsprechenden Proteine ​​enthalten. </li><li> Dialysieren der fusionierten Proben, um NaCl-Konzentrationen für Größenausschlusschromatographie nötig zu senken. Führen Sie die Dialyse wie in den Schritten 3,21-3,23 gegen Puffer F. genannten </li><li> Konzentrieren Sie sich das Protein Probe mit einem Vivaspin-15 10.000 MWCO zu 8 mg / ml in einer Tischzentrifuge, 4000 Umdrehungen pro Minute. Validate Wunsch Konzentration durch Messung der OD bei 280 nm in Quarz-Küvette. Wenn das Protein zu konzentriert zu verdünnt ist, mit Puffer F und messen Sie erneut. </li><li> Montieren Größenausschlusschromatographie vorverpackten Spalte HiLoad 26/60 Superdex 200, auf FPLC; Die Säule wird mit 3 CV von DDW gefiltertes Wasser. Equilibrated die Säule mit 3 SV Puffer F. </li><li> Wash Injektionsschleife mit 5 ml DDW (zwei Loop-Volumes) durch das gleiche Volumen mit Puffer F. gefolgt Laden nicht mehr als 4 ml der Proteinprobe in die Probenschleife. </li><li> Spritzen Sie die Proteinprobe (Flussrate von 3,5 ml / min) und sammeln Proteine ​​Peak-Fraktionen, wie sie es dem 280nm-Chromatogramm erscheinen. Lassen Sie den Puffer fließen, bis es Säulenvolumen erreicht. </li><li> Wenn das erste Protein Volumen (Schritt 3,23) größer ist als Injektionsschleife, wiederholen Sie die Schritte 3,25-3,26, ohne Waschen der Schleife, bis die gesamte Probe auf der Säule geladen wird. </li><li> Reinigen Sie vor Füllkörperkolonne nach der Herstellung Empfehlung. </li><li> SDS-PAGE-Analyse der gesammelten Fraktionen. Eine solche Analyse sollte mit dem Protein-Peaks Proben durchgeführt werden. Führen Sie das SDS-PAGE und Färbung wie in den Schritten von 3,17 bis 3,18 zu nennen. </li><li> Bewerten Gel: Wenn Protein-Peaks spezifisch sind, in die richtige vorhergesagt Mw nach dem Protein vor-gefärbten Marker und nur eine Bande sichtbar ist verschmelzen ausgewählte eluierten Fraktionen des entsprechenden Proteins. </li><li> Konzentrieren Sie sich Proteinprobe mit einem Vivaspin-15 10.000 MWCO bis&gt; 20 mg / ml in einer Tischzentrifuge, 4000 Umdrehungen pro Minute. Validate Wunsch Konzentration durch Messung der OD bei 280nm. Das gereinigte MamAΔ41 wurde dann auf 26,5 mg / ml für die Kristallisation konzentriert. </li> &lt;li&gt; Bestätigen Probe Reinheit und Identifizierung von Proteinen mittels Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation (MALDI-TOF). </li><li> Wenn das Protein nach dem Massenspektrometer und SDS-PAGE gereinigt wird, teilen Sie die konzentrierte MamAΔ41 vor, markierte Eppendorf-Röhrchen, 25-50 ul Protein in jeder. </li><li> Flash in flüssigem Stickstoff und lagern bei 193 ° K. eingefroren </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Wenn dieses Protokoll korrekt ausgeführt wird sollte man sich hochreine, Größe homogen und konzentrierte Protein-Proben. Diese Protein-Proben werden dann zur Kristallisation Studien sowie biochemische Untersuchungen, wie Enzymkinetik, Bindungsaffinität und mehr bereit. Hier beschriebenen repräsentativen Ergebnisse der wichtigsten Schritte bei der Reinigung Protokoll. SDS-PAGE-Analyse von Elutionsprofil Ni-NTA-Affinitätssäule sollte hoch offenbaren über exprimierten Proteins in der löslichen Fraktion an geeigneten MW ~ 22kDa (Abbildung 1). Das SDS-PAGE-Analyse sollte auch zeigen, Minimum, wenn jedes Protein in der grenzenlosen Proteine ​​Flow-Through-, Wasch-Flow-Through-und ultra-Zentrifugationspellet Probe. Wenn große Bands des entsprechenden Proteins in diesen Proben nicht erscheinen sollte man überlegen, falsch Puffer Vorbereitung, Probleme in Zellaufschluss oder Probleme in der Kultur-induzierenden Bedingungen und Wachstum. Die Ionenaustauschchromatographie ist vorgeformt, um zwischen unseren wünschenswert Protein zu anderen E. coli-Proteine, die an die Nickel-Harz (zB aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen oder Histidin / negative Aminosäuren reiches Protein-Schleifen) und uncut His-Tagged wünschenswert Protein gebunden waren getrennt. Diese Spalte trennt Proteine ​​nach ihrer Affinität zu positiv geladenen Harz unter zunehmendem NaCl-Konzentrationen. Stark negativ geladenen Proteine ​​werden in höheren NaCl-Konzentrationen eluiert appose zu negativ geladenen moderieren. Die Vorteile dieser Spalte sind hohe Strömungsgeschwindigkeit und Bindungsfähigkeit. Die Ionenaustausch-Chromatogramm (Abbildung 2) zeigt eine gute Trennung zwischen 3 Proteine ​​Populationen in zunehmenden NaCl-Konzentration. SDS-PAGE-Analyse ist notwendig, um MW jeder Population zu bestimmen, die Isolierung des wünschenswertes und Bewertung, ob weitere Reinigungsschritte notwendig sind. Die erste Bevölkerung MamAΔ41 (~ 20 kDa), während die zweite Population ist MamAΔ41 + His Tag (~ 22kDa), die nicht von bovinem Thrombin gespalten und die dritte Bevölkerung ist in SDS-PAGE aufgrund der geringen Konzentration nicht nachweisbar. Wenn die Proteine ​​Peaks nicht getrennt sind klar sollte man überlegen, falsch Puffer Vorbereitung oder Änderung der Steigung der NaCl-Gradienten. Größenausschlußchromatographie ist vorgeformt, um zwischen unseren wünschenswert Protein zu anderen E. coli-Zelle Proteine, die das Ni-NTA-Harz gebunden waren und nicht während der Ionenaustauschchromatographie getrennt zu trennen. Diese Spalte trennt Proteine ​​nach ihrer Größe. Große Proteine ​​werden in kleineren Elutionsvolumen im Gegensatz zu kleinen, die in größeren Mengen eluiert werden eluieren. Die Spalte Chromatogramm (Abbildung 3) zeigt eine gute Trennung der erwünschten Proteins als eine Haupt Bevölkerung. Die Bevölkerung scheint in geeigneten Monomer Größe mit einem Molekulargewicht von ~ 20 kDa eluieren. Die Anwesenheit von ~ 80 kDa-Bande (E.coli typische Protein, das Ni-NTA-Harz bindet) in SDS-PAGE vor Spalte Laden erkannt und verschwindet während dieses Laufes. Da die Konzentration dieser ~ 80 kDa-Protein ist niedrig zu beginnen, ist die Bevölkerung nicht in dem Chromatogramm durch ihre Verdünnung und SDS-PAGE-Analyse ist notwendig, um die Reinigungsleistung zu bestimmen scheinen. Wir empfehlen das Laden einer verdünnten und konzentrierten Probe der Hauptgipfel der SDS-PAGE so dass man sicher bestimmen konnte das Vorhandensein eines reinen Proteins in der entsprechenden MW. Zu diesem Zeitpunkt wird das Protein gereinigt und seine Homogenität sollte durch MALDI-TOF ausgewertet werden. Diese Analyse zeigte, ein Protein in MW 20347 Da und ein weiteres in Mw von 10176 Da (Abbildung 4). Die ~ 10 kDa-Protein ist die ~ 20 kDa Protein berechnet verdoppelt. Die prognostizierte MW MamAΔ41 mit den 9 Aminosäuren nach His-Tag Entfernung links war 20596,5 Da. Durch Vergleich mit den erhaltenen MALDI-TOF MW fanden wir, dass sie 248 Da voneinander entfernt sind. Diese Verschiedenheit kann von MALDI-TOF Messfehler und / oder durch gemeinsamen Abbau der ersten Methionin und Glycin die zweite Folge. Zum Schluss wird das Protein hoch gereinigt und kann für weitere Experimente verwendet werden. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Buffer Formulierungen. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Vertreter SDS-PAGE-Analyse von Ni-NTA-Säule Reinigung Von rechts nach links;. P-Ultrazentrifuge Pellet (3,11 Protokoll Schritt), W-wash (3,12 Protokoll Schritt), U-unbounded Proteine ​​(3,10 Protokoll Schritt), E- fünf Bahnen der Elution samples (3,14 Protokoll Schritt), M - Protein-Marker (Zahlen geben MW). Der Pfeil zeigt MamAΔ41. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Analyse der Ionenaustauschchromatographie Schritt (a) Ionenaustauscher (MonoQ Spalte) Chromatogramm; Blue - Absorption 280 nm, stellt Proteinkonzentration, Green-NaCl-Konzentration, Red - Anzeige der Fraktionen gesammelt. (B) Repräsentative SDS-PAGE-Analyse der Ionenaustausch Reinigungsschritt. Von links nach rechts; M - Protein-Marker (Zahlen geben Mw), A6 - erste Peakfraktion, A8-Sekunden-Peak-Fraktion. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Größenausschlußchromatographie Analyse (a) Größenausschlußchromatographie (Superdex 200-Säule) Chromatogramm; Blue - Absorption 280 nm, stellt Proteinkonzentration, Red Angabe der Fraktionen gesammelt. (B) Repräsentative SDS-PAGE-Analyse von Size Exclusion Reinigungsschritt. Von links nach rechts; M-Protein-Marker (Zahlen geben MW), Prei-pre-injizierten Probe, A4-6 kombiniert Fraktion aus der ersten Spitze gesammelt, A4-6D-verwässert-Fraktion aus der Spitze gesammelt. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation (MALDI-TOF)-Massenspektrum des gereinigten MamAΔ41. Die Matrix ist Sinapinsäure (SA). MamAΔ41 bei 20347 Da gezeigt, auch gezeigt, ist das doppelt geladene Spezies von MamAΔ41 bei 10176 Da.

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Proteinreinigung ist der wichtigste Schritt in jedem Proteine ​​biochemische oder strukturelle Untersuchungen. Da jedes Protein ist einzigartig mit seinen eigenen Verhaltens, braucht man, um seine Eigenschaften zu definieren und ändern ihre Reinigung entsprechend. Zielprotein sollte als ein erster Schritt zur Reinigung mit bioinformatischen Methoden analysiert werden. Sie werden verwendet, um das Ziel iso-elektrischen Punkt zu berechnen, bewerten ihre Notwendigkeit für reduzierende / oxidierende Umwelt und ihrer N...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>French Press</td>
<td>Equipment</td>
<td>Thermo scientific</td>
<td>FA-078A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pressure cell</td>
<td>Equipment</td>
<td>Thermo scientific</td>
<td>FA-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sorvall</td>
<td>Discovery 90SE</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rottor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>Ti60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml</td>
<td>Equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>BC-355618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns</td>
<td>Equipment</td>
<td>BioRad</td>
<td>737-2521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA His Bind resin</td>
<td>Equipment</td>
<td>Novagen</td>
<td>M0063428</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrophotometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Amersham Biosiences</td>
<td>Ultraspec 2100 pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quartz cuvette</td>
<td>Equipment</td>
<td>Hellma</td>
<td>104-QS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare Biosciences</td>
<td>28-4062-64</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ion exchange column &#x2013; MonoQ 4.6/100 PE</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare Biosciences</td>
<td>10025543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare Biosciences</td>
<td>17-1071-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centricon - Vivaspin15 &#x2013; 10,000 MWCO</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
<td>VS1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Table centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Thermo scientific</td>
<td>IEC CL30R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MALDI-TOF</td>
<td>Equipment</td>
<td>Bruker Daltonics</td>
<td>Reflex IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioLab</td>
<td>20092391</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>FRUTROM</td>
<td>235553470</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imidazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>288-32-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA free protease inhibitors cocktail</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-8849</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dnase I (Deoxyribonuclease I)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Thrombin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher BioReagents</td>
<td>BP25432</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioLab</td>
<td>07132391</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soudim Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioLab</td>
<td>19822391</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beta-mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-3148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>InstantBlue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Expedeon</td>
<td>1SB01L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fermentas</td>
<td>SM0671</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

purification of the m. magneticum strain amb-1 magnetosome associated protein mama&delta;41

Magnetotaktische Bakterien umfassen eine heterogene Gruppe von aquatischen Mikroorganismen, die in der Lage, sich entlang geomagnetischen Feldern orientieren werden. Dieses Verhalten wird angenommen, dass die Suche nach geeigneten Umgebungen Hilfe<em&gt; (1)</em&gt;. Diese Fähigkeit der Magnetosomen verliehen wird, Bläschen eine subzelluläre Organelle, die aus einer linearen Kette Montage von Lipid besteht jeder in der Lage, biomineralize und legen Sie ein ~ 50-nm-Kristall von Magnetit oder Greigit. Eine Hauptkomponente der Magnetosomen, die nachweislich für die Bildung von funktionalen Vesikeln erforderlich war, ist Mama. Mama ist eine sehr reichliche Magnetosomen-assoziierten Protein, das eine der am besten charakterisierte Magnetosomen-assoziierten Proteinen ist<em&gt; In vivo</em&gt;<em&gt; (2-6)</em&gt;. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Reinigung von Mama, die, obwohl sie studiert<em&gt; In vivo</em&gt;, Haben keine klaren funktionellen oder strukturellen Details für sie identifiziert worden. Bioinformatik Analyse ergab, dass Mama ein Tetra-tricopeptide wiederholen (TPR), die Protein ist. TPR ist ein Strukturmotiv als solches oder als Teil eines größeren fach in einer Vielzahl von Proteinen gefunden, es dient als Vorlage für die Protein-Protein Interaktionen und vermittelt Multi-Protein-Komplexe<em&gt; (7)</em&gt;. TPRs sind in vielen wichtigen Aufgaben in eukaryotischen Zellorganellen Prozesse und vieler bakterieller Signalwege beteiligt<em&gt; (8-14).</em&gt; Um Mama zu verstehen, ein einmaliges TPR enthält Eiweiß, ist hoch gereinigtes Protein in einem ersten Schritt erforderlich. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen die Reinigung Protokoll für eine stabile Mama Deletionsmutante (MamAΔ41) aus<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

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Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Mama ist eine einzigartige Magnetosom assoziierten Protein, das nachweislich in Magnetosomen Aktivierung beteiligt sein sollte. Hier präsentieren wir die Aufreinigungsprotokolls von Mama Deletionsmutante (MamAΔ41) aus<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

purification-m-magneticum-strain-amb-1-magnetosome-associated-protein

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Aufrufe.  Ben-Gurion University. Mama ist eine einzigartige Magnetosom assoziierten Protein, das nachweislich in Magnetosomen Aktivierung beteiligt sein sollte. Hier präsentieren wir die Aufreinigungsprotokolls von Mama Deletionsmutante (MamAΔ41) aus M. magneticum AMB-1.

Serie: Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

Automatisierte Hydrophobe Interaktions-Chromatographie Spaltenauswahl für den Einsatz in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;